Name: RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למד שיטת RAPID לבידוד RNA וחלבונים מקושרים בתאי שמרים חיים. טכניקה זו מאפשרת זיהוי יעיל של חלבונים הקושרים ל-RNA ספציפי ומסייעת בחקר מטבוליזם ורגולציה של RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים פרופ &#39;ג&#39;ף Gerst ובוריס Slobodin עבור העצות המועילות שלהם בהקמת הפרוטוקול המהיר ומתן פלסמידים הדרושים. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר אביגיל עתיר-לנדה על עזרתה בהקמת פרוטוקול זה וד&quot;ר תמר זיו ממרכז פרוטאומיקה סמולר על עזרתה עם ניתוח LC-MS / MS. אנו מודים פרופ TG Kinzy (Rutgers) עבור נוגדן YEF3. עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2011013 מהקרן הדו-לאומית למדע.

הערה: הכנס רצף המורכב 12 אתרים MS2 מחייב (MS2 לולאות; MS2L) לתוך מוקד גנומית הרצוי, בדרך כלל בין מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) ואת 3 &#39;UTR. פרוטוקול מפורט לצורך שילוב זה מסופק במקום אחר 22. אמת בנוגע להרכבה ביטוי הולם על ידי PCR, ניתוח הצפוני או RT-PCR 20,23. חשוב לוודא כי השילוב לא התערב עם הסינתזה של 3&#39;UTR. בנוסף, MS2-CP-לבטא פלסמיד התמזגו SBP תחת הביטוי של האמרגן מושרה (דלדול מתיונין) צריך גם להיות מוחדר לתאים 24. זן זהה, למעט לולאות MS12 הציגו, אמור לשמש כביקורת לצורך זיהוי של אותות שאינם ספציפיים. 1. טיהור מהירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 500 מ&quot;ל של תאי שמרים (השתמש 250-1,000 מ&quot;ל של תאי שמרים בהתאם לרמת הביטוי של הגן של עניין) המבטא mRNA מתויג MS2 20MS2-CP-GFP-SBP היתוך חלבון 24 עד OD 600 0.8 - 1.0 ב 30 o C במדיום הגידול המתאים (למשל, דקסטרוז סינתטי (SD) מצע סלקטיבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 4 דקות ב RT וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים בופר פוספט 1x (PBS), צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.2), resuspend בנפח שווה (שלב 1.1) של SD ללא מתיונין, דגירה במשך 45 - C 60 דקות ב 30 o להשרות ביטוי של MS2 -CP-GFP-SBP חלבון היתוך. הערה: זמן אינדוקציה ארוך עלול לגרום צבירה של GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 10 מ&quot;ל של תאים ולחלץ RNA ממדגם זה על פי השיטה פשוטה &quot;פנול חם&quot; 25. זהירות: פנול הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו. הערה: RNA זוהי התייחסות טובה איכות RNA הבודד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מ&quot;ל תאים, להוסיף 1.35 מ&quot;ל 37% פורמלדהיד ג הסופיoncentration של 0.1% ל crosslink מתחמי-חלבון RNA. המשך דגירה על 30 מעלות צלסיוס למשך 10 דקות. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 26.5 מ&quot;ל של 2.5 מ &#39;גליצין לריכוז סופי של 0.125 M דגירה במשך 3 דקות כדי לעצור crosslinking. משלב זה ואילך, לשים את הכל על קרח כדי למזער השפלה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 3000 XG במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלסיוס ולשטוף עם 45 מ&quot;ל קר 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 1 מ&quot;ל חיץ תמוגה מהירה לכל 100 מ&quot;ל של תרבית תאים ראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפצלה aliquots של 500 μl צינורות microfuge בורג הכתיר ולהוסיף ~ 400 מ&quot;ג של חרוזי זכוכית מקורר לכל aliquot (בערך צינור PCR מלא 0.2 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים חרוז מקצף במשך 3 דקות. מיד לשים את lysate על הקרח. הערה: משחרר תמוגה Cell RNases הסלולר, אשר הם הגורם העיקרי לפגיעה חמורה RNA. חיץ תמוגה מהירה מכיל ריכוז גבוה של RNase inhibitors, כגון הפרין המעכב RNase הספציפי ומעכבים ספציפיים. עבודה במהירות ושמירת הכל קר מומלץ גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate צינורות חדשים. פירס חור קטן בתחתית כל צינור microfuge במחט חמה (0.8 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ) והמקום צינורות microfuge על גבי 15 צינורות מ&quot;ל. השתמש ראש מזרק 5 מ&quot;ל כמו מתאם בין צינורות microfuge ו -15 מ&quot;ל צינורות. צנטריפוגה הרכבת הצינורות ב 3000 XG דקות 1 ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זרם דרך מהצינור 15 מ&quot;ל לצינור צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל חדש ב XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants בריכה מכל צינורות 1.5 מ&quot;ל לתוך צינור 15 מ&quot;ל יחיד, ומניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור RNA ובידוד חלבון, בהתאמה. הערה: אלה ישמשו את הדגימות &quot;קלט&quot; לניתוח שלאחר מכן (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 מיקרוגרם של avidin לכל 500 מ&quot;ל של iתרבית שמרי nitial דגירה למשך 30 דקות (זה יכול להיות מופחת עד 10 דק &#39;) בשעה 4 מעלות צלסיוס מתחת זמן התגלגל (10 סל&quot;ד). הערה: ביוטין בלוקים avidin וחלבונים biotinylated מלהיקשר החרוזים streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לשטוף את החרוזים streptavidin לפני הדגירה עם lysate התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ -300 μl של streptavidin חרוזים בלועה לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהסיר את supernatant העליון. זה יגרום 250 μl של חרוזים. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה. צנטריפוגה חרוזים streptavidin ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 o בין כל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את החרוזים על ידי דוגרים במשך שעה 1 עם 0.5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה, 0.5 מ&quot;ל של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA ו -10 μl של 10 מ&quot;ג / tRNA שמרים מ&quot;ל. חרוזים ניתן להשאיר O / N בחסימת פתרון ב 4 o C עם רוטציה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה. הערה: חרוזים מגנטיים גם יכול לשמש כדי להפחית את זמן background. יש אלה, עם זאת, קיבולת נמוכה יותר מאשר חרוזים sepharose. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חרוזים streptavidin מראש שטף אל lysate המכיל avidin (משלב 1.14) ו דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל&quot;ד). הערה: זמן דגירה זוהי פשרה בין מתן זמן מחייב מספיק ומזעור סיכויים שפל RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות את החרוזים streptavidin ולהעביר את supernatant לצינור 15 מ&quot;ל חדש. מניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור בידוד RNA וחלבון, בהתאמה. הערה: אלה יהיו הדגימות &quot;המאוגדות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה, לנער בעדינות, להעביר צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש, צנטריפוגות כמו בשלב 1.17. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של חיץ מהירה לשטוף, וסיבוב הפעם (10 סל&quot;ד) במשך 5 דקות ב 4 °. חזור על פעולה זו פעמיים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של PBS ו צנטריפוגות 1x כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים שוב עם 120 μl של 1x PBS. צנטריפוגה כנ&quot;ל, ולקחת את supernatant כולו עבור רנ&quot;א מיצוי חלבון כמו המדגם &quot;לשטוף&quot;. הערה: מדגם לשטוף אחרון זה יציין את ההחמרה של הכביסות וצריך להיות של אותו נפח כמו מדגם Elution. זה יפשט עיבוד וטעינה מבחני הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי elute רנ&quot;א וחלבונים הקשורים RNA מהעמודה, להוסיף 120 μl של ביוטין 6 מ&quot;מ 1x PBS ו דגירה במשך 45 דקות ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוז כנ&quot;ל ולהעביר את חומר eluted לצינור 1.5 מיליליטר חדש. ספין מדגם eluted שוב ולהעביר את השלב העליון לצינור 1.5 מיליליטר חדש על מנת להבטיח שום שריד של חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דגימות עבור RNA או מיצוי חלבון. הערה: הנפח נלקח להסתמך על נחות היסוד ברמת assay והביטוי הבאה של RNA או חלבון העניין. כקו מנחה, לניתוח הצפוני 26, לקחת 80% מהמדגם, עבור כתם המערבי 23,27 או RT-PCR 28, לקבל 20%, ועבור ספקטרומטריית מסה 29 לגלות חלבונים חדשים, לקחת את המדגם כולו. </li></ol> 2. RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של הצפת היפוך 2x Crosslinking דגירה במשך 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. המשך ישירות להפקת RNA. הערה: היפוך Crosslinking ההצפה מכיל חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), אשר משפרת באופן משמעותי מיצוי RNA 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פנול סטנדרטי: שיטת כלורופורם 26 לחלץ RNA מן &quot;הקלט&quot; דגימות &quot;מאוגדות&quot; (שלבי 1.13 ו 1.17). הערה: דגימות אלה מכילות כמות גדולה של הפרין המעכב RNase, אשר יכול לעכב Transcriptase- הפוך עוקבים (RT) מבחני ניצול (למשל, RT-PCR), ולכן, LiCl משקע 30 מומלצת להסיר אותו. את &quot;wash &quot;ו&quot; elution &quot;דגימות (שלבי 1.21 ו -1.24) מכילות כמויות נמוכות של רנ&quot;א הם זרזו באמצעות השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 8M guanidinium-HCl (GuHCl) ושני כרכים של אתנול 100% על &quot;לשטוף&quot; דגימות &quot;elution&quot;. דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 2. הערה: guanidinium יהיה לפגל חלבונים ביעילות ובכך לעכב RNases ו פרוטאזות במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וזורקים supernatant. שטוף את הכדור עם אתנול ו צנטריפוגות 80% קרים שוב ב -20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את גלולת רנ&quot;א 400 μl מים חינם RNase המשקע שוב כדי להסיר כל שאריות GuHCl או מזהמים אחרים. הוסף 40 μl של 3 M נתרן אצטט, pH 5.2 ו 800 μl של אתנול 100%, דגירה ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשטוף כמו בשלב 2.4 ולהסיר כל אתנול עם טיפ 10 μl. Resuspend את פל RNAet ב 10 מים חינם μl RNase. לטפל נוסף כמו גלולת RNA היא בדרך כלל לא נראה לעין. הערה: דוגמאות ניתן להשתמש לצורך ניתוח הצפוני כמתואר 23 (איור 1). </li></ol> 3. חלבון הכנה כתם המערבי או ניתוח ספקטרומטריית מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1/3 נפח של חיץ מדגם 4x Laemmli (LSB) כדי דגימות חלבון דגירה 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כדי להפוך את crosslinking של רנ&quot;א וחלבונים. הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים לרוץ על ג&#39;ל polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) 31. התאם את אחוז הג&#39;ל בהתאם לגודל של חלבונים להיות מנותח. הערה: 10% ג&#39;ל acrylamide נותן מגוון רחב של נפרד והוא טוב כמו קירוב ראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר חלבונים בקרום כמו בניתוח immunoblot תקן 27 על שליטה יעילה בידוד (התרשים 1C). כתם עם או Coomassie הכחול Rכתם 250 או כסף לפני ניתוח ספקטרומטריית מסה. הערה: כתם כסף הוא הבחירה המועדפת, כי זה יותר רגיש ומאפשר זיהוי טוב יותר (איור 1 ב). מכתים ניתן לעשות עם באופן ידני פתרונות מוכנים או ערכות מסחריות. זמן הדגירה של ג&#39;ל הפתרון לצבוע הסופי צריך להיקבע באופן ניסיוני. דגירה ארוכה עשויה לחשוף חלבונים נמוכים בשפע, אבל יכולה לגרום חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה כגון MS2-CP-SBP-GFP להיצבע שוב עלול להסוות חלבונים שמסביב בקרבתם. בנוסף, רקע גבוה עלול לגרום. בצע את התגובה בקפידה, ולהוסיף להפסיק פתרון בזמן המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור להקות מן הג&#39;ל ולהעבירם 1.5 מ&quot;ל צינורות. חנות דגימות ב -20 ° C, או לשלוח להפקת חלבונים העיכול טריפסין ואחריו LC-MS / MS ניתוח 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כגישה proteomic אלטרנטיבה שולל את הצעד ההפרדה ג&#39;ל, לעכל חומר eluted משלב 1.24 ב כךlution באמצעות טריפסין ובכפוף LC-MS / MS ניתוח 33. הערה: השמטת הפרדה SDS-PAGE מפשט את פרוטוקול ומגבירה התשואה. עם זאת, דגימות עשויות להכיל עקבות של חומר הניקוי NP-40, אשר מעכב ניתוח ספקטרומטריית מסה. כדי להתגבר על בעיה זו, בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חלבון על SDS-PAGE 31 במשך 10 - 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק כולו של השביל (כלומר, שבו חלבונים נמצאים). הערה: מדגם החלבון עשוי לכלול כמות משמעותית של חלבון MS2-CP-SBP שעשוי לטשטש אותות של חלבונים בשפע נמוכים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs%2C+suggesting+an+extensive+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255(2008).</li>
<li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li>
<li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+processing+and+its+regulation%3A+global+insights+into+biological+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li>
<li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203(2014).</li>
<li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li>
<li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li>
<li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+yeast+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li>
<li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li>
<li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Genomics%3A+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li>
<li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13(2014).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li>
<li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation+factor+eEF3+%28Yef3%29+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17(2015).</li>
<li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%27-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li>
<li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RaPID%3A+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li>
<li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRFbeta%2C+a+novel+regulator+of+calcium+signaling%2C+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li>
<li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells%3A+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li>
<li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%281D+SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25(2009).</li>
<li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li>
<li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StreptoTag%3A+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li>
<li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+steps+forward--one+step+back%3A+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li>
<li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li>
<li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li>
<li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14(2004).</li>
<li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR%2FCas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572(2015).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li>
<li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC+yeast%3A+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שיטות שונות להשתמש הבידוד של mRNAs ספציפי לזהות חלבונים הקשורים בהם 11,34 35. שיטות אלה חלות במבחנה אסטרטגיות vivo לחקור אינטראקציות RNA-חלבון. שיטות חוץ גופית דגירה עיבד אקסוגני RNA עם lysate התא כדי ללכוד RBPs ולבודד מתחמי RNP 36,37. גישה יעילה מסוג זה הוצגה לאחרונה, אשר אפשרה זיהוי של חלבונים חדשים אשר נקלטים מוטיב RNA רגולטוריים 18. חסרון של שיטות אלה הוא המחייב של RBPs הלא ספציפית כי העמותה מתרחשת...

חלבונים קושרי RNA (RBPs) מייצגים כ -10% של ס חלבוני cerevisiae 1,2 וכ -15% של חלבונים יונקים 3-5. הם מעורבים תהליכים תאיים רבים כגון mRNA שלאחר תעתיק עיבוד ורגולציה, תרגום, biogenesis הריבוזום, tRNA aminoacylation ושינוי, שיפוץ הכרומטין, ועוד. בפלח חשוב של RBPs הוא חלבונים קושרי mRNA (mRNPs) 6,7. במהלך ההבשלה mRNA, RBPs שונים לקשור את התמליל ואת לתווך עיבוד הגרעין שלה, לייצא מתוך הגרעין, לוקליזציה הסלולר, תרגום והשפלה 6-8. לפיכך, הקבוצה הנפרדת של RBPs כבול תעתיק מסוים בכל נקודת זמן קובעת העיבוד שלו, ובסופו של דבר את גורלה. זיהוי של RBPs קשור mRNA עשוי לשפר באופן משמעותי את הבנתנו התהליכים שבבסיס תקנה שלאחר התעתיק שלהם. מגוונים גנטיים, מיקרוסקופי, שימשו שיטות ביוכימיות ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המעורבים בוויסות mRNA (הנסקרת ב 9-11). עם זאת, רק כמה שיטות אלה מאפשרים זיהוי של חלבונים הקשורים עם mRNA יעד מסוים. מן ראוי לציין כי הוא המערכת ההיברידית שמרים שלוש (Y3H), אשר מנצלת את ה- mRNA של עניין כפיתיון כדי להקרין ספריית ביטוי בתאי שמרים. שיבוטים חיוביים בדרך כלל הם נצפו באמצעות ביטוי בחירה או כתב צמיחת 12-14. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא מספר רב של חלבונים כי ניתן לסרוק בסביבה הסלולר והיכולת למדוד את עוצמת האינטראקציה RNA-חלבון. חסרונות כוללים מספר הגדול יחסית של תוצאות חיוביות שגויות עקב מחייב הלא ספציפי, ואת הפוטנציאל הגבוה תוצאות שליליות שגויות נובעות, בין שאר, כדי misfolding של טרף חלבון היתוך או RNA הפיתיון. חלופה לגישה הגנטית purifi זיקהקטיון של RNA עם החלבונים הקשורים שלה. פולי A-המכיל mRNAs ניתן לבודד באמצעות השימוש בעמודים dT אוליגו, וחלבונים הקשורים בהם מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה. האינטראקציה RNA חלבון נשמרת בהקשר הסלולר שלה על ידי crosslinking, מה שהופך קשרים קוולנטיים קצר-טווח. השימוש בעמודה אוליגו dT מניב בראיה גלובלית של proteome כולו המשויך כל פולי A-המכיל mRNA 3,5,15. עם זאת, זה אינו מספק רשימה של חלבונים הקשורים עם mRNA מסוים. מעט מאוד שיטות זמינות להשיג הזדהות כזאת. שיטת הזוג כרוכה transfection של חומצות גרעין עם השלמה ליעד mRNA 16,17. חומצת גרעין גם מחוברת פפטיד, אשר מאפשר crosslinking כדי RBPs באזור קרוב לאתר אינטראקציה. לאחר crosslinking, חומצת RBP-פפטיד-גרעין ניתן לבודד נתון ניתוח פרוטאומיקה. לאחרונה, מתודולוגיה מבוססת aptamer הייתהבהצלחה להחיל שואבת מן שורות תאים יונקות 18. Aptamer RNA עם זיקה משופרת streptavidin פותח התמזג רצף של עניין (אלמנט עשיר AU (ARE) במקרה זה). Aptamer-ARE RNA צורף חרוזים streptavidin ו מעורבב עם lysate התא. חלבונים כי קשור ההשתלשלות אינה טוהרו וזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אמנם שיטה זו זוהתה עמותות המתרחשות מחוץ הגדרות הסלולר (כלומר, במבחנה), היא עשויה להיות שונה בעתיד כדי להציג את aptamers לתוך הגנום ובכך לאפשר את הבידוד של חלבונים הקשורים mRNA בעוד המילייה הסלולר (כלומר, in vivo). בשמרים, שבו מניפולציות גנטיות מבוססות היטב, את השיטה המהירה (שפותחה במעבדתו של פרופ &#39;ג&#39;ף Gerst) מספקת תצוגה של עמותות vivo ב -19. מהירה משלב הכריכה ספציפי וחזק של חלבון מעיל MS2 (MS2-CP) אל רצף הרנ&quot;א MS2, ושל תחום מחייב streptavidin (SBP) streptavidin בשילוב חרוזים מצומדות. זה מאפשר טיהור יעילה של mRNAs מתויג MS2 באמצעות חרוזי streptavidin. יתר על כן, הביטוי של 12 עותקים של MS2 לולאות מאפשר עד שישה MS2-CPS להיקשר בו זמנית אל RNA ולהגדיל את יעילות הבידוד שלה. פרוטוקול זה ולכן הוצע לאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים mRNA הרומן פעם דגימות eluted חשופים ניתוח proteomics ידי ספקטרומטריית מסה. אנחנו לאחרונה מנוצלים מהירים לזהות חלבונים חדשים קשורים שמרים PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA הוצגה בעבר יקושר עם קרום ER וסביבתה 3 &#39;המתורגמת (UTR) נמצאה להיות קובע עיקרי בשיתוף זה 21. לפיכך, RBPs אשר נקלט PMP1 3 &#39;UTR צפוי לשחק תפקיד חשוב הלוקליזציה שלה. מהיר ובעקבותיו כרומטוגרף נוזליy-המוני ספקטרומטריית / ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) גרמה לזיהויו של חלבונים חדשים רבים כי אינטראקציה עם PMP1 20. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של המתודולוגיה המהירה, שולטים חשוב שצריכים להיעשות, וטיפים טכניים שעלולות לשפר את התשואה וספציפית.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>פנול חומצי (pH 4.3)</td> <td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>פנול חומצי: כלורופורם (5:1, pH 4.3)</td> <td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>ביו-מעבדה</td><td>כלורופורם</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>פרוטרום</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>קלביוכימיה</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>פניל מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td> <td>סיגמא</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>סיגמא</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>סיגמא</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין</td><td>סיגמא</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>ריבונוקלאז&nbsp; מעכב</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>קוטר 0.4-0.6 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>מיני חרוזיםBeater</td><td>BioSpec</td><td>מיני חרוזיםBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>גואנידיניום</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סטרפטווידין</td><td>GE בריאות&nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>שמרים tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח עם בופר פוספט (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% גליצרול, 0.04% ברומופנול-כחול.</td></tr><tr>מאגר <td></td><td></td><td>ליזה פנול חם</td><td>10 מ"מ Tris pH 7.5, 10 מ"מ EDTA, 0.5% SDS&nbsp;</td></tr><tr><td>3 מ' נתרן אצטט pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% ו-70% אתנול (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase, מאגר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ליזה RaPID</td><td>20 מ"מ Tris pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 1.8 מ"מ MgCl<תת>2, 0.5% NP-40, 5 מ"ג/מ"ל הפרין, 1 מ"מ דיתיותרייטול (DTT), 1 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF), 10 ומיקרו; גרם/מ"ל לאופפטין, 10 ומיקרו; גרם/מ"ל אפרוטינין, 10 ומיקרו; גרם/מ"ל מעכב טריפסין פולי סויה, 10 ומיקרו; גרם/מ"ל פפסטין, 20 יח'/מ"ל DNase I, 100 יח'/מ"ל ריבונוקלאז&nbsp; מעכב.</td></tr><tr><td>2x מאגר</td><td></td><td></td> היפוך צולב <td>100 מ"מ Tris pH 7.4, 10 מ"מ EDTA, 20 מ"מ DTT, 2% SDS.</td></tr><tr>מאגר <td></td><td></td><td>כביסה RaPID</td><td>20 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, &nbsp; 300 מ"מ NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 מ' EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת כתם כסף פלוס</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0449</td><td>לאיתור חלבונים בג'ל פוליאקרילאמיד</td></tr><tr><td>מדיום סלקטיבי SD&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7 גרם/ליטר בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו ואמוניום גופרתי, 5 גרם/ליטר אמוניום גופרתי, 2% גלוקוז, 350 מ"ג/ליטר תראונין, 40 מ"ג/ליטר מתיונין, 40 מ"ג/ליטר אדנין, 50 מ"ג/ליטר ליזין, 50 מ"ג/ליטר טריפטופן, 20 מ"ג/ליטר היסטידין, 80 מ"ג/ליטר לאוצין, 30 מ"ג/ליטר טירוזין, 40 מ"ג/ליטר ארגינין</td></tr><tr><td>אנטי-eEF3 (EF3A, YEF3)</td> <td>מתנה מ- Kinzy TG. (בית הספר לרפואה רוברט ווד ג'ונסון UMDNJ)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG-HRP מצומד</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

rna מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת rapid

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

חלבונים קושרי RNA (RBPs) ממלאים תפקידים חשובים בכל היבט של חילוף החומרים והוויסות של RNA. זיהוים הוא אתגר מרכזי בביולוגיה המודרנית. רק כמה שיטות in vitro ו-in vivo מאפשרות זיהוי של RBPs הקשורים ל-mRNA מטרה מסוים. עם זאת, המגבלות העיקריות שלהם הן זיהוי RBPs בסביבה לא תאית (במבחנה) או בידוד ביעילות נמוכה של RNA מעניין (in vivo). מתודולוגיית טיהור וזיהוי חלבונים קושרי RNA (RaPID) תוכננה להתגבר על מגבלות אלה בשמרים ולאפשר בידוד יעיל של חלבונים הקשורים in vivo. כדי להשיג זאת, ה-RNA המעניין מתויג עם לולאות MS2, ומתבטא במשותף עם חלבון היתוך של חלבון קושר MS2 וחלבון קושר סטרפטווידין (SBP). לאחר מכן התאים נתונים לקישור צולב וליזה, וקומפלקסים מבודדים באמצעות חרוזי סטרפטווידין. לאחר מכן ניתן לקבוע את החלבונים שמטהרים יחד עם ה-RNA המתויג על ידי ספקטרומטריית מסה. לאחרונה השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לזהות חלבונים חדשים הקשורים ל-PMP1 mRNA הקשור ל-ER. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של RaPID, ודנים בכמה מהמגבלות והיתרונות שלו.

מהיר מאפשר הבידוד של רנ&quot;א יעד ספציפי עם החלבונים הקשורים שלה. ההצלחה קריטית שלה הוא שמירה על רנ&quot;א ללא פגע ככל האפשר, ועל ידי כך הושגה כמות של חלבונים מספיק. כדי לקבוע את יעילות הבידוד ואיכות RNA, ניתוח צפון מתבצע (איור 1 א). יש ניתוח צפון היתרון של ישירות דיווח יעיל והאיכות של ראפיד. לפיכך, את הסכומים היחסיים של מוצרים אורכים והשפלה מלאים ניתן לקבוע בטווח אחת. RNAs ריבוזומלי (rRNAs) מזוהים בקלות מכתים ברומיד ethidium, וחו...

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד ביעילות RNA ספציפי יחד עם חלבונים הקשורים ל-RNA ב-in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במטבוליזם ובבקרת RNA, כגון מהו סט מובחן של RBPs הקשורים לטרנסקריפט מסוים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יעילות הבידוד הגבוהה, המאפשרת זיהוי המשכי של חלבונים חדשים הקשורים ל-mRNA.המתודולוגיה המהירה משתמשת בזן שמרים המבטא במקביל MRNA המסומן ב-MS2 וחלבון היתוך של חלבון קושר MS2 וחלבון קושר streptavadin. גדלו 500 milliliters של תאי שמרים בטמפרטורה של 30 °C בתוספת dextrose סינתטי או במצע סלקטיבי SD עד ל-OD600 של 0.8 עד 1.0. כאשר התאים מוכנים, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 3000 ×g למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הנוזל העליון.שטפו את התאים ב-PBS וסבבו שוב בצנטריפוגה. השליכו את הנוזל העליון ותלו את התאים מחדש בנפח שווה של SD ללא methionine. דגרו למשך 45 עד 60 דקות ב-30 °C כדי להשרות את ביטויו של חלבון היתוך.לאחר 45 עד 60 דקות, הפר 10 milliliters של תאים לצורך מיצוי RNA והשתמש בתאים הנותרים לטיהור מהיר. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף לתאים 1.35 milliliters של 37% formaldehyde, לריכוז סופי של 0.1% כדי ליצור קשרי צלב (cross-link) לקומפלקסים של RNA-חלבון. המשך להדגיר בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 10 דקות.כדי לעצור את הצלוב (cross-linking), הוסף 26.5 milliliters של גליצין 2.5 molar, לריכוז סופי של 0.125 molar, והדגר בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 3 דקות. מכאן ואילך, שמור את כל הרכיבים על קרח ועבוד במהירות כדי למזער את פירוק ה-RNA. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-3000 times G למשך 4 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius.יש להסיר את הנוזל העליון, להוסיף 45 milliliters של PBS קר, ולצנטריפוגה שוב. הסרו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את התאים ב-5 milliliters של תמיסת ליזה מהירה (rapid lysis buffer) המכילה ריכוז גבוה של מעכבי Rnase. חלקו את תרחיף התאים למנות (aliquots) של 500 microliters באנבונות מיקרו-צנטריפוגה עם פקק הברגה, והוסיפו לכל מנה כ-400 milligrams של חרוזי זכוכית מקוררים.בצע ליזיס לתאים באמצעות Bead-beater למשך שלוש דקות. העבר מיד את הליזאט לקרח. העבר את הליזאט למבחנות מיקרופוג חדשות.חתכו את החלק העליון של מזרק של 5 milliliter והניחו אותו על מבחנה ריקה של 15 milliliter כדי שישמש כמתאם עבור מבחנות עם פקק הברגה. השתמשו במחט חמה כדי ליצור חור קטן בתחתית כל מבחנה והניחו אותן מעל מבחנות ה-15 milliliter המותאמות. סבבו את מכלולי המבחנות בצנטריפוגה ב-3000 times G למשך דקה אחת ב-4 degrees Celsius כדי להוליך את הליזאט למבחנות ה-15 milliliter.העבירו את הנוזל שעבר (flowthrough) מכל מבחנה של 15 milliliter למבחנה חדשה של 1.5 milliliter וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius כדי להסיר את פסולת התאים. איספו את העלייה (supernatant) מכל מבחנות ה-1.5 milliliter למבחנה אחת של 15 milliliter. השאירו בצד נפח של 1/50 ו-1/100 מהליזאט לצורך בידוד RNA וחלבון, בהתאמה.התחילו את הפרוצדורה המהירה לבידוד קומפלקסים של RNA וחלבון על ידי הוספת 300 micrograms של Avidin לליזאט התאים. דגרו למשך 30 דקות ב-4 degrees Celsius תחת גלגול קבוע. בזמן שליזאט התאים מדוגר עם Avidin, בצעו שטיפה מוקדמת של חרוזי ה-streptavidin, העבירו כ-300 microliters של תגליל חרוזי ה-streptavadin לשפופרת מיקרוצנטריפוגה ששקלה 1.5 milliliters, צנטריפוגו את התמיסה, ולאחר מכן הסירו את העליון (supernatant), מה שיניב 250 microliters של חרוזים.הוסף 1 milliliter של בופר ליזיס מהיר (rapid lysis buffer) לחרוזים וסבב בצנטריפוגה ב-660 times G למשך 2 דקות ב-4 degrees Celsius. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף שוב עם בופר ליזיס מהיר. כדי לחסום את החרוזים, הוסף 0.5 milliliters של בופר ליזיס מהיר, 0.5 milliliters של BSA ו-10 microliters של yeast TRNA והדגר למשך שעה אחת ב-4 degrees Celsius בסיבוב רציף.שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 milliliter של rapid lysis buffer. הוסיפו 250 microliters של חרוזי ה-streptavidin שנשטפו מראש אל ה-lysate המכיל avidin והדגרירו למשך שעה אחת ב-4 degrees Celsius בסיבוב קבוע. זמן הדגירה הזה מהווה פשרה בין מתן זמן קישור מספיק לבין מזעור הסיכויים לפירוק RNA.לאחר שעה, סבב בנצ'יפוגה במהירות של 660 times G למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius כדי להפריד את חרוזי הסטרפטאווידין. העבר את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה של 15 milliliter. הפר 1/50 ו-1/100 מנפח הליזאט לצורך בידוד RNA וחלבון, בהתאמה.הוסף 1 milliliter של באפר ליזיס מהיר (rapid lysis buffer) לחרוזים. ערבב באמצעות פיפטינג, העבר למבחנה חדשה של 1.5 milliliter עבור מיקרוצנטריפוגה וסבב בצנטריפוגה ב-660 ×g למשך 2 דקות ב-4 degrees Celsius. שטוף שלוש פעמים נוספות עם באפר ליזיס מהיר.לאחר השטיפה האחרונה עם באפר ליזיס מהיר (rapid lysis buffer), הסירו את העלייה, הוסיפו 1 milliliter של באפר שטיפה מהיר (rapid wash buffer), וסובבו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. סבבו בצנטריפוגה ושטפו פעמיים נוספות עם באפר שטיפה מהיר. שטפו את החרו지를 עם 1 milliliter של PBS וסבבו בצנטריפוגה כפי שנעשה קודם לכן.הסר את הנוזל העליון, הוסף לחרוזים 120 µL של PBS, וסובב במשך 5 דקות בגלגלת (roller). סבב בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן ואסוף את כל הנוזל העליון לצורך הפקת RNA וחלבונים כדגימת שטיפה. כדי לאלוט RNA וחלבונים הקשורים ל-RNA, הוסף לחרוזים 120 µL של ביוטין בריכוז 6 mM ב-PBS, והדגר במשך 45 דקות ב-4 °C תחת סיבוב רציף.סובב את החרוזים בצנטריפוגה והעבר את החומר שנשטף לשפופרת 1.5 מיליליטר חדשה. סובב שוב את הדגימה שנשטפה והעבר את הפאזה העליונה לשפופרת 1.5 מיליליטר חדשה כדי להבטיח שלא יעברו חרוזים. קח דגימות להפקת RNA או חלבון.כדי לקבוע את יעילות הבידוד ואיכות ה-RNA, בוצע ניתוח Northern עבור שני RNA מסומנים, PMP1 ו-FPR1, שהופקו מליזיס תאים בשיטת cast, ליזיס תאים מהיר, ולאחר אלוציה עם ביוטין. RNA ריבוזומלי גלה באמצעות צביעה ב-ethidium bromide, והיעדרו של RNA ריבוזומלי בדגימת האלוציה מעיד על רמת המחומרות של הטיהור.המחמירות והספציפיות של הטיהור מודגמות עוד יותר על ידי היעדר אות של MRNA שאינו תגיתי בדגימות האלוציה. האות הנראה בנתיב של FPR1, שאינו בגודל של ACT1, הוא שארית מהיברידיזציה קודמת עם הגשוש MS2L. למרות שה-RNA בכניסה (input RNA) מדוכא באופן מסוים יותר בהשוואה ל-RNA שטוהר באמצעות פרוטוקול הפנול החם (Hot Phenol), כמות משמעותית של RNA תגיתי באורך מלא מבודדת באופן ספציפי, כפי שמעיד האות החזק בפרקציות האלוציה.ניתן לנתח דגימות חלבון באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף לפני ניתוח פרוטאומיקה. חלבון היתוך MS2-CP-GFP-SBP, המסומן על ידי החץ, מעיד על טעינת חלבון שווה. הכוכביות מסמנות פסים בעצימויות שונות אשר נגזרו מאוחר יותר מהג'ל לצורך ניתוח בספקטרומטריית מסות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להרכיב כפפות, להבטיח שטח עבודה נקי, להכין תמיסות באמצעות מים נקיים מ-RNA, ולעבוד במהירות וביעילות כדי לצמצם את זמן הפרוטוקול. זכרו שעבודה עם ריאגנטים כגון פנול ופורמאלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במנדף כימיים, במהלך ביצוע פרוצדורה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לטהר ביעילות ובאופן אפקטיבי RNA של fayn-tress והגוף הקשור אליו.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון RNA-Seq כדי לזהות RNA שנקשר לתעתוק המבוקש.

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

בסרטון זה, אנו מתארים את האבולוציה השיטתית של ליגנדות בשיטת העשרה מעריכית (SELEX) כדי לזהות רצפים ספציפיים קושרי RNA עבור חלבון מטרה מעניין. החלבון מודגר עם מאגר גדול של רצפי RNA אקראיים, ורצפי הרנ"א קושרי החלבון מבודדים, מוגברים ב-PCR ומרוצפים כדי לזהות את אתרי קשירת החלבונים שלהם.

בדיקת קשירת מבחנה מבוססת SELEX לזיהוי אינטראקציות RNA-חלבון

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

הספציפיות לרצף היא קריטית. לתקנות הגנים חלבונים רגולטוריות המכירים רצפים ספציפיים חשובים עבור רגולציה גנטית. הגדרת אתרי קשירה פונקציונליים עבור חלבונים כאלה היא בעיה ביולוגית מאתגרת. גישה איטראטיבית לזיהוי של אתר מחייב עבור חלבון של איגוד RNA מתוארת כאן וישימה לכל החלבונים מבוססי RNA.

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

למד שיטת RAPID לבידוד RNA וחלבונים מקושרים בתאי שמרים חיים. טכניקה זו מאפשרת זיהוי יעיל של חלבונים הקושרים ל-RNA ספציפי ומסייעת בחקר מטבוליזם ורגולציה של RNA.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

גלה סרטונים נוספים