RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID
30 בספטמבר 2016
אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד ביעילות RNA ספציפי יחד עם חלבונים הקשורים ל-RNA ב-in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במטבוליזם ובבקרת RNA, כגון מהו סט מובחן של RBPs הקשורים לטרנסקריפט מסוים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יעילות הבידוד הגבוהה, המאפשרת זיהוי המשכי של חלבונים חדשים הקשורים ל-mRNA.
המתודולוגיה המהירה משתמשת בזן שמרים המבטא במקביל MRNA המסומן ב-MS2 וחלבון היתוך של חלבון קושר MS2 וחלבון קושר streptavadin. גדלו 500 milliliters של תאי שמרים בטמפרטורה של 30 °C בתוספת dextrose סינתטי או במצע סלקטיבי SD עד ל-OD600 של 0.8 עד 1.0. כאשר התאים מוכנים, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 3000 ×g למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הנוזל העליון.
שטפו את התאים ב-PBS וסבבו שוב בצנטריפוגה. השליכו את הנוזל העליון ותלו את התאים מחדש בנפח שווה של SD ללא methionine. דגרו למשך 45 עד 60 דקות ב-30 °C כדי להשרות את ביטויו של חלבון היתוך.
לאחר 45 עד 60 דקות, הפר 10 milliliters של תאים לצורך מיצוי RNA והשתמש בתאים הנותרים לטיהור מהיר. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף לתאים 1.35 milliliters של 37% formaldehyde, לריכוז סופי של 0.1% כדי ליצור קשרי צלב (cross-link) לקומפלקסים של RNA-חלבון. המשך להדגיר בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 10 דקות.
כדי לעצור את הצלוב (cross-linking), הוסף 26.5 milliliters של גליצין 2.5 molar, לריכוז סופי של 0.125 molar, והדגר בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 3 דקות. מכאן ואילך, שמור את כל הרכיבים על קרח ועבוד במהירות כדי למזער את פירוק ה-RNA. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-3000 times G למשך 4 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius.
יש להסיר את הנוזל העליון, להוסיף 45 milliliters של PBS קר, ולצנטריפוגה שוב. הסרו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את התאים ב-5 milliliters של תמיסת ליזה מהירה (rapid lysis buffer) המכילה ריכוז גבוה של מעכבי Rnase. חלקו את תרחיף התאים למנות (aliquots) של 500 microliters באנבונות מיקרו-צנטריפוגה עם פקק הברגה, והוסיפו לכל מנה כ-400 milligrams של חרוזי זכוכית מקוררים.
בצע ליזיס לתאים באמצעות Bead-beater למשך שלוש דקות. העבר מיד את הליזאט לקרח. העבר את הליזאט למבחנות מיקרופוג חדשות.
חתכו את החלק העליון של מזרק של 5 milliliter והניחו אותו על מבחנה ריקה של 15 milliliter כדי שישמש כמתאם עבור מבחנות עם פקק הברגה. השתמשו במחט חמה כדי ליצור חור קטן בתחתית כל מבחנה והניחו אותן מעל מבחנות ה-15 milliliter המותאמות. סבבו את מכלולי המבחנות בצנטריפוגה ב-3000 times G למשך דקה אחת ב-4 degrees Celsius כדי להוליך את הליזאט למבחנות ה-15 milliliter.
העבירו את הנוזל שעבר (flowthrough) מכל מבחנה של 15 milliliter למבחנה חדשה של 1.5 milliliter וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius כדי להסיר את פסולת התאים. איספו את העלייה (supernatant) מכל מבחנות ה-1.5 milliliter למבחנה אחת של 15 milliliter. השאירו בצד נפח של 1/50 ו-1/100 מהליזאט לצורך בידוד RNA וחלבון, בהתאמה.
התחילו את הפרוצדורה המהירה לבידוד קומפלקסים של RNA וחלבון על ידי הוספת 300 micrograms של Avidin לליזאט התאים. דגרו למשך 30 דקות ב-4 degrees Celsius תחת גלגול קבוע. בזמן שליזאט התאים מדוגר עם Avidin, בצעו שטיפה מוקדמת של חרוזי ה-streptavidin, העבירו כ-300 microliters של תגליל חרוזי ה-streptavadin לשפופרת מיקרוצנטריפוגה ששקלה 1.5 milliliters, צנטריפוגו את התמיסה, ולאחר מכן הסירו את העליון (supernatant), מה שיניב 250 microliters של חרוזים.
הוסף 1 milliliter של בופר ליזיס מהיר (rapid lysis buffer) לחרוזים וסבב בצנטריפוגה ב-660 times G למשך 2 דקות ב-4 degrees Celsius. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף שוב עם בופר ליזיס מהיר. כדי לחסום את החרוזים, הוסף 0.5 milliliters של בופר ליזיס מהיר, 0.5 milliliters של BSA ו-10 microliters של yeast TRNA והדגר למשך שעה אחת ב-4 degrees Celsius בסיבוב רציף.
שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 milliliter של rapid lysis buffer. הוסיפו 250 microliters של חרוזי ה-streptavidin שנשטפו מראש אל ה-lysate המכיל avidin והדגרירו למשך שעה אחת ב-4 degrees Celsius בסיבוב קבוע. זמן הדגירה הזה מהווה פשרה בין מתן זמן קישור מספיק לבין מזעור הסיכויים לפירוק RNA.
לאחר שעה, סבב בנצ'יפוגה במהירות של 660 times G למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius כדי להפריד את חרוזי הסטרפטאווידין. העבר את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה של 15 milliliter. הפר 1/50 ו-1/100 מנפח הליזאט לצורך בידוד RNA וחלבון, בהתאמה.
הוסף 1 milliliter של באפר ליזיס מהיר (rapid lysis buffer) לחרוזים. ערבב באמצעות פיפטינג, העבר למבחנה חדשה של 1.5 milliliter עבור מיקרוצנטריפוגה וסבב בצנטריפוגה ב-660 ×g למשך 2 דקות ב-4 degrees Celsius. שטוף שלוש פעמים נוספות עם באפר ליזיס מהיר.
לאחר השטיפה האחרונה עם באפר ליזיס מהיר (rapid lysis buffer), הסירו את העלייה, הוסיפו 1 milliliter של באפר שטיפה מהיר (rapid wash buffer), וסובבו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. סבבו בצנטריפוגה ושטפו פעמיים נוספות עם באפר שטיפה מהיר. שטפו את החרו지를 עם 1 milliliter של PBS וסבבו בצנטריפוגה כפי שנעשה קודם לכן.
הסר את הנוזל העליון, הוסף לחרוזים 120 µL של PBS, וסובב במשך 5 דקות בגלגלת (roller). סבב בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן ואסוף את כל הנוזל העליון לצורך הפקת RNA וחלבונים כדגימת שטיפה. כדי לאלוט RNA וחלבונים הקשורים ל-RNA, הוסף לחרוזים 120 µL של ביוטין בריכוז 6 mM ב-PBS, והדגר במשך 45 דקות ב-4 °C תחת סיבוב רציף.
סובב את החרוזים בצנטריפוגה והעבר את החומר שנשטף לשפופרת 1.5 מיליליטר חדשה. סובב שוב את הדגימה שנשטפה והעבר את הפאזה העליונה לשפופרת 1.5 מיליליטר חדשה כדי להבטיח שלא יעברו חרוזים. קח דגימות להפקת RNA או חלבון.
כדי לקבוע את יעילות הבידוד ואיכות ה-RNA, בוצע ניתוח Northern עבור שני RNA מסומנים, PMP1 ו-FPR1, שהופקו מליזיס תאים בשיטת cast, ליזיס תאים מהיר, ולאחר אלוציה עם ביוטין. RNA ריבוזומלי גלה באמצעות צביעה ב-ethidium bromide, והיעדרו של RNA ריבוזומלי בדגימת האלוציה מעיד על רמת המחומרות של הטיהור.
המחמירות והספציפיות של הטיהור מודגמות עוד יותר על ידי היעדר אות של MRNA שאינו תגיתי בדגימות האלוציה. האות הנראה בנתיב של FPR1, שאינו בגודל של ACT1, הוא שארית מהיברידיזציה קודמת עם הגשוש MS2L. למרות שה-RNA בכניסה (input RNA) מדוכא באופן מסוים יותר בהשוואה ל-RNA שטוהר באמצעות פרוטוקול הפנול החם (Hot Phenol), כמות משמעותית של RNA תגיתי באורך מלא מבודדת באופן ספציפי, כפי שמעיד האות החזק בפרקציות האלוציה.
ניתן לנתח דגימות חלבון באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף לפני ניתוח פרוטאומיקה. חלבון היתוך MS2-CP-GFP-SBP, המסומן על ידי החץ, מעיד על טעינת חלבון שווה. הכוכביות מסמנות פסים בעצימויות שונות אשר נגזרו מאוחר יותר מהג'ל לצורך ניתוח בספקטרומטריית מסות.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להרכיב כפפות, להבטיח שטח עבודה נקי, להכין תמיסות באמצעות מים נקיים מ-RNA, ולעבוד במהירות וביעילות כדי לצמצם את זמן הפרוטוקול. זכרו שעבודה עם ריאגנטים כגון פנול ופורמאלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במנדף כימיים, במהלך ביצוע פרוצדורה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לטהר ביעילות ובאופן אפקטיבי RNA של fayn-tress והגוף הקשור אליו.
בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון RNA-Seq כדי לזהות RNA שנקשר לתעתוק המבוקש.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה in vivo לבידוד RNA ספציפי יחד עם החלבונים הקשורים אליו. טכניקה זו שואפת להעמיק את הבנתנו לגבי ויסות RNA בתוך תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אינטראקציות RNA-חלבון
- תהליכים תאיים
- מטבוליזם של RNA
רקע
- אינטראקציות בין RNA לחלבונים הן קריטיות לתפקודי תא שונים.
- הבנת אינטראקציות אלו יכולה לספק תובנות לגבי בקרה של RNA.
- ייתכן ששיטות קיימות חסרות יעילות בבידוד של קומפלקסים ספציפיים של RNA-חלבון.
- מחקר זה מציג גישה חדשנית המשתמשת בזני שמרים.
מטרת המחקר
- לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים הקשורים אליו in vivo.
- למענה על שאלות הנוגעות למטבוליזם של RNA ולבקרתו.
- לשיפור היעילות של טכניקות בידוד של RNA-חלבון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בזן שמרים המבטא שילוב של mRNA עם תג MS2.
- חלבון היתוך של חלבון קושר MS2 וחלבון קושר סטראפטידין.
- גידול של תאי שמרים במצע דקסטרוז סינתטי.
- צנטריפוגציה לבידוד קומפלקסים של RNA-חלבון.
תוצאות עיקריות
- הושגה יעילות גבוהה בבידוד של קומפלקסים של RNA-חלבון.
- התהליך סייע בזיהוי של חלבונים חדשים הקשורים ל-mRNA.
- השיטה מאפשרת עיבוד מהיר של דגימות.
- גישה זו סיפקה תובנות לגבי ויסות RNA.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי בעל ערך לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבונים.
- היא מעמיקה את הבנתנו לגבי מטבוליזם ובקרה של RNA.
- יישומים עתידיים עשויים להוביל לתגליות בתהליכים תאיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי חלבונים קושרים של RNA (RBPs) הקשורים לטרנסקריפטים ספציפיים הוא קריטי לתיקוף מטרות בטיפולים מבוססי RNA ולגילוי סמנים ביולוגיים. שיטת ה-RaPID מאפשרת בידוד יעיל in vivo של קומפלקסים של RNA וחלבון, ותומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת אינטראקציות פונקציונליות במערכת הרלוונטית למחלה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על קשרי RBP-mRNA.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי של RBPs הקשוריים ל-mRNAs רלוונטיים למחלה, כגון PMP1 הקשור ל-ER.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה הניתנת לשחזור לבידוד קומפלקסים טבעיים של RNA-חלבון משמרים, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות המאפיינות שיטות in vitro.
- ערך ניבוי: תומך בוודאות לגבי המטרה באמצעות לכידה ספציפית ובעלת יעילות גבוהה של אינטראקציות in vivo, ובכך מסייע במיון תיקי הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מערכות ביולוגיות מתוקפות (זני שמרים המבטאים RNA מתויג ב-MS2 וחלבון היתוך) עבור יישומי סריקה המשכיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד מורכב באמצעות pulldown של חרוזי streptavidin, ובכך משפר את ההדירות בין הניסויים.
- מוכנות הבדיקה: מייצר פראקציות מ purified RNA וחלבון המתאימות לניתוח כמותי באמצעות mass spectrometry או Northern blot.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין זיהוי RBP בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוחי המשך כגון RNA-Seq ו-SDS-PAGE.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מדגים קפדנות וספציפיות באמצעות היעדר אותות של RNA ריבוזומלי ו-mRNA לא מתויג בדגימות האלואציה.
- מערכת רלוונטית למחלה: ישימה למודלים של שמרים למטבוליזם של RNA, עם פוטנציאל להתאמה למערכות יונקיים לצורך תיקוף מטרות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטת RaPID משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בבדיקת השערות ובצמצום סיכונים ביולוגיים לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead identification) ותיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: מקלה על בדיקת היפותזות על ידי בידוד קומפלקסים ספציפיים של RNA-חלב מתנאי vivo, ובכך מבהירה קשרים תפקודיים.
- סריקה (Screening): מאפשרת פיתוח של בדיקות (assays) באמצעות בידוד סטנדרטי של קומפלקסים של RNA-חלב, התומך בסריקה שחזורית של תרכובות או גנים.
- אנליזה: מייצרת פלטים כמותיים באמצעות ספקטרומטריית מסות ואנליזת Northern blot, המאפשרת השוואה של שפע RBPs בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות פרה-קלינית על ידי אספקת קומפלקסים מבודדים לצורך תיקוף (validation) בהמשך במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה שניתן להשתמש בה שוב לגילוי RBPs על פני מספר תמלילים (transcripts), ובכך מפחיתה פיתוח כפול של שיטות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מעלה את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכנית בוויסות RNA.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה באמצעות שלבים מוגדרים של קישור צולב (crosslinking), ליזיס וטיהור מבוסס חרוזיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת נתונים מהימנים על אינטראקציות RBP-mRNA, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם לסיכון, בהתבסס על קשרי RBP מאושרים בהקשרים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה מולקולרית, תרביות שמרים וטכניקות של אינטראקציה בין RNA לחלבון.
- נדרש ציוד לקשירה צולבת (פורמלהיד), הפרדה מבוססת חרוזיים וסנטריפוגה במהירויות שונות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים להרכב תמיסות הליזה ולשימוש במעכבי RNase כדי להבטיח הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר משמרים למערכות מודל אחרות, במיוחד בנוגע לתיוג וביטוי חלבון היתוך.
- כולל מגבלות מעשיות כגון סיכון לפירוק RNA במהלך העיבוד והצורך בטיפול מהיר ובקר וקירור כדי לשמור על שלמות הקומפלקסים.
