"Assay סגירת Phagosome" לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)
26 באוגוסט 2016
אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים ויזואלית את היווצרות הפגוזום, כמו גם את האתר המדויק של התבקעות הפגוזום ב-3D, במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופיית TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). שיטה זו משלבת מיקרוסקופיית TIRF עם אפיפלוורסנציה כדי לנטר את הלוקליזציה השלבית של שני חלבונים פלואורסצנטיים שונים במהלך התארכות הפסאודופודיה והיתוך הקצה. הטכניקה מספקת שיטה שיטתית לקביעת הזווית הקריטית ולהשגת אות TIRF, דבר שהוא חיוני להסקת מסקנות לגבי קרבה לממברנת הפלזמה.
יום לפני הסשן במיקרוסקופ ה-TIRF, הפעילו את תא החימום ל-37 °C כדי לאפשר חימום הומוגני של במת המיקרוסקופ. למחרת בבוקר, השתמשו ב-100 µL של PBS, המועשר ב-0.1% BSA, כדי לשטוף 7x10⁶ תאי דם אדומים של כבש (SRBCs) לכל צלחית עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר, פעמיים. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעיקו את התאים ב-500 µL של rabbit IGG anti-SRBCs, בריכוז תת-אגלוטינציוני, ב-PBS המועשר ב-0.1% BSA לכל 5 µL של תאים, ודגרו את התאים למשך 30 דקות תוך סיבוב איטי.
בסיום האינקובציה, שטפו את ה-SRBCs פעמיים ב-PBS פלוס BSA, ותלהו מחדש את התאים ב-2 מיליליטר של תוציר מיקרוסקופיה נטול סרום בטמפרטורה של 37-degree Celsius לכל צלחת. לאחר מכן, טפלו בצלחות עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר באמצעות 2 מיליליטר של 0.1% poly-L lysine למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריהם שני שטיפות עם 2 מיליליטר של PBS. לצורך קיבוע לא-קוולנטי של ה-SRBCs, שפכו 2 מיליליטר של התאים שעברו אופסוניזציה ב-IGG לכל אחת מהצלחות המצופות ב-polylysine, וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה עם רוטור מתנדנד.
יש להשליך את העל-נוזלים ולשטוף את החלקיקים פעם אחת עם 2 milliliters של PBS בתוספת 10%BSA. לאחר מכן, יש לדגור את החלקיקים עם 2 milliliters של PBS טרי בתוספת 10%BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לבצע שלושה שטיפות עם 2 milliliters של PBS. לאחר השטיפה האחרונה, יש להחליף את ה-PBS ב-2 milliliters של מצע מיקרוסקופיה נטול סרום בטמפרטורה של 37-degree Celsius.
הנח צלחת מצופה ב-SRBC על במה של המיקרוסקופ. לאחר מכן, גרד את התאים שעברו טרנספקציה ממעמקי צלחת התרבית, והעבר אותם באמצעות פיפט מספר פעמים כדי להשיג תרחיף של תאים בודדים. הוסף את התאים שעברו טרנספקציה לצלחת המצופה ב-SRBC.
הפעילו את תוכנת הרכישה בזמן אמת. מצאו תא המבטא את החלבונים המסומנים פלואורסצנטית, והתאימו את מיקום הצלחת כך שתא בעל עניין יהיה במרכז השדה. רכשו 500 תמונות בזוויות שונות מאפס עד 5% במרווחים של 0.01 מעלות, באורך גל עירור אחד.
כדי לקבוע את הזווית הקריטית עבור האור הפוגע כדי שיוחזר באופן מלא בממשק זכוכית-תווך, וליצור גל נעלם (evanescent wave), פתחו את רצף התמונות בתוכנת הדימות המתאימה. בחרו אזור עניין (ROI) בתא עם פלואורסצנציה אחידה. לאחר מכן, תחת לשונית Image, בחרו ב-Stacks, ולאחר מכן ב-Plot Z Axis Profile.
כדי לשרטט את פרופיל ציר z של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת שנמדדה באזור העניין כפונקציה של הזוויות בציר x. כל ערך זווית בציר x, הגבוה מהזווית הקריטית, יכול לשמש לאחר מכן במהלך סשן המיקרוסקופיה כדי להשיג אות TIRF. לאחר מכן, בתוכנת הרכישה בזמן אמת, השתמש בעורך הפרוטוקול כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה.
כולל את מספר רצפי רכישת הלולאה, את הערוצים הפלואורסצנטיים ואת עוצמת הלייזר שלהם, את זווית ה-TIRF ואת זמן החשיפה. הגדירו את תנועת ה-Z של העדשה כדי להגיע למישור מצב האפי-פלואורסצנציה (epifluorescence). לאחר מכן, במצב אפי-פלואורסצנציה, הגדירו את זווית ה-TIRF ל-1, ואת תנועת ה-Z של העדשה חזרה למישור ה-TIRF.
לאחר מכן, השג תמונה של התא במצב תאורת LED בהירה. כעת, מצא תא רלוונטי עם רמה מתונה של ביטוי חלבון מסומן פלואורסצנטית, העוסק בפגוציטוזה של SRBC, והזז את התא למרכז השדה. שים לב שניתן לזהות תא כזה על ידי קרום פלזמה מוארך סביב החלקיק.
הזינו את מספר הפריימים בלשונית Loop Count כדי להתחיל רכישה בזרם (streaming acquisition) של 500 עד 1,000 פריימים. במידת הצורך, שנו את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה כדי להתאים לרמות הפלואורסצנציה השונות בתא. כדי להפיק שתי רצפי תמונות נפרדים המתאימים לשני הערוצים, פתחו את הרצפים בתוכנת הדמיון (imagine software) ולחצו על לשונית Image.
בתפריט Hyperstacks, בחרו ב-Stack to Hyperstack. לאחר מכן, בחלון הקופץ, הזינו xyctz עבור ה-Order, את מספר הפלואורוכרומים שנעשה בהם שימוש עבור ה-Channels, את מספר ה-Slices בציר z, את מספר התמונות חלקי מספר הערוצים תחת Frames, ובחרו Grayscale עבור ה-Display Mode. לאחר מכן, פצלו את הערוצים.
כאן מוצג סרטון מייצג של מיקרוסקופיית TIRF של תאים חיים, המבצע בדיקת סגירת פגוזום במקרופאגים מסוג raw 264.7 הבלעים SRBC שעבר אופסוניזציה ב-IGG. כאשר קצוות הפסאודופודיים המופנים למשטח הזכוכית מסביב ל-SRBC, מזוהה טבעת F-actin באזור ה-TIRF אשר נסגרת בהדרגה עד לסגירה מלאה. במקביל, אות F-actin מטושטש המזוהה באמצעות פלואורסצנציה אפיפלוורסצנטית, לאחר הזזת הבמה שלושה מיקרון מעל אזור ה-TIRF, תואם לדה-פולימריזציה בבסיס הגביע הפגוציטי.
לאחר שלוש דקות, ה-SRBC מופנם לחלוטין, כפי שאומת באמצעות דימות באור תמסור. באמצעות שיטה זו, ניתן להדגים את האקטין בבסיס הגביע הפגוציטי, שבו מתרחשת האקסוציטוזה מוקדית של המדורים התוך-תאיים. לאחר רכישת התמונה, ניתן להעביר תא לעיבוד נוסף למיקרוסקופיה אלקטרונית קורלטיבית, או שניתן לקבע ולהקפיא את כל אוכלוסיית התאים לעיבוד עבור מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קלאסית.
חשוב לזכור כי פגוציטוזה רגישה מאוד לטמפרטורה, ולכן יש לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 °C בתוך תא החממה ובמדיום של כלי התרבית לאורך כל הפרוצדורה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע אופסוניזציה של חלקיקים, ציפוי של לביבות זכוכית (cover slips) בחלקיקים, קביעת הזוויות הקריטיות עבור מיקרוסקופיית TIRF, והדמיית הלוקליזציה של חלבונים רלוונטיים במהלך פגוציטוזה של תאים חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להדמיה של היווצרות וסגירה של פגוזומים במקרופאגים חיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה (TIRF). הטכניקה מאפשרת ניטור ברזולוציה גבוהה של גביע הפגוציטוזה והארכת הפסאודופודיום בשלושה ממדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- פגוציטוזה היא תהליך מכריע בתגובה החיסונית.
- הבנת הדינמיקה של הפגוזום יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד המקרופאגים.
- מיקרוסקופיית TIRF מציעה יכולות ויזואליזציה משופרות.
- שילוב של TIRF עם אפי-פלואורסצנציה מאפשר מעקב מפורט אחר תהליכים תאיים.
מטרת המחקר
- להדמיה בזמן אמת של היווצרות וסגירה של פגוזומים.
- לזיהוי האתר המדויק של חיתוך הפגוזום.
- להעמקת ההבנה של התנהגות מקרופאגים במהלך פגוציטוזה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במיקרוסקופיית TIRF לצפייה במקרופאגים חיים.
- יישום של חלבונים פלואורסצנטיים למעקב אחר רכיבים תאיים.
- הכנת תאי דם אדומים של כבש לבדיקות פגוציטוזה.
- ניטור התרחבות פסאודופודיה והיתוך הקצה במהלך פגוציטוזה.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של דינמיקת הפגוזום בתלת-ממד.
- זיהוי של שלבים מרכזיים בפגוציטוזה.
- הדגמה של יעילות מיקרוסקופיית TIRF בדימות תאים חיים.
- תובנות לגבי המכניקה של אינטראקציות של מקרופאגים עם מטרות.
מסקנות
- המחקר מספק גישה חדשנית להדמיה של פגוציטוזה.
- מיקרוסקופיית TIRF היא כלי רב עוצמה לחקר תהליכים תאיים.
- הממצאים תורמים להבנת התפקוד של תאי מערכת החיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה תלת-ממדית של סגירת הפגוזום נותנת מענה לפער קריטי בהבנת פינוי פתוגנים המתווך על ידי מקרופאגים, מנגנון מפתח במחקר של אימוןולוגיה ומחלות זיהומיות. בדיקה זו, המבוססת על TIRF, מאפשרת מעקב בזמן אמת וברזולוציה גבוהה אחר דינמיקת אקטין ואירועי היתוך ממברנות, ובכך מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית לצורך תיקוף מטרות בגילוי תרופות אימונו-מודולטוריות. השיטה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור הפרעות מולקולריות לתוצאות פגוציטיות תפקודיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של התארכות פסאודופודיה המתווכת על ידי actin ומיזוג הקצוות במהלך היווצרות הפגוזום.
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות עבור רגולטורים של השלד התאי ומנגנוני אקסוציטוזה המעורבים בהפנמה של פתוגנים.
- ערך מדעי: תומך באמון חיזוי על ידי מתאם בין לוקליזציה של חלבונים לבין יעילות פגוציטית וקינטיקה של סגירה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה המשכית על ידי קביעת מדדים כמותיים של דינמיקת גביע הפגוציטוזה.
- ערך מדעי: מענה לסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ציפוי מבוקר של חלקיקים, שמירה על הטמפרטורה וכיול זווית TIRF.
- ערך מדעי: הדגשת המוכנות לסריקה באמצעות דימוי דו-ערוצי של חלבונים מסומנים פלואורסצנטית במהלך פגוציטוזה של תאים חיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות להדמיה של פגמים בפגוציטוזה במודלים של מקרופאגים של תפקוד לקוי של מערכת החיסון.
- ערך מדעי: מתאר רציפות תרגומית ממנגנון מולקולרי לפנוטיפ תאי בתיקוף פרה-קליני.
- ערך מדעי: מתמקד בהפחתת סיכונים חזויה על ידי זיהוי שחקנים מולקולריים ששיבושם מעכב את סגירת הפגוזום מבלי להשפיע על היווצרות הגביע (cup formation).
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מוביל (lead identification), על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי התפקוד הפגוציטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי הדמיה של הדינמיקה המרחבית-זמנית של actin וסמני אקסוציטוזה במהלך היווצרות גביע הפגוציטוזה.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות יצירה הדירה של אות TIRF ומעקב אחר לוקליזציה של חלבונים בערוץ כפול.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כמותיות של קינטיקת סגירת הפגוזום וההיצרוף של טבעת ה-actin כקריאות פונקציונליות להשפעות של תרכובות או הפרעות גנטיות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לקורלציה בין פנוטיפים של הדמיה לתוצאות פונקציונליות במודלים של מקרופאגים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כפלטפורמת הדמיה רב-שימוש לחקר פגוציטוזה במגוון סוגי חלקיקים וקווי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הדמיה ישירה של אירועי סגירת הפגוזום.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות קביעה מבוקרת של הזווית הקריטית והדמיה של תאים חיים תחת בקרת טמפרטורה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי השלד התאי והאקסוציטוזה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על השפעתן על יעילות הפגוציטוזה ודינמיקת הסגירה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדימות תאים חיים, טרנספקציה וכיול מיקרוסקופ TIRF.
- דרישות הציוד כוללות מיקרוסקופ בעל יכולת TIRF עם אפי-פלואורסצנציה, בקרת טמפרטורה ומצלמות ברגישות גבוהה.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת פרוטוקולים משותפים לאופסוניזציה של חלקיקים, ציפוי ופרמטרי דימות.
- שיקולי התאמה כוללים גדלי חלקיקים משתנים, זליגת פלואורסצנציה (bleed-through) ופוטוטוקסיות בדימות לטווח ארוך.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לתנודות בטמפרטורה והצורך בבנייה (constructs) של חלבונים פלואורסצנטיים בעלי ביטוי נמוך כדי למנוע ארטיפקטים של ביטוי יתר.
