מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת את הפרופורציות והרמות המוחלטות של תמלילי וריאנטים של שחול (splice variants) של STAT3 באאוזינופילים. שיטה זו יכולה לתת מענה לשאלות מפתח בתחום הבקרה על השחול, כגון שיתוף-פעולה (coassociation) של אירועי שחול רחוקים וזיהוי תנאים שיכולים לגרום להבדלים בפרופורציות של שחול טנדמי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש בסטנדרטים של פלסמידים המאפשרים רכישת נתוני qPCR מוחלטים ויחסיים, כך שנוכל לקבוע את הפרופורציות והרמות הכלליות של ארבעה תמלילי STAT3.

במקרה שלנו, אנו מעוניינים ללמוד כיצד ארבעת הווריאנטים של STAT3, שהם S alpha, S beta, delta S alpha ו-delta S beta, משתנים כאשראוזינופילים מעוררים על ידי ציטוקינים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הרכב ה-STAT3 באאוזינופילים, ניתן ליישמה גם על סוגי תאים אחרים שניתן להפיק מהם cDNA. מכיוון ש-S ו-delta S נבדלים בשלושה נוקלאוטידים בלבד, נאלצנו להקריב יעילות כדי להשיג ספציפיות בסטנדרטים עבור כל ווריאנט.

בפרוטוקול זה משתמשים ב-cDNA שהופק מאאוזינופילים אנושיים כתבנית להגברה של וריאנטיות השחזור (splice variants) של STAT3. לאחר יצירת הפלסמידים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הכינו תגובות ריצוף לריצוף פלסמידים ממספר מושבות. כל תגובה בנפח 20 µL צריכה להכיל 3 µL של בופר לתגובת ריצוף, 2 µL של תערובת תגובת ריצוף, 12 µL של מים אולטרה-טהורים, 1 µL של פלסמיד ו-2 µL של פריימר ריצוף.

כאשר תוצאות הריצוף יהיו זמינות, יש לבחון את האלקטרופורטוגרמות של הפלסמידים המקודדים לכל וריאנט: S alpha, S beta, delta S alpha ו-delta S beta. מדדו את ריכוז ה-DNA הפלסמידי הטהור בננוגרמים למיקרולטר (ng/µL) וחשבו את מספר העותקים למיקרוליטר. התחילו את ההליך על ידי הכנת סדרת מהלולים של 1:10 של פלסמידי STAT3 באמצעות מים אולטרה-טהורים.

עם בערך 10⁸ עד 10³ עותקים למיקרוליטר. מדדו את הריכוז של הדגימה הריכוזית ביותר. השתמשו בפלסמידים המדוללים כדי להכין ארבע תערובות שאינן המטרה כביקורות שליליות עבור כל וריאנט שחבור (splice variant) בריכוז של 10⁶ עותקים למיקרוליטר עבור כל וריאנט.

הכינו תערובת מטרה עם ריכוזים שווים של כל ארבעת התבניות, כל אחת בריכוז של 10⁶ עותקים למיקרוליטר. הכינו תמיסות זוגות פריימרים עבור כל וריאנט שחבור (splice variant) עם 60 מיקרוליטר של פריימרים, כל אחד בריכוז של 7 µM, כדי להגיע לריכוז סופי של 560 nM בדגימה. דללו את ה-DNA polymerase ותערובת צבע הקשירה ל-DNA דו-גדילי ביחס של 7:5 עם מים מזוקקים.

הכינו את הבדיקה בפלטת PCR בעלת 96 בארות בהתאם לתבנית זו. ראשית, הוסיפו לכל בארה 21 µL של תערובת צבע קושר DNA דו-גדילי ו-DNA polymerase מדולל. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של תערובת פריימרים ו-2 µL של תבנית.

לכל באער של בקרת נסב-ריק (no-template control) יש להוסיף שני microliters של מים מסוננים במקום תבנית ה-DNA. יש להכין את התגובות בכפילות כדי להעריך את ההדירות. יש לאטום את פלטת ה-qPCR באמצעות כיסוי דביק ולסבב בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1,200 g בטמפרטורה של 12 degrees Celsius.

הפעילו את מכשיר ה-qPCR והכניסו את פלטת ה-qPCR האטומה. במידה ומשתמשים במערכת ה-ABI real-time PCR, הגדירו את הניסוי כפי שמוצג. לחצו על File, לאחר מכן New, ואז Next, בחרו Detector חדש, הגדירו שם ובחרו Reporter ו-Quencher.

הגדירו גלאי חדש עבור כל וריאנט שחבור (splice variant). בחרו ב-Next והגדירו את התקנים כפי שמתבקש בדף Set Up Sample Plate, תוך וידוא שהכמויות הוזנו לטבלה ושהגלאים המתאימים נבחרו. לחצו על Finish.

הגדירו את תוכנית מחזורי ה-PCR המתאימה. ודאו שקריאת הפלואורסצנציה לקביעת ערכי מחזור הסף (threshold cycle) מתבצעת במהלך שלב ה-72 °C של כל מחזור. בחרו ב-Run.

כאשר ההרצה מסתיימת, לחצו על לשונית Results ולאחר מכן על לשונית Amplification Plot. העריכו את תרשים ההגברה (Amplification plot) של הפלט כדי לבחון את איכות הנתונים. תרשים מעריכי מעיד על הגברה אמינה.

