הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר
28 ביולי 2016
פרוטוקול זה מתאר את ההעשרה המהירה של לויקוציטים מדגימות דם קטנות לקביעה ספציפית לאחר מכן של פעילות הפרוקסידאז ההלוגנטית בתוך התאים. ניתן ליישם את השיטה על חומר אנושי ולא אנושי ועשויה לתרום להערכה של סמנים דלקתיים חדשים.
המטרה הכללית של שיטה זו להדליית תאי דם אדומים היא להשיג העשרה מהירה ופשוטה של לוקוציטים מדגימת דם קטנה. יתרונות רבים של טכניקה זו הם היותה זולה, אמינה ומהירה. יתרה מכך, ניתן ליישמה על דגימות דם אנושיות ובלתי אנושיות.
לפני תחילת הליך הליזיס, כוון את הפיפטה למתן מים לשני מיליליטרים, ואת הפיפטה ל-PBS לחמישה מיליליטרים. לאחר מכן, הנח בקבוקים פתוחים של מים ו-PBS תחת מ 그런 flow hood (מCלוליית זרימה למינרית) בטמפרטורת החדר. מכיוון שליזיס היפוטוני הוא תהליך תלוי זמן, יש להכין את כל הדברים מראש.
יתר על כן, יש לבצע את הליך הליזיס תמיד באותה הדרך, כדי להשיג תוצאות תואמות. לאחר מכן, העבירו 100 µL מכל דגימת דם למבחנה קונית בנפח 15 mL. והוסיפו שתי מיליליטר של מים מזוקקים לכל דגימה בערבוב באמצעות וורטקס בהגדרה בינונית.
הניחו לתאים לנוח במשך 60 seconds, ולאחר מכן הוסיפו five milliliters של PBS. ערבבו את הדגימות באמצעות vortexing. כעת, אספו את התאים על ידי centrifugation, ושפכו את העל-נוזלים (supernatants).
הפכו את המבחנות והקישו על הפתחים על גבי נייר סופג כדי להסיר כמה שיותר נוזל. לאחר מכן, חזרו על הליך הליזיס ההיפוטוני כפי שהודגם כעת. לאחר קבלת משקע יבש בפעם השנייה, השהו מחדש כל דגימה ב-500 µL של HBSS, עד לקבלת תמיסה הומוגנית.
העבירו את התאים לפרועות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter על קרח. כדי לבדוק את הסגוליות של הפרוקסידאז בדגימות לאחר צביעה ב-amino phenol fluorescein או APF, הוסיפו תחילה 5 µL של מעכב ההם-פרוקסידאז, 4-ABAH, לדגימות המתאימות לדגירה של 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של תמיסת עבודה של APF לכל פרועת, וערבבו בעדינות את התאים במכשיר וורטקס (vortex) בהגדרה בינונית.
דגרו את כל הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של תמיסת עבודה של מימן פריקסיד לכל דגימה, וערבבו את המבחנות בעזרת וורטקס בעדינות. לאחר 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C, סובבו את התאים בצנטריפוגה, והסירו בזהירות את העלייה (supernatant) מבלי להפריע למשקעים.
לבסוף, השעו שוב את התאים ב-250 microliters של HBSS, ואחסרו את הדגימות בחושך עד לניתוחן, כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photo bleaching). כאן מוצגת דוגמה מייצגת של אוכלוסיות הלויקוציטים לאחר ליזיס היפוטוני וצביעת APF כפי שהודגמו זה עתה. על ידי שרטוט גודל התא אל מול הגרנולריות, ניתן להבחין בדילול משמעותי של האריתרוציטים, כאשר אוכלוסיית כדוריות הדם האדומות והשיירי מהווה רק 22% מהאירועים.
בנוסף, התבזורת של עוצמת הפלואורסצנציה הנגזרת מה-APF מאפשרת הבחנה ברורה בין כריכית הדם והלימפוציטים, שהם שליליים לפרוקסידאז, לבין מונוציטים ואאוזינופילים, שבהם נצפתה חמצון מיתון של APF, ולבין נויטרופילים, שהפגינו חמצון חזק של פרוקסידאז. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להחיל אותה במקביל על עד 50 דגימות דם, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון צביעה בנוגדנים, כדי לזהות את תתי-אוכלוסיות התאים הרלוונטיות.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקרי בעלי חיים קטנים לבחון את תפקידה של פעילות ההלוגנציה של MPO ו-EPO במודלים של בעלי חיים למחלות דלקתיות כרוניות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה להעשרה של לוקוציטים מדגימות דם קטנות, השמימהה גם לחומרים אנושיים וגם לחומרים שאינם אנושיים. הטכניקה היא יעילה כלכלית ואמינה, ומסייעת בהערכה של סממנים דלקתיים חדשים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- העשרה של לוקוציטים היא קריטית לחקר תגובות חיסוניות.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות גוזלות זמן ומורכבות.
- שיטה זו שואפת לפשט את התהליך.
- ניתן להשתמש בה עבור דגימות דם אנושיות וגם עבור דגימות דם שאינן אנושיות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להעשרה מהירה של לוקוציטים.
- הערכת פעילות של הלוגנציה פראוקסידאז בלוקוציטים.
- תרומה לזיהוי של סממנים דלקתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פפטים למתן מים ו-PBS.
- שימוש במCב זרימה למינרית לעיבוד דגימות.
- ליזיס היפוטוני לדילול כדוריות דם אדומות.
- ביצוע הליזיס בלוח זמנים קפדני.
תוצאות עיקריות
- העשרה מוצלחת של לוקוציטים מדגימות דם קטנות.
- הערכה אמינה של פעילות פראוקסידאז.
- היתכנות עבור דגימות אנושיות ובעלי חיים כאחד.
- פוטנציאל להערכה של סממנים דלקתיים חדשים.
מסקנות
- השיטה יעילה וחסכונית.
- היא משפרת את חקר התגובות החיסוניות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על פרוטוקול זה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר העשרה מהירה וסטנדרטית של לוקוציטים מדגימות דם קטנות, ובכך תומך במאמצי גילוי מוקדמים במחקר של מחלות דלקתיות. באמצעות כימות פעילות הפרוקסידאז ההלוגננית של MPO ו-EPO, הוא מספק מדד מכניסטי לתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים של מסלולים ביולוגיים. התאימות של השיטה לציטומטריה זרימה ולצביעה בנוגדנים מקלה על שילובה בתהליכי סריקה ובעבודות תרגומיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של פעילות פראוקסידאז ספציפית ללוקוציטים כדי לתקף את MPO ו-EPO כמטרות טיפוליות בדלקת כרונית.
- ערך תפעולי: משתמש בנפח דגימה מינימלי (50–100 µL), מה שמאפשר דגימה חוזרת ממודלים של בעלי חיים קטנים למחקרי מעקב ארוכי טווח של מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: משלב צביעת APF עם ציטומטריה של זרימה כדי להפיק קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה של ייצור HOCl/HOBr לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר עיבוד בשטח גבוה (high-throughput) של עד 50 דגימות במקביל, התומך במסעות סריקה ניתנים להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- ערך מדעי: מקשר את הפעילות של לוקוציט פראוקסידאז לתהליכים דלקתיים הרלוונטיים למחלה, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: פועל עם דם של בני אדם ומכרסמים, מה שמאפשר רציפות תרגומית בין מינים שונים באישור יעדים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה נכללת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית לגבי מטרות ועד לאישור פרה-קליני, ובמיוחד בתוכניות למחקר אימונולוגיה ומחלות דלקתיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי כימות פעילות פראוקסידאז ספציפית לאנזים באוכלוסיות מופרדות של לוקוציטים.
- סינון: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות פלואורסצנציית APF וציטומטריית זרימה, המאפשרות הערכה של השפעת תרכובות על פעילות הפראוקסידאז.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני עוצמת פלואורסצנציה מדידים המאפשרים השוואה של תתי-אוכלוסיות של תאים עם פראוקסידאז חיובי (נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים) תחת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פעילות פראוקסידאז למנגנונים של מחלות דלקתיות, ותומכת בהמשכיות פרה-קלינית כאשר היא משולבת עם צביעה של סמני שטח התא.
- שימוש חוזר ארגוני: העשרה סטנדרטית של לוקוציטים וזיהוי מבוסס APF מהווים פלטפורמה לשימוש חוזר עבור תוכניות מרובות של יעדים דלקתיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי בידוד פעילות הפרוקסידאז לשושלות לוקוציטים ספציפיות.
- ערך תפעולי: מציע פרוטוקול מהיר וזול הדורש מינימום ציוד (צנטריפוגה, וורטקס, ציטומטר זרימה).
- ערך אסטרטגי: מקצר את לוחות הזמנים להפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה וחוזרת של מודולציה של המטרה בדגימות לוקוציטים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודף מותאם סיכון של מעכבי MPO/EPO באמצעות אספקת נתוני פעילות פונקציונלית מוקדמים מתאים פיזיולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בלוקוציטים, ציטומטריה של זרימה וכימיה של גששים פלואורסצנטיים.
- תלוי בגישה לצנטריפוגות, וורטקסים, מ来看看 לזרימה למינרית ומכשירי ציטומטריה של זרימה עם ערוצי פלואורסצנציה מתאימים.
- דורש סטנדרטיזציה של תמיסות העבודה של APF ומימן פראוקסיד בין מעבדות כדי להשיג תוצאות הדירות.
- התאמה למינים שאינם אנושיים דורשת תיקוף של ביטוי פראוקסידאז ויעילות צביעת APF בתתי-אוכלוסיות של לוקוציטים ביעד.
- מוגבל לזיהוי פעילות פראוקסידאז הלוגנציה; אינו מודד תפקודי לוקוציטים אחרים אלא אם הוא משולב עם בדיקות נוספות.
