"Assay סגירת Phagosome" לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לדמיין את היווצרות הפגוזומים, כמו גם את האתר המדויק של פיצול פגוזום בתלת מימד, במקרופאגים חיים, באמצעות תפרחת השתקפות פנימית כוללת, או מיקרוסקופ TIRF. שיטה זו משלבת מיקרוסקופ TIRF עם אפיפלואורסצנציה כדי לנטר את הלוקליזציה שלב אחר שלב של שני חלבונים פלואורסצנטיים שונים במהלך הרחבת פסאודופוד ואיחוי קצה. הטכניקה מספקת שיטה שיטתית לקביעת הזווית הקריטית וקבלת אות TIRF שהוא חיוני להסקת מסקנות לגבי הקרבה לקרום הפלזמה.

יום לפני מפגש המיקרוסקופ TIRF, הפעל את תא החימום ל -37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר חימום הומוגני של שלב המיקרוסקופ. למחרת בבוקר, תוך שימוש ב-100 מיקרוליטר של PBS, תוספת של 0.1% BSA כדי לשטוף 7x10 לכבשה השישית כדוריות דם אדומות או SRBCs לכל צלחת תחתית זכוכית של 35 מילימטר פעמיים. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של ארנב IGG anti-SRBCs, בריכוז תת-אגלוטיניצי, ב-PBS בתוספת 0.1% BSA לכל 5 מיקרוליטר תאים, ודגרו על התאים למשך 30 דקות בסיבוב איטי.

בתום הדגירה יש לשטוף את ה-SRBCs פעמיים ב-PBS בתוספת BSA, ולהשעות מחדש את התאים ב-2 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, מדיום מיקרוסקופיה נטול סרום למנה. לאחר מכן, טפלו בכלים עם תחתית זכוכית בגודל 35 מילימטר עם 2 מיליליטר של 0.1% ליזין פולי-ליטר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות עם 2 מיליליטר PBS. לקיבוע לא קוולנטי של ה-SRBCs, שפכו 2 מיליליטר של התאים האופסונים של IGG לכל אחד מהכלים המצופים בפוליליזין וצנטריפוגה את הדגימות בצנטריפוגת רוטור מתנדנדת.

השליכו את חומרי העל ושטפו את החלקיקים פעם אחת עם 2 מיליליטר PBS בתוספת 10% BSA. לאחר מכן, דגרו את החלקיקים עם 2 מיליליטר PBS טרי בתוספת 10% BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 2 מיליליטר PBS. לאחר הכביסה האחרונה, החלף את ה- PBS ב -2 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, מדיום מיקרוסקופיה ללא סרום.

הנח צלחת מצופה SRBC על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, מגרדים את התאים המעניינים מתחתית צלחת התרבית, ומגרדים את התאים כמה פעמים כדי להשיג תרחיף של תא בודד. הוסף את התאים המועברים לצלחת המצופה SRBC.

הפעל את תוכנת הרכישה החיה. מצאו תא שמבטא את החלבונים המתויגים פלואורסצנטית, והתאימו את מיקום הצלחת כך שתא מעניין יהיה במרכז השדה. רכוש 500 תמונות בזוויות שונות מאפס עד 5% במרווחים של 0.01 מעלות, באורך גל עירור אחד.

כדי לקבוע את הזווית הקריטית עבור האור הפוגע שיוחזר לחלוטין בממשק הזכוכית-מדיום, וליצור גל חולף, פתח את רצף התמונה בתוכנת ההדמיה המתאימה. בחר אזור עניין בתא עם פלואורסצנטיות אחידה. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה תמונה, בחר ערימות והתווה פרופיל ציר Z.

כדי לשרטט את פרופיל ציר z ממוצע עוצמת הקרינה הנמדדת באזור העניין עם פונקציית הזוויות על ציר x. לאחר מכן ניתן להשתמש בכל ערך זווית על ציר ה-x, העדיף על הזווית הקריטית, במהלך הפעלת המיקרוסקופיה כדי לקבל אות TIRF. לאחר מכן, בתוכנת הרכישה החיה, השתמש בעורך הפרוטוקולים כדי להגדיר את הפרמטרים של הרכישה.

כולל מספר רצפי רכישת הלולאה, תעלות הפלואורסצנט ועוצמת הלייזר שלהן, זווית ה-TIRF וזמן החשיפה. הגדר את מהלך Z של המטרה כדי להגיע למישור מצב האפיפלואורסצנטי. לאחר מכן, במצב אפיפלואורסצנטי, הגדר את זווית ה-TIRF ל-1, ואת תנועת ה-Z של המטרה בחזרה למישור ה-TIRF.

לאחר מכן, קבל תמונה של התא במצב LED אור בהיר. כעת, מצא תא מעניין עם רמה מתונה של ביטוי חלבון מתויג פלואורסצנטי, העוסק בפגוציטוזיס עם SRBC, והעבר את התא למרכז השדה. שימו לב שניתן לזהות תא כזה על ידי קרום פלזמה מורחב סביב החלקיק.

הזן את מספר המסגרות בכרטיסייה Loop Count כדי להתחיל ברכישת הזרמה של 500 עד 1,000 פריימים. במידת הצורך, שנה את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה כדי להתאים לרמות הקרינה השונות בתא. כדי ליצור שני רצפי תמונות נפרדים המתאימים לשני הערוצים, פתח את הרצפים בתוכנת הדמיון ולחץ על הכרטיסייה תמונה.

בתפריט Hyperstacks, בחר Stack to Hyperstack. לאחר מכן, בחלון הנפתח, הזן xyctz עבור הסדר, מספר הפלואורוכרומים המשמשים עבור הערוצים, מספר הפרוסות בציר z, מספר התמונות חלקי מספר הערוצים תחת מסגרות וגווני אפור עבור מצב התצוגה. לאחר מכן, פצלו את הערוצים.

כאן, מוצג סרטון מיקרוסקופיה TIRF מייצג של תא חי של בדיקת סגירה פגוזומית ב-264.7 מקרופאגים גולמיים הבולעים SRBC אופסוני של IGG. כאשר קצות הפסאודופודים המנוגדים לכיסוי הזכוכית מחליקים סביב ה-SRBC, מתגלה טבעת F-actin באזור ה-TIRF שמצטמצמת בהדרגה עד שהיא נסגרת. במקביל, אות ה-F-actin המטושטש שזוהה על ידי האפיפלורוזנציה, לאחר הזזת השלב שלושה מיקרון מעל אזור ה-TIRF מתאים לדה-פילמור בבסיס הכוס הפגוציטית.

לאחר שלוש דקות, ה-SRBC מופנם לחלוטין, כפי שאושר על ידי הדמיית אור משודרת. באמצעות שיטה זו, ניתן להדגים את האקטין בבסיס הכוס הפגוציטית שבה מתרחש האקסוציטוזיס המוקד של התאים התוך-תאיים. לאחר רכישתו, ניתן לעבד תא נוסף למיקרוסקופ אלקטרונים מתאם, או לתקן ולהקפיא את כל אוכלוסיית התאים למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קלאסית.

חשוב לזכור כי פגוציטוזיס רגיש מאוד לטמפרטורה, ולכן יש לשמור על הטמפרטורה בתוך תא החימום ומדיום צלחת התרבות בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע אופסוניזציה של חלקיקים, כיסוי מעיל מחליק עם החלקיקים, לקבוע את הזוויות הקריטיות למיקרוסקופ TIRF ולדמות את הלוקליזציה של חלבונים מעניינים במהלך פגוציטוזיס של תאים חיים.