ייצא את התוצאות לתוכנת גיליונות נתונים. ניתוח הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הוא המפתח לידיעה האם הבדיקה דורשת אופטימיזציה נוספת למען השחזוריות. ה-cDNA עבור בדיקה זו מוכן מאאוזינופילים שטופלו בציטוקינים כדי לעודד טרנסקריפציה.

הכינו דלואים סדרתיים של שתי מנות cDNA של דגימות בטווח דלואים של 1 עד 1:1,024. הגדירו את הבדיקה בפלטה של 96 בארות עם תגובות של 25 µL, כפי שהודגם לניתוח ספציפיות של הפריימרים, אך עם מספר ריכוזי פריימר עבור pan STAT3 וגן בית (housekeeping gene) מסוג GUSB. תבנית מוצגת בטבלה זו.

הכנס את פלטת ה-PCR האטומה למכשיר ה-qPCR. הגדר את הניסוי באמצעות התוכנה על ידי הוספת גלאי חדש עבור GUSB ושימוש בתוכנית מחזורי ה-PCR המתאימה. לאחר מכן, התוצאות משמשות לחישוב ערך מחזור הסף (threshold cycle) עבור כל דגימה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

כדי להתחיל בהליך זה, השוו את ערכי מחזור הסף (threshold cycle) שהתקבלו ב-qPCR יחסי עבור הגן השומר על הבית (housekeeping gene) GUSB ודללו את ה-cDNA בהתאם בעזרת מים אולטרה-טהורים כדי להבטיח שכל הריכוזים נמצאים בטווח של סדר גודל אחד. הכינו את בדיקות ה-qPCR המוחלטות של הדגימות בלוחיות 96 בארות. עקבו אחר תבנית זו עבור S alpha ו-S beta ואחר תבנית זו עבור delta S alpha ו-delta S beta.

בצע את הבדיקות כפי שהודגם קודם לכן וחזור על הבדיקות לפחות פעם אחת. לאחר מכן, הכן פלטת qPCR של 96 בארות לבדיקה מוחלטת עם תגובות בנפח של 25 µL, תוך שימוש בפריימרים pan STAT3 בריכוז 400 µM ותערובת של כל ארבעת הפלסמידים או פלסמיד בודד לפי תבנית זו. אטום את פלטת ה-qPCR עם כיסוי דביק וסבב בצנטריפוגה במשך חמש דקות ב-1,200 g ובטמפרטורה של 12 °C.

הכנס את פלטת ה-PCR האטומה למכונת ה-qPCR והגדר את הניסוי כפי שהודגם קודם לכן, תוך הוספת גלאי חדש עבור pan STAT3. הגדר את אותם פרמטרי מחזוריים כפי שנקבע עבור qPCR יחסי. לאחר חזרה על הבדיקה לפחות פעם אחת, נתח את התוצאות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

נתוני qPCR באיכות טובה יניבו גרף הגברה סיגמואידי המעיד על עלייה מעריכית בתמלילים במהלך המחזורים. נתונים אלו התקבלו מ-qPCR של שתי דילולים סדרתיים של פלסמיד המכיל STAT3 S alpha. כל זוג קווים צבעוניים מייצג את רמות הפלואורסצנציה של דגימות מדוללות כפולות לאורך 40 מחזורים.

עקומות סטנדרט שנוצרו עבור פלסמידי כיול התבנית יעודדו את יעילות ההגברה. בעקומה זו עבור STAT3 S alpha יעילות ההגברה הייתה 83.9%. על מנת להעריך את העקביות של רמות STAT3, נמדדו הערכים המוחלטים של כל אחד מארבעת הווריאנטים של השחור (splice variants), וכן הרמה של STAT3 הכולל. באופן אידיאלי, הן הרגרסיה הליניארית והן השיפוע צריכים להיות קרובים לאחד.

נתוני ה-qPCR המוחלטים מוצגים כתרשימי עוגה כדי להראות את הפרופורציות של ארבעת הווריאנטים של שחלוף STAT3 במהלך הטיפול בציטוקינים. שילוב של נתוני qPCR מוחלטים ויחסיים הדגים כי הרמות של כל ווריאנטים השחלוף של STAT3 עלו לאחר גירוי באמצעות הציטוקינים IL3 ו-TNF alpha, כאשר הרמות הגיעו לשיאן לאחר שש שעות. איחוד הנתונים מכל נקודות הזמן חשף נטייה קטנה אך מובהקת לקו-אסוציאציה של אירועי השחלוף של beta ו-delta S.

לאחר אופטימיזציה, ניתן לבצע בדיקות המבוססות על טכניקה זו בתוך ארבע שעות, אם הן מבוצעות כראוי. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לעבוד בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום. החלטות שחבור הכוללות או מחליפות קודון אחד מהוות 20% מהשונות בשחבור בתוך המסגרת (in-frame splice variation).

הפרוטוקול שלנו אמור להיות ניתן להתאמה בקלות לכימות של וריאציות כאלה. לאחר פיתוחו, טכניקה זו אפשרה ל-Mao Zhang לעבוד עם הקבוצה שלי ובקבוצתו של Li-Shan Rue כדי לשלוט בניסויי knockdown וביטוי מחדש (re-expression) של וריאציות של STAT3 בתאי לימפומה מסוג ABC. ניסויים אלה הדגימו כי תערובת של וריאציות S ו-delta S נדרשת להישרדות תאים בתרבית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע qPCR מוחלט ויחסי, וכן לגבי התנאים המתאימים להבחנה וכמידור של הבדלי שחזור (splicing) עדינים.