מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים
October 9th, 2016
אירועי שחבור טנדם מתרחשים באתרים המרוחקים פחות מ-12 נוקלאוטידים זה מזה. כימות יחסים של גרסאות חיבור כאלה אפשרי באמצעות גישת PCR כמותית מוחלטת. כתב יד זה מתאר כיצד ניתן לכמת וריאנטים של הגן STAT3, שבהם שני אירועי שחבור מביאים להכללה/אי הכללה של Serine-701 ו-α/β C-termini.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת את הפרופורציות והרמות המוחלטות של תעתיקי וריאנט חיבור STAT3 באאוזינופילים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום ויסות השחבור כגון שיוך משותף של אירועי שחבור דיסטלי וזיהוי תנאים שעלולים לגרום לפרופורציות שחבור טנדם שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תקני הפלסמיד המאפשרים רכישת נתוני qPCR מוחלטים ויחסיים כך שנוכל לקבוע פרופורציות ורמות כוללות של ארבעה תעתיקי STAT3.
במקרה שלנו אנו רוצים ללמוד כיצד ארבע גרסאות STAT3 S אלפא, S בטא, דלתא S אלפא ודלתא S בטא משתנות כאשר אאוזינופילים מגורים על ידי ציטוקינים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הרכב STAT3 של אאוזינופילים, ניתן ליישם אותה גם על סוגי תאים אחרים שעבורם ניתן להשיג cDNA. מכיוון ש-S ודלתא S משתנים רק בשלושה נוקלאוטידים היינו צריכים להקריב יעילות כדי להשיג ספציפיות בכל אחד מהסטנדרטים עבור כל גרסה.
בפרוטוקול זה cDNA שהוכן מאאוזינופילים אנושיים משמש כתבנית להגברת גרסאות החיבור STAT3. לאחר יצירת הפלסמידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הכינו תגובות ריצוף לריצוף פלסמידים ממספר מושבות. כל תגובה של 20 מיקרוליטר צריכה להכיל שלושה מיקרוליטר של מאגר תגובת רצף, שני מיקרוליטר של תערובת תגובת רצף, 12 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד, מיקרוליטר אחד של פלסמיד ושני מיקרוליטר של פריימר ריצוף.
כאשר תוצאות הריצוף זמינות, העריכו את האלקטרופורטוגרמות של הפלסמידים המקודדים כל גרסה; S אלפא, S בטא, דלתא S אלפא ודלתא S בטא. מדוד את ריכוז ה-DNA הפלסמיד הטהור בננוגרם למיקרוליטר וחשב את מספר העותק למיקרוליטר. התחל הליך זה על ידי הכנת סדרת דילול אחת מתוך 10 של הפלסמידים STAT3 באמצעות מים טהורים במיוחד.
עם כ -10 עד השמיני עד 10 עד השלישי עותקים למיקרוליטר. מדוד את ריכוז הדגימה המרוכזת ביותר. השתמש בפלסמידים המדוללים כדי להכין ארבע תערובות שאינן מטרה כבקרות שליליות עבור כל וריאנט חיבור ב-10 עד שישית עותקים למיקרוליטר עבור כל גרסה.
הכן תערובת מטרה עם ריכוזים שווים של כל ארבע התבניות, כל אחת ב-10 עד שישית עותקים למיקרוליטר. הכן תמיסות זוג פריימר לכל גרסת חיבור עם 60 מיקרוליטר פריימרים, כל אחד בריכוז של שבעה מיקרומולרים, לריכוז סופי של 560 ננו-מולרי בדגימה. לדלל את ה-DNA פולימראז, תערובת צבע קושרת DNA דו-גדילית, שבעה עד חמישה במים טהורים.
הגדר את הבדיקה בלוחית PCR של 96 בארות בהתאם לתבנית זו. ראשית הוסף לכל באר 21 מיקרוליטר של ה-DNA פולימראז המדולל, תערובת צבע קושרת DNA דו-גדילית. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר תערובת פריימר ושני מיקרוליטר תבנית.
לכל באר בקרה ללא תבנית הוסף שני מיקרוליטר מים מסוננים במקום תבנית. הגדר את התגובות בכפולות כדי להעריך את יכולת החזרה. אטום את לוחית ה-qPCR עם מכסה דבק וצנטריפוגה למשך חמש דקות בחום של 1,200 גרם ב-12 מעלות צלזיוס.
הפעל את מכונת ה-qPCR והכנס את לוחית ה-qPCR האטומה. אם אתה משתמש במערכת ה-PCR בזמן אמת של ABI, הגדר את הניסוי כפי שהודגם. לחץ/י על ״קובץ״, ״חדש״, ״הבא״, בחר/י ״גלאי חדש״ ולאחר מכן ספק/י שם ובחר/י ״מדווח״ ו״מרווה״.
הגדר גלאי חדש לכל גרסת חיבור. בחר הבא והגדר את התקנים כפי שמתבקש בדף הגדרת לוחית לדוגמה תוך הקפדה על הזנת הכמויות לטבלה ובחירת הגלאים המתאימים. לחץ על סיום.
הגדר את תוכנית הרכיבה המתאימה ל-PCR. ודא שקריאת הקרינה לקביעת ערכי מחזור הסף מתרחשת במהלך שלב 72 מעלות צלזיוס של כל מחזור. בחר הפעל.
לאחר השלמת ההפעלה, לחץ על הכרטיסייה תוצאות הגברה הכרטיסייה עלילת הגברה. הערך את עלילת הגברת הפלט כדי להעריך את איכות הנתונים. עלילה מעריכית מצביעה על הגברה אמינה.
ייצא את התוצאות לתוכנת גיליונות אלקטרוניים. ניתוח הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הוא המפתח לדעת אם הבדיקה דורשת אופטימיזציה נוספת לצורך שחזור. ה-cDNA לבדיקה זו מוכן מאאוזינופילים שטופלו בציטוקינים כדי לקדם שעתוק.
הכן דילולים סדרתיים של שתי דגימות cDNA עם טווח דילול מאחד לאחד ל-1, 024. הגדר את הבדיקה בצלחת של 96 בארות עם תגובות של 25 מיקרוליטר כפי שהודגם לניתוח ספציפיות פריימר אך עם מספר ריכוזי פריימר עבור פאן STAT3 וגן משק בית GUSB. תבנית מוצגת בטבלה זו.
הכנס את לוחית ה-PCR האטומה למכונת ה-qPCR. הגדר את הניסוי באמצעות התוכנה, הוספת גלאי חדש ל-GUSB ושימוש בתוכנת ה-PCR המתאימה. לאחר מכן, התוצאות משמשות לחישוב ערך מחזור הסף עבור כל דגימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כדי להתחיל בהליך זה, השווה את ערכי מחזור הסף המתקבלים ב-qPCR יחסי עבור גן משק הבית GUSB ודלל את ה-cDNA בהתאם למים טהורים במיוחד כדי להבטיח שכל הריכוזים נמצאים בסדר גודל אחד. הגדר את מבחני ה-qPCR המוחלטים של הדגימות בצלחות של 96 בארות. עקוב אחר תבנית זו עבור S alpha ו- S beta ותבנית זו עבור דלתא S אלפא ודלתא S בטא.
בצע את הבדיקות כפי שהוצג קודם לכן וחזור על הבדיקות לפחות פעם אחת. לאחר מכן, הגדר צלחת qPCR מוחלטת עם 96 בארות עם תגובות של 25 מיקרוליטר באמצעות פריימרים פאן STAT3 ב-400 מיקרומולר ותערובת של כל ארבעת הפלסמידים או פלסמיד בודד בעקבות תבנית זו. אטום את לוחית ה-qPCR עם מכסה דבק וצנטריפוגה למשך חמש דקות בחום של 1,200 גרם ב-12 מעלות צלזיוס.
הכנס את לוחית ה-PCR האטומה למכונת ה-qPCR והגדר את הניסוי כפי שהוצג קודם לכן, הוספת גלאי חדש עבור פאן STAT3. הגדר את אותם פרמטרים מחזוריים כמו עבור qPCR יחסי. לאחר חזרה על הבדיקה לפחות פעם אחת נתח את התוצאות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
נתוני qPCR באיכות טובה ייצרו עלילת הגברה סיגמואידית המסמלת עלייה אקספוננציאלית בתעתיקים במהלך המחזור. נתונים אלה התקבלו מ-qPCR של שני דילולים סדרתיים של פלסמיד המכילים STAT3 S alpha. כל זוג קווים צבעוניים מייצג את רמות הקרינה של דגימות מדוללות כפולות במהלך 40 מחזורים.
עקומות סטנדרטיות שנוצרו עבור פלסמידים של כיול התבנית יצביעו על יעילות ההגברה. בעקומה זו עבור STAT3 S alpha יעילות ההגברה הייתה 83.9%על מנת להעריך את ההתאמה של רמות STAT3 נמדדו הערכים המוחלטים של כל אחת מארבעת גרסאות החיבור וכן את רמת ה-STAT3 הכוללת. באופן אידיאלי, גם הרגרסיה הליניארית וגם השיפוע צריכים להיות קרובים לאחד.
נתוני ה-qPCR המוחלטים מוצגים כתרשימי עוגה כדי להראות את הפרופורציות שלהם של ארבעת גרסאות החיבור של STAT3 במהלך הטיפול בציטוקינים. מיזוג נתוני qPCR מוחלטים ויחסיים הראה כי רמות של כל גרסאות החיבור של STAT3 עלו לאחר הגירוי עם ציטוקינים IL3 ו-TNF אלפא עם רמות שיא של שש שעות. איגום הנתונים מכל נקודות הזמן חשף הטיה קטנה אך משמעותית לשיוך משותף של אירועי שחבור בטא ודלתא S.
לאחר אופטימיזציה, ניתן לבצע בדיקות המבוססות על טכניקה זו תוך ארבע שעות אם מבוצעות כראוי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לעבוד בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום. החלטות שחבור הכוללות או אינן כוללות קודון אחד מהוות 20% משונות החיבור בתוך המסגרת.
הפרוטוקול שלנו צריך להיות מותאם בקלות לכימות של וריאציות כאלה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו אפשרה למאו ג'אנג לעבוד עם הקבוצה שלי בקבוצה של Li-Shan Rue כדי לשלוט בניסויי ביטוי מחדש של גרסאות STAT3 בתאי לימפומה ABC. ניסויים אלה הראו כי נדרש שילוב של גרסאות S ודלתא S להישרדות התאים בתרבית.
לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לבצע qPCR מוחלט ויחסי ואת התנאים המתאימים להבחנה וכימות הבדלי שחבור עדינים.
סקירה
המחקר הזה מציג שיטה לכימות הפרופורציות והרמות המוחלטות של תעתיקים של וריאציות ספליס של STAT3 באאוזינופילים. הפרוטוקול משתמש ב-PCR כמותי מוחלט כדי לנתח וריאציות ספליס שנוצרות מאירועי ספליס טנדמיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- אירועי ספליס טנדמיים מתרחשים באתרים במרחק של פחות מ-12 נוקלאוטידים זה מזה.
- כימות וריאציות ספליס חיוני להבנת רגולציה של גנים.
- וריאציות הספליס של STAT3 כוללות S alpha, S beta, delta S alpha, ו-delta S beta.
- הבנת וריאציות אלו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד האאוזינופילים והתגובה לציטוקינים.
מטרת המחקר
- לכמת את רמות וריאציות הספליס של STAT3 באאוזינופילים.
- לחקור כיצד גירוי ציטוקיני משפיע על הביטוי של וריאציות אלו.
- לספק שיטה אמינה להערכת פרופורציות וריאציות ספליס.
שיטות בשימוש
- הכנת cDNA מאאוזינופילים אנושיים.
- שימוש בסטנדרטים של פלסמיד לרכישת נתונים של qPCR מוחלטים ויחסיים.
- תגובות ריצוף להערכת מבני פלסמיד לכל וריאציית ספליס.
- הגדרת מבחני qPCR בפורמט של 96 באר כדי לנתח רמות תעתיקים.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של ארבע וריאציות ספליס של STAT3.
- הוכחת שינויים ברמות וריאציות הספליס בעקבות גירוי ציטוקיני.
- מתן שיטה החלה על סוגי תאים שונים לניתוח וריאציות ספליס.
- הנתונים הצביעו על הצורך באופטימיזציה של שכפול הניסוי.
מסקנות
- השיטה כמותת ביעילות וריאציות ספליס של STAT3 באאוזינופילים.
- התובנות שהושגו יכולות לשפר את ההבנה של רגולציה של ספליס.
- גישה זו יכולה להיות מותאמת לסוגי תאים ותנאים אחרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of splice variant proportions enables mechanistic de-risking in target validation by resolving transcriptional heterogeneity that can confound functional assays. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking isoform-specific expression to phenotypic outcomes in disease-relevant systems. The method’s adaptability to tandem splicing sites offers a scalable strategy for early discovery workflows where subtle transcriptional changes inform go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by quantifying isoform-specific expression changes in response to cytokine stimulation.
- Operational Value: Provides absolute quantification via plasmid standards, reducing reliance on comparative methods that may introduce normalization bias.
- Predictive Value: Supports assessment of co-splicing interdependence, aiding in the prioritization of targets with coordinated regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducibility-ready data for four highly similar splice variants, enabling precise discrimination in multiplexed assays.
- Operational Value: Establishes standardized workflows using calibrated plasmid dilutions, facilitating cross-lab consistency in transcript quantification.
- Scalability: Compatible with 96-well qPCR formats, allowing medium-throughput screening of splice variant dynamics under experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links eosinophil STAT3 isoform shifts to cytokine exposure, providing a disease-relevant system for inflammatory pathway analysis.
- Mechanistic De-risking: Reveals co-splicing patterns between distal tandem sites, informing biomarker strategies that account for coordinated transcriptional regulation.
- Preclinical Model Relevance: Demonstrated adaptability to lymphoma cells, supporting cross-system validation of splice variant functional roles.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by delivering absolute and relative transcript data that inform both target validation and assay readiness stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splicing regulation by quantifying isoform-specific responses to stimuli, clarifying pathway-level effects.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs from absolute qPCR, enabling reliable comparison of splice variant proportions across conditions.
- Analytics: Combines absolute quantification with efficiency-corrected relative qPCR to derive both proportional and total transcript levels, enhancing data interpretability.
- Translational Research: Connects isoform dynamics in primary eosinophils to preclinical models, supporting continuity in target validation.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based standardization allows the assay to be reused across projects and cell types as a plug-and-play quantification module.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific expression, improving target confidence in STAT3-related pathways.
- Operational Value: Ensures reproducibility through plasmid standard curves and optimized cycling parameters, minimizing inter-assay variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking splice variant ratios to functional outcomes in cellular models.
- Portfolio Impact: Enables data-driven triage of targets based on isoform expression stability and co-splicing behavior under pathophysiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR optimization, plasmid preparation, and sequence validation to ensure splice variant specificity.
- Dependent on access to qPCR instrumentation with fluorescence detection and thermal cycling precision for accurate threshold cycle determination.
- Necessitates cross-team standardization of plasmid dilution series and primer concentration protocols to maintain assay comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to new cell types, including cDNA quality and transcript abundance thresholds.
- Practical limitation: Primer specificity must be balanced with amplification efficiency due to minimal nucleotide differences between variants, as noted in the protocol optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Creating Plasmids as Template Standards
2:20
Analyzing Primer Specificity for Absolute qPCR
5:49
Performing Relative qPCR Assays
6:57
Analyzing Absolute qPCR Data for Unknown Samples
8:27
Results: Measurement of STAT3 Splice Variant Levels in Eosinophils Treated with Cytokines
10:06
Conclusion
