Name: צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: למד סינתזה אנזימטית מהירה של אנלוגי טרהלוז בצעד אחד עם טיהור במים בלבד. שיטה זו מספקת תשואה גבוהה וידידותית לסביבה לייצור חומרי גילוי למיקובקטריה ולמחקר שחפת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (R15 AI117670) ל-B.M.S ו-P.J.W, כמו גם פרס Cottrell College Scholar מתאגיד המחקר (20185) ל-P.J.W. L.M.M. נתמך על ידי מלגת פרובוסט מ-CMU.

<ol><li>Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+on+trehalose%3A+a+multifunctional+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">New insights on trehalose: a multifunctional molecule.</a> Glycobiology. 13, 17-27 (2003).</li>
<li>Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+trehalose+in+pathogenicity%3A+some+general+rules%2C+yet+many+exceptions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions.</a> PLoS Pathog. 9, 1003447(2013).</li>
<li>Ohtake, S., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose%3A+Current+use+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trehalose: Current use and future applications.</a> J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).</li>
<li>Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222463216_Comparison_of_free_sugars_in_growing_and_desiccated_plants_of_Selaginella_lepidophylla">Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla.</a> Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).</li>
<li>Kubota, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKubota%2C+M+%22Glycoenzymes%22">Glycoenzymes</a>. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).</li>
<li>Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+analogues%3A+latest+insights+in+properties+and+biocatalytic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).</li>
<li>Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229148606_Enzymatic_synthesis_of_a_galactose-containing_trehalose_analogue_disaccharide_by_Pyrococcus_horikoshii_trehalose-synthesizing_glycosyltransferase_Inhibitory_effects_on_several_disaccharidase_activitie">Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities.</a> J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).</li>
<li>Backus, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+unnatural+trehalose+analogs+as+a+reporter+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).</li>
<li>Swarts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mycobacterial+trehalome+with+bioorthogonal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).</li>
<li>Rose, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+trehalose+analogs+as+potential+inhibitors+of+mycobacterial+cell+wall+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis.</a> Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+trehalose-based+compounds+and+their+inhibitory+activities+against+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis.</a> Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).</li>
<li>Gobec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis%2C+biochemical+evaluation+and+antimycobacterial+action+of+phosphonate+inhibitors+of+antigen+85C%2C+a+crucial+enzyme+involved+in+biosynthesis+of+the+mycobacterial+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall.</a> Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).</li>
<li>Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/264303743_ChemInform_Abstract_Regioselective_Protection_and_Functionalization_of_Trehalose">Regioselective protection and functionalization of trehalose.</a> Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).</li>
<li>Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).</li>
<li>Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+studies+toward+Mycobacterium+tuberculosis+sulfolipid-I%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I.</a> J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).</li>
<li>Chaen, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273977592_Efficient_Enzymatic_Synthesis_of_Disaccharide_ALPHA-D-Galactosyl_ALPHA-D-Glucoside_by_Trehalose_Phosphorylase_from_Thermoanaerobacter_brockii">Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii.</a> J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).</li>
<li>Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+acceptor+specificity+of+trehalose+phosphorylase+for+the+production+of+trehalose+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Progr%22%5BJournal%5D)">Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs.</a> Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).</li>
<li>Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+trehalose+synthesizing+pathway+in+the+hyperthermophilic+Crenarchaeon+Thermoproteus+tenax%3A+the+unidirectional+TreT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway.</a> Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).</li>
<li>Urbanek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+trehalose+analogues%3A+rapid+access+to+chemical+probes+for+investigating+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria.</a> ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+Huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28I%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li>
<li>Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose-recycling+ABC+transporter+LpqY-SugA-SugB-SugC+is+essential+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנלוגים trehalose יש פוטנציאל להשפיע בתחומים שונים, החל משימור מזון ותרופות כדי אבחון וטיפול של זיהומים חיידקים 6. שיטות קיימות סינתזה כימית רבות שלבים שימושיות להפקת אנלוגים trehalose מורכבים עם מספר אתרים של שינוי (למשל, המתרחשים glycolipids mycobacterial מורכב באופן טבעי). עם זאת, שיטות אלו תמיד ממושך ובלתי יעילות, גם כאשר מוחלים על הסינתזה של אנלוגים trehalose monosubstituted הפשוטים יחסית 9, <sup class="xref"...

Trehalose הוא דו סוכר סימטרי הלא צמצום מורכב משני moieties גלוקוז כי מצטרפים (איור 1 א) 1,1-α, α-glycosidic אג"ח. בעוד trehalose נעדר בני אדם ויונקים אחרים, הוא נפוץ למצוא חיידקים, פטריות, צמחים, וחסרי חוליות 1. התפקיד העיקרי של trehalose ברוב האורגניזמים הוא להגן מפני לחצים סביבתיים, כגון התייבשות 1. בנוסף, פתוגנים אנושיים מסוימים דורשים trehalose עבור ארסיות, כולל שחפת Mycobacterium גרימה-שחפת, אשר מנצלת trehalose כמתווך של ביוסינתזה מעטפת תא כאבן בניין לבניית glycolipids אימונו-2. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg"> איור 1: trehalose ו אנלוגים trehalose. (אמבנים) של trehalose הטבעי באנלוג trehalose טבעי, כאשר X הוא שינוי מבני. (ב) דוגמאות של אנלוגים trehalose מהמדווח בספרות כי יש יישומים פוטנציאליים biopreservation ו bioimaging. בשל המבנה פיסיולוגי הפונקציות הייחודיים שלה, trehalose משך תשומת לב משמעותית לשימוש ביו (טכנו) יישומים הגיוניים ביו 3. מאפייני המגן של trehalose שנצפתה Nature-למשל, היכולת המרשימה שלה כדי לסייע לקיים חיים בצמחים "תחיית מתים" שעברו התייבשות קיצונית 4 -האם דרבנו השימוש הנרחב שלה ביישומי biopreservation. Trehalose נעשה שימוש כדי לשמור על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כגון חומצות גרעין, חלבונים, תאים ורקמות 3. למשל, trehalose משמש כתוסף מייצב מספר t תרופותכובע הנמצא בשוק, כולל נוגדנים חד שבטיים כמה אנטי סרטניים 3. כמו כן, trehalose משמש כממתיק בתעשיית המזון, וזה נעשה שימוש נרחב לשימור מוצר בשתי תעשיות המזון והקוסמטיקה. אימוץ trehalose עבור סוגים אלה של יישומים מסחריים בתחילה היה מוגבל על ידי חוסר היכולת להשיג בכמויות גדולות של trehalose הטהור ממקורות טבעיים או באמצעות סינתזה. עם זאת, תהליך אנזימטי יעיל לייצור החסכוני של trehalose מעמילן פותח לאחרונה, אשר דרבן השימוש המסחרי הנרחב שלו 5. מבחינה כימית שונה נגזרות של trehalose, תיקרא להלן אנלוגים trehalose, צברו תשומת לב גוברת עבור יישומים שונים (מבנה גנרי שמוצג באיור 1 א; דוגמאות ספציפיות של אנלוגים trehalose שמוצג באיור 1) 6. לדוגמה, לקטו-trehalose הוא אנלוגי trehalose עם אחת מיחידות גלוקוז שלה מוחלף עם גלקטוז, ובכך קבוצת הידרוקסיל 4-עמדתה בעל תצורה stereochemical הפוכה. יש לקטו-trehalose אותו במאפייני הייצוב כמו trehalose אבל הוא עמיד השפלה ידי אנזימים במעיים, מה שהופך אותו אטרקטיבי כתוסף מזון שאינו הקלורי 6, 7. העניין של הקבוצה שלנו ב אנלוגים trehalose מתייחס בעיקר לשווים כפי בדיקות ספציפיות mycobacteria ומעכבים. קבוצות בארי דייוויס פתחו אנלוגי trehalose-keto מצומדות-והעמסה, בשם FITC-קטו-trehalose, אשר הוצג מטבולית לתייג את דופן התא של שחפת חייה, מה שמאפשר זיהוי על ידי הקרינה מיקרוסקופיה 8. המעבדה Bertozzi שפותחה קטן azido-trehalose (TreAz) אנלוגים שיכול מבחינה מטבולית לתייג את דופן התא, ובהמשך להיות detected באמצעות כימיה לחץ קרינת ניתוח 9. ההתפתחויות הללו מצביעות על האפשרות של שימוש בדיקות מבוסס trehalose כסוכני הדמיה לאבחון שחפת. אנלוגים trehalose יש גם רדופים כמו מעכבים מ שהחפת בשל הפוטנציאל שלהם לשבש מסלולי החיידק חיוניים כדאי ארסי 10, 11, 12. עד כה, המכשול העיקרי לפיתוח אנלוגים trehalose עבור ביו (טכנו) יישומים הגיוניים ביו הוא חוסר שיטות סינטטיות יעילות. שני המסלולים המסורתיים לייצור אנלוגים trehalose להסתמך על סינתזה כימית (איור 2). תוואי אחד כרוך desymmetrization / שינוי של trehalose הטבעי, ואילו השני כרוך החל אובניים בניין monosaccharide פונקציונלי כראוי וביצוע הכימי glycosylation כדילזייף את הקשר 1,1-α, α-glycosidic. גישות אלה, ואשר נדונו לאחרונה במאמרי ביקורת 13, 14, הוכיחו שימושיות עבור להשיג סינתזה רבה שלבים של כמויות קטנות של מוצרים טבעיים מורכבים המכיל trehalose, כגון -1 sulfolipid משחפת מ 15. עם זאת, שתי הגישות הן בדרך כלל לא יעילות, זמן רב, נגיש שאינם כימאים, וכן, בנוסף, אינם נחשבים להיות ידידותי לסביבה. לפיכך, סינתזת סוגים מסוימים של אנלוגים trehalose, אסטרטגיות אלה אינן אידיאליות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg"> איור 2: גישות סינתזה אנלוגית trehalose. כימית גישות סינתזה אנלוגית trehalose, יוצגה בפינה השמאלית, השתמש נהלים רבים שלבים שכוללים פרוטק קשהtion / deprotection, desymmetrization, ו / או צעדים glycosylation. סינתזה אנזימתי, יוצג בפינה הימנית, משתמשת אנזים (ים) האחרונים stereoselectively להמיר מצעים פשוטים, לא מוגנים כדי trehalose אנלוגים בתמיסה מימית. פרוטוקול האנזימטית דיווחה בזאת משתמשת synthase trehalose (TreT) אנזים להמיר אנלוגים גלוקוז ו- UDP גלוקוז לתוך אנלוגים trehalose בשלב אחד. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> תוואי biocatalytic יעילים אנלוגים trehalose יקלו על הייצור, הערכה, והיישום של הכיתה המבטיחה הזה של מולקולות. בעוד התהליך המסחרי אנזימטי לייצור trehalose 5 אינו מסתגל כדי לסנתז אנלוגים משום שהוא מנצל עמילן כמו מצע, יש נתיב biosynthetic אחרדרכים בטבע כי עשוי להיות מנוצלת לסינתזה אנלוגית trehalose. עם זאת, המחקר בתחום זה, אשר נסקר 6 לאחרונה, היה מוגבל. אחד הדיווחים השתמשו בשיטה בהשראת מסלול biosynthetic trehalose Escherichia coli לגשת אנלוגי fluoro-trehalose אחת מן-גלוקוז fluoro המקביל. עם זאת, גישה זו דורשת מערכה תלת-אנזים הגבילה יעילות בכלליות 8. גישה אחרת, שהיה כבר בחנה היא להשתמש phosphorylase trehalose (TreP) בכיוון ההפוך, אשר באופן עקרוני מתיר סינתזת צעד אחד של אנלוגים trehalose לבין מקבילי גלוקוז וגלוקוז-1-פוספט 6, 16, 17. למרות שגישה זו עשויה להיות הבטחה עתידית, הן TrePs ההיפוך והשמירה כרגע יש חסרונות לסינתזה אנלוגית. לדוגמה, TrePs היפוך יש expe להחרידמולקולת תורם nsive (β-D- גלוקוז 1-פוספט) ו TrePs שמירה יש תשואות ביטוי אנזים עניה / יציבות הפקרות מצע מוגבלת. שיפורים משמעותיים (למשל, באמצעות הנדסת אנזים) יהיה צורך לפני הסינתזה אנלוגית בתיווך TreP הוא מעשי. כיום, הגישה המעשית ביותר לסינתזה האנזימטית של אנלוגים trehalose היא להשתמש synthase trehalose (TreT) אנזים, אשר ממירה דיפוספט גלוקוז uridine (UDP) -glucose לתוך trehalose בתוך יחיד בשלב 6. אנחנו דיווחנו לאחרונה על שימוש Thermoproteus Tenax TreT-אנזים thermostable ו חד כיווני 18 -כדי לסנתז אנלוגים trehalose לבין מקבילי גלוקוז ו- UDP-גלוקוז (איור 3) 19. אנזים זה פועל רק בכיוון הסינטטי ימנע את הבעיה של שפלת trehalose נמצאת במערכת TreP. coul תגובה חד-שלבית זוd להסתיים 1 שעה, ועוד מגוון רחב של אנלוגים trehalose היו לגשת בתשואה גבוהה (עד&gt; 99% כפי שנקבע על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC)) מ מצעים אנלוגיים גלוקוז זמינים (ראה לוח 1 נציג התוצאות סָעִיף). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg"> איור 3: סינתזת צעד אחד TreT-זרז של אנלוגים trehalose. האנזים TreT מהטי Tenax יכול stereoselectively להצטרף אנלוגים גלוקוז זמינים ו- UDP גלוקוז כדי ליצור אנלוגים trehalose בצעד אחד. R 1 -R 4 = שינוי המבנים משתנים, למשל azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochemical, או שינויי תווית איזוטופי; Y = heteroatom משתנה, למשל חמצן או גופרית, או isotopically שכותרתו heteroatom. כאן, אנו מספקים מודעהפרוטוקול etailed עבור תהליך סינתזת TreT, כוללים ביטוי וטיהור TreT מן E. coli, אופטימיזציה תנאי תגובת TreT, וכן שיטת טיהור משופרת כי מתבצעת לחלוטין בשלב המימי. פרוטוקול שונה זו מאפשר סינתזה וטיהור ומועילות ויעילה של אנלוגים trehalose המגוונים בסולם למחצה preparative (10-100 מ"ג). כמו כן, אנו מדגימים את השימוש בפרוטוקול זה להכנה ונהל בדיקה מבוססת-trehalose כדי mycobacteria בתוך פחות משעה 1, הדבר שאפשרה גילוי הקרינה המהיר של תאי mycobacterial.

<table><tbody><tr><td>LB אגר</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>L24021</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין מלח נתרן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>מרק לוריא</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>L24045</td><td></td></tr><tr>מוצרי מחקר<td>מרק נהדרים</td><td>בינלאומיים</td><td>T15050</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-ערבינוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>מלח חוצץ</td><td>פוספט GE Healthcare</td><td>SH30256</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט, מסנן מזרק מונו-בסיסי</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>, 0.45 ומיקרו; m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09719D</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז מיני טבליות, ללא EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap עמודת זיקה ניקל HP, 5 מ"ל</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>TRIS בסיס ultrapure</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה, MWCO 12&ndash; 14,000</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>21-152-16</td><td></td></tr><tr><td>אנלוגים של גלוקוז</td><td>CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td><td></td><td>דוגמאות לספקים המציעים אנלוגים רבים של גלוקוז</td></tr><tr><td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td><td>CarboSynth</td><td>MA02620</td><td></td></tr><tr><td>UDP-Glucose</td><td>abcam Biochemicals</td><td>ab120384</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Amicon אולטרה-15 יחידת סינון צנטריפוגלי</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rex RG 501-X8 שרף חילופי יונים מעורב</td><td>Bio-Rad</td><td>444-9999</td><td></td></tr><tr><td>מדיה ביו-ג'ל P2 עדינה במיוחד</td><td>Bio-Rad</td><td>150-4118</td><td></td></tr><tr><td>לוחות כרומטוגרפיה בשכבה דקה של ג'ל סיליקה בגיבוי זכוכית</td><td>EMD Millipore</td><td>1056280001</td><td></td></tr><tr><td>n-בוטנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A399</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר S25310A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי חומצה גופרתית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0145</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום, 99.8%</td> <td>אקרוס אורגניקס</td><td>351430075</td><td></td></tr><tr><td>עמודת אמינופרופיל HPLC</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>58338</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>פרה-פורמלדהיד</td><td>טד פלה</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>אלקין-488</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>761621</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-יל)מתיל]אמין (TBTA)</td><td>קליק כלים כימיים</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>tert-בוטנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>פלואורומאונט-G הרכבה בינונית</td><td>דרום ביוטכנולוגיה</td><td>10001</td><td></td></tr></tbody></table>

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

מבחינה כימית גרסאות מותאמות של trehalose, או אנלוגים trehalose, יש יישומים בביולוגיה, ביוטכנולוגיה, ומדע התרופות, בין שדות אחרים. למשל, אנלוגים trehalose נושאות תגים לזיהוי שימשו לגילוי שחפת Mycobacterium ייתכן יישומים כסוכני הדמיה לאבחון שחפת. גרסאות יציבה hydrolytically של trehalose גם אלה נשאפים בשל הפוטנציאל שלהם לשמש ממתיקים שאינם הקלורי וסוכני מוגני ביו. למרות הערעור של מש&#39; זו של חומרים עבור יישומים שונים, את הפוטנציאל שלהם נשאר בלתי ממומש בשל חוסר מסלול חזק לייצור שלהם. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפורט לסינתזת biocatalytic צעד אחד המהירה ויעילה של אנלוגים trehalose שעוקפת את הבעיות קשורות סינתזה כימית. על ידי ניצול של synthase trehalose thermostable (TreT) האנזים מן Thermoproteus Tenax, אנלוגים trehalose יכול להיות generatאד בשינה בצעד אחד לבין מקבילי גלוקוז וגלוקוז דיפוספט uridine בתשואה גבוהה (עד מרה כמוני) ב 15-60 דקות. פרוטוקול טיהור פשוט ומהיר ללא chromatographic, אשר מורכב של דיאליזת ספין חילוף יונים, יכול לספק אנלוגים trehalose רבים של ריכוז ידוע בתמיסה מימית קטן כמו 45 דקות. במקרים בהם אנלוגי גלוקוז unreacted עדיין נשאר, טיהור chromatographic של המוצר אנלוגי trehalose יכול להתבצע. בסך הכל, שיטה זו מספקת פלטפורמת biocatalytic &quot;ירוקה&quot; לסינתזה המזורזת וטיהור אנלוגים trehalose כי הוא יעיל ונגיש-כימאים לא. כדי להדגים את תחולתה של שיטה זו, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה, כל-מימית טיהור, והמינהל של בדיקה הכימיה לחץ מבוסס-trehalose כדי mycobacteria, שכולן לקח פחות משעה 1 ואפשרה גילוי הקרינה של mycobacteria. בעתיד, אנו צופים כי, בין othאה יישומים, פרוטוקול זה ניתן להחיל את הסינתזה המהירה של בדיקות מבוססות trehalose לאבחון שחפת. למשל, נמשך זמן קצר אנלוגים trehalose שונים-רדיונוקלידים (למשל, 18 F-modified trehalose) יוכל לשמש עבור שיטות הדמיה קליניות מתקדמות כגון טומוגרפיה-טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים (PET-CT).

ט Tenax TreT התקבל בחיידק הזה תשואה של כ -4 מ"ג / L להשתמש בביטוי חלבון סטנדרטי טכניקות טיהור. צעד כרומטוגרפיה זיקת ניקל יחיד היה מספיק כדי לטהר TreT מן lysate coli (עקבות FPLC נציג מוצגות באיור 4). כפי שנקבע בפרסום הראשוני שלנו על תהליך הסינתזה TreT, רקומביננטי ט Tenax TreT הוא מסוגל להמיר רחבה של אנלוגים-רבים גלוקוז מגוון אשר הזמינים באופן מסחרי-אל אנלוגים trehalose להתכתב עם יעילות גבוהה <sup ...

אנלוגים של טרהלוז מתגלים כמולקולות חשובות ליישומים ביולוגיים וביו-רפואיים. אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לסינתזה וטיהור אנזימטית של אנלוגים של טרהלוז שהוא פשוט, יעיל, מהיר וידידותי לסביבה. יישומו לייצור וניהול מהיר של בדיקה לזיהוי מיקובקטריות מודגם.

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לסנתז ולטהר במהירות אנלוגים של טרהלוז שיש להם יישומים אפשריים החל מזיהוי חיידקים פתוגניים ועד לשימור חומרים ביולוגיים. זוהי שיטה מהירה ומניבה גבוהה המספקת גישה לאנלוגים של הטרהלוז הדו-סוכר. לתרכובות אלו יש יישומים מבוססים ומתפתחים שונים במחקר ביו-רפואי וביוטכנולוגי.שיטה זו מורכבת מסינתזה אנזימטית בשלב אחד וטיהור מימי לחלוטין. יחד, נהלים אלה עוזרים לטפל בכמה מהחסרונות של סינתזות כימיות מסורתיות של אנלוגים של טרהלוז שיכולים להיות ארוכים, מניבים נמוכים ושליליים מבחינה סביבתית. ההשלכות של שיטה זו עשויות להתרחב למחקר ואבחון של שחפת מכיוון שאנלוגים של טרהלוז מותאמים שימשו להדמיית מיקרובקטריום טוברקולוזיס, הגורם לשחפת.שיטה זו יכולה גם לעזור להאיץ את הסינתזה וההערכה של אנלוגים של טרהלוז ליישומים אפשריים אחרים כגון שימור מוצרים ביולוגיים ושימוש כממתיקