הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

המטרה הכוללת של עבודה זו היא לפלוט את ההתפלגות הננומטרית של פוספטידילינוזיטול 4, 5-ביספוספט בקרום הפלזמה של התא באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה פלואורסצנטי של מולקולה בודדת. שיטה זו עוזרת לענות על שאלות מפתח לגבי איתות פוספואינוזיטיד. כגון מהו הארגון הננומטרי של פוספואינוזיטידים מתחת לקומפלקס האיתות בקרום התא?

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הרזולוציה המרחבית הגבוהה ועקיפת הטיפול בחומרי ניקוי המהווה דאגה מרכזית במחקרים מורפולוגיים של פוספוליפידים. גישה זו כוללת שלושה שלבים עיקריים. שלב ראשון: הכנת יריעת קרום הפלזמה מתאים חיים.

שלב שני: תיוג פוספואינוזיטיד והדמיית תפרחת של מולקולה בודדת. שלב שלישי: לוקליזציה של מולקולה בודדת ושחזור הדמיה. ביום הניסוי, כיסוי המעיל מחליק עם חצי עד מיליליטר אחד של PDL.

שעה או שעתיים לאחר מכן ספגו את עודפי ה-PDL עם נייר טישו מקצה החלקה של הכיסוי. לאחר מכן אחסן את החלקות הכיסוי על לוחית מתכת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו תאי INS-1 שהועברו מראש שגודלו על החלקות כיסוי עם חצי עד מיליליטר של PBS קר כקרח המכיל מילי-מולרית EGTA.

חזור על שטיפה זו שלוש פעמים וספוג את עודפי ה-PBS. כעת בעזרת פינצטה הנח את החלקות הכיסוי עם התאים המתורבתים על החלקות הכיסוי המצופות PDL, צד התא כלפי מטה. עשו זאת על צלחת המתכת המצוננת.

לאחר מכן העבירו את הצלחת לארבע מעלות צלזיוס למשך שבע עד עשר דקות כדי לתת לתאים זמן להתחבר. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי לקלף בעדינות את הכיסוי הטעון בתא, אשר ישאיר אחריו שכבה דקה של קרום התא על הכיסוי המצופה PDL. לאחר מכן שטפו בעדינות את יריעות הממברנה עם חצי עד מיליליטר PBS קר כקרח.

כעת תקן כל יריעת ממברנה בכ-150 מיקרוליטר של ארבעה אחוזי PFA קרים כקרח עם 0.2 אחוז גלוטרלדהיד ב-PBS. הניחו לממברנות לתקן במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע המשיכו מיד בהדמיה או כסו את התכשירים ב-PBS קר כקרח ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס.

אם נעשה שימוש בבדיקות pH, מומלץ מאוד להדמיה מיידית. לצורך הליך זה נעשה שימוש במערכת SMLM מבוססת מיקרוסקופ TIRF. לפני הדמיית הממברנות, יש לדלל מיקרוליטר אחד של תמיסת חרוזים פלואורסצנטית ב -10 מיליליטר PBS עם 50 מילימולר של מגנזיום כלוריד.

לאחר מכן טען דגימה לתא ההדמיה והוסף 200 מיקרוליטר מהתמיסה המדוללת ואז המתן 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את הדגימה עם PBS שלוש פעמים. כעת הפעל את מערכת ההדמיה PALM.

בתוכנת ההדמיה המשויכת, בחר בלחצן ערוץ iRFP. לאחר מכן מצא את קרום התא המבטא את בדיקות ה-pH בתעלת iRFP, השתמש בחרוזי הפלואורסצנט לתיקון סחיפה. הגדר זווית TIRF רגילה כ-2140 שהיא עמוקה ב-1.5 מהזווית הקריטית של TIRF וצריכה להיות זווית ברירת המחדל.

לאחר מכן השתמש בלחצן הלכידה כדי לאסוף תמונת TIRF קונבנציונלית בערוץ iRFP כהפניה. לאחר מכן, עבור לערוץ PAm-Cherry1 על ידי לחיצה על כפתור ערוץ RFP. לאחר מכן כוונן את פס הגלילה במשטח ה-AOTF עד הסוף ימינה להארה מלאה והחל את הלייזר למשך כ-10 עד 20 שניות כדי להלבין את תפרחת קרום הרקע.

לאחר מכן, הגדר את הגדרת המצלמה האופטימלית תחת לשונית הפורמט ל-2 על 2. לאחר מכן הגדר את פרוטוקול הרכישה המהירה תחת הכרטיסייה רכישת רצף ND ל-30,000 תמונות ב-20 הרץ. לאחר מכן הפעל הספק של 0.1 עד אחוז אחד על הלייזר של 405 ננומטר במהלך רכישת התמונה, כך שניתן יהיה לזהות בקלות נקודות מבודדות מרחבית בכל מסגרת.

כעת רכוש תמונות PAm-Cherry1 על ידי לחיצה על כפתור הפעל עכשיו. מספר המולקולות שניתן להפעיל יקטן בהדרגה במהלך הרכישות. בתגובה, הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר 405 ננומטר כדי לשמור על צפיפות אופטימלית של אותות.

רכוש תמונות עד שכל אות PAm-Cherry1 מופעל. מאוחר יותר, בעת עיבוד ושחזור תמונה, זהה ומקם את האירועים המולקולריים הבודדים מכל פריים. הגדר את סף עוצמת הסינון עם מספר הסף בגל.

פרטים נוספים ניתנים בפרוטוקול הטקסט. התפלגות מרחבית של PIP2 רגישה לקיבוע שונה עם קיבוע נכון המתואר בטקסט, בדיקות PIP2 הראו התפלגות עקבית כאשר הן מסומנות על ידי נוגדן PIP2 או תחומי pH ספציפיים. לשם השוואה, תאים חיים המסומנים בתחומי pH מתויגים EGFP אינם מצטלמים בצורה שונה בהרבה.

כל הדגימות הראו פיזור אחיד של בדיקות. לעומת זאת, קיבוע לא אופטימלי הביא לאשכולות PIP2 צפופים וחדים ולירידה בעוצמת האות. בתנאי קיבוע אופטימליים, תמונות רזולוציית העל של PIP2 בתאים קבועים חשפו התפלגות הומוגנית של בדיקות בחלק משמעותי של קרום הפלזמה עם שיפועי ריכוז מוגבלים בלבד.

חלק מכתמי הממברנה מועשרים בבדיקות PIP2 בפיזור דליל ובגדלים שונים. תמונות PALM של תאים חיים הציגו התפלגות מרחבית דומה לתאים קבועים. ניתוח מפורט של אותות PIP2 גילה שהדינמיקה שלהם הייתה מהירה באזורים מקומיים, אך זה לא הביא לשינויים משמעותיים בשפע הכללי שלהם.

טכניקה זו מציגה דרך חדשה לחוקרים בתחום הפוספוליפידים לחקור את התפוצה והפעילות של תת-סוגים אחרים של פוספואינוזיטידים בתנאים פיזיולוגיים.