RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ביעילות RNA ספציפי עם חלבונים הקשורים ל-RNA in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במטבוליזם ובוויסות RNA, כגון מהי קבוצה מובחנת של פיפי דבורים הקשורים לתעתיק מסוים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יעילות הבידוד הגבוהה, המאפשרת זיהוי מעקב של חלבונים הקשורים ל- mRNA אצילים.

המתודולוגיה המהירה משתמשת בזן שמרים המבטא במשותף MRNA מתויג MS2 וחלבון היתוך של חלבון קושר MS2 וחלבון קושר סטרפטוודין. גדל 500 מיליליטר של תאי שמרים ב-30 מעלות צלזיוס בדקסטרוז סינטטי או מדיום סלקטיבי SD ל-OD600 של 0.8 עד 1.0. כאשר התאים מוכנים, צנטריפוגה ב -3000 פעמים G למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט.

שוטפים שוב את התאים ב- PBS ובצנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בנפח שווה של SD ללא מתיונין. דגירה למשך 45 עד 60 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי לגרום לביטוי של חלבון ההיתוך.

לאחר 45 עד 60 דקות, הניחו בצד 10 מיליליטר מהתאים למיצוי RNA והשתמשו בתאים הנותרים לטיהור מהיר. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף לתאים 1.35 מיליליטר של 37% פורמלדהיד, לריכוז סופי של 0.1% כדי לקשר בין מתחמי חלבון RNA. המשיכו לדגור בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

כדי להפסיק את הקישור הצולב, יש להוסיף 26.5 מיליליטר של 2.5 גליצין מולארי, לריכוז סופי של 0.125 טוחנת, ולדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. מכאן והלאה, שמור הכל על הקרח ועבוד במהירות כדי למזער את פירוק ה-RNA. צנטריפוגה של התאים ב -3000 פעמים G למשך 4 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 45 מיליליטר PBS קר ושוב צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-5 מיליליטר של מאגר ליזה מהיר המכיל ריכוז גבוה של מעכבי רנאז. חלקו את תרחיף התא לכמות של 500 מיקרוליטר בצינורות מיקרופוגה עם מכסה בורג והוסיפו כ-400 מיליגרם של חרוזי זכוכית צוננים לכל אליקוט.

לייז את התאים במקצף חרוזים למשך שלוש דקות. הניחו מיד את הליזאט על קרח. העבירו את הליזאט לצינורות מיקרופוגה חדשים.

חותכים את החלק העליון של מזרק של 5 מיליליטר ומניחים אותו על צינור ריק של 15 מיליליטר כדי לשמש כמתאם לצינורות מכסה הברגה. השתמש במחט חמה כדי לנקב חור קטן בתחתית כל צינור ולהניח אותם על גבי צינורות 15 מיליליטר המותאמים. צנטריפוגה של מכלולי האמבטיה ב-3000 פעמים G למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי להוציא את הליזאט לצינורות של 15 מיליליטר.

העבירו את הזרימה מכל צינור של 15 מיליליטר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב-10,000 פעמים G למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לפנות את פסולת התא. אסוף את הסופרנטנט מכל צינורות ה-1.5 מיליליטר לצינור יחיד של 15 מיליליטר. הניחו בצד נפח 1/50 ו-1/100 של הליזאט לבידוד RNA וחלבון בהתאמה.

התחל את ההליך המהיר לבידוד קומפלקסים של חלבון RNA על ידי הוספת 300 מיקרוגרם של Avidin לליזט התא. דוגרים למשך 30 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס תחת גלגול מתמיד. בזמן שליזאט התא מודגר עם אבידין, שטפו מראש את חרוזי הסטרפטווידין, העבירו כ-300 מיקרוליטר מתמיסת חרוזי הסטרפטוואדין למשקל של 1.5 מיליליטר צינור מיקרו-צנטריוג, צנטריפוגה את התכשיר ולאחר מכן הסירו את הסופרנטנט העליון שיביא ל-250 מיקרוליטר חרוזים.

הוסף 1 מיליליטר של מאגר ליזה מהיר לחרוזים ולצנטריפוגה ב 660 פעמים G למשך 2 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט ושטוף שוב עם מאגר ליזה מהיר. כדי לחסום את החרוזים, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר ליזה מהיר, 0.5 מיליליטר BSA ו -10 מיקרוליטר TRNA שמרים ודגירה למשך שעה ב -4 מעלות צלזיוס עם סיבוב קבוע.

שוטפים את החרוזים פעמיים עם 1 מיליליטר של מאגר ליזה מהיר. הוסף 250 מיקרוליטר של חרוזי הסטרפטווידין השטופים מראש לאבידין המכיל ליזאט ודגירה למשך שעה בחום של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב מתמיד. זמן הדגירה הזה הוא פשרה בין מתן זמן קשירה מספיק לבין מזעור הסיכוי לפירוק RNA.

לאחר שעה, צנטריפוגה ב 660 פעמים G למשך 2 דקות ב -4 מעלות צלזיוס כדי לנקות את חרוזי הסטרפטווידין. העבירו את הסופרנטנט לצינור של 15 מיליליטר. הניחו בצד נפח 1/50 ו-1/100 של הליזאט לבידוד RNA וחלבון בהתאמה.

הוסף 1 מיליליטר של מאגר ליזה מהיר לחרוזים. מערבבים על ידי פיפטינג, מעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב 660 פעמים G למשך 2 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. שטפו שלוש פעמים נוספות עם מאגר ליזה מהיר.

לאחר הכביסה הסופית עם מאגר ליזה מהיר, הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מיליליטר של מאגר כביסה מהיר וסובב למשך 5 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ושטיפה פעמיים נוספות עם מאגר כביסה מהיר. שוטפים את החרוזים עם 1 מיליליטר PBS וצנטריפוגה כמו קודם.

הסר את הסופרנטנט, הוסף לחרוזים 120 מיקרוליטר PBS וסובב במשך 5 דקות ברולר. צנטריפוגה כמו קודם ואוספים את כל הסופרנטנט למיצוי RNA וחלבון כדגימת הכביסה. כדי לסלק RNA וחלבונים הקשורים ל-RNA, הוסף לחרוזים 120 מיקרוליטר של ביוטין 6 מילי-מולרי ב-PBS, ודגירה למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב קבוע.

צנטריפוגה של החרוזים והעברת החומר החמקמק לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. סובב שוב את הדגימה המנופחת והעביר את השלב העליון לצינור חדש של 1.5 מיליליטר כדי להבטיח שלא תהיה העברת חרוזים. קח דגימות למיצוי RNA או חלבון.

כדי לקבוע את יעילות הבידוד והאיכות של RNA, בוצע ניתוח צפוני עבור שני RNA מתויגים. PMP1 ו-FPR1, מליזיס תאים יצוקים, ליזיס תאים מהיר ולאחר פליטה עם ביוטין. RNA ריבוזומלי זוהה על ידי צביעת אתידיום ברומיד, והיעדר RNA ריבוזומלי בדגימת הפליטה מעיד על חומרת הטיהור.

הקפדנות והספציפיות של הטיהור מודגמות עוד יותר על ידי היעדר אות של MRNA לא מתויג בדגימות הפליטה. האות לכאורה בנתיב FPR1, שאינו בגודל של ACT1, הוא שאריות מהכלאה קודמת עם הגשושית MS2L. למרות שה-RNA הקלט מעט יותר מושפל בהשוואה ל-RNA שטוהר על ידי פרוטוקול Hot Phenol, כמות משמעותית של RNA מתויג באורך מלא מבודדת באופן ספציפי, כפי שמתגלה על ידי האות החזק בשברי הפליטה.

ניתן לנתח דגימות חלבון על ידי SDS-PAGE וצביעה בכסף לפני ניתוח פרוטאומיקה. חלבון ההיתוך MS2-CP-GFP-SBP, המצוין על ידי החץ, מדגים עומס חלבון שווה. הכוכביות מצביעות על רצועות עם עוצמות דיפרנציאליות שנחתכו מאוחר יותר מהג'ל לניתוח ספקטרומטריית מסה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב ללבוש כפפות, להבטיח אזור עבודה נקי, להכין תמיסה עם מים ללא RNA ולעבוד במהירות וביעילות כדי להפחית את זמן הפרוטוקול. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים כמו פנול ופורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה מנוע כימי בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לטהר ביעילות וביעילות RNA של fayn-tress והגוף הקשור אליו.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו RNA-Seq על מנת לזהות RNAs הקושרים את התעתיק המעניין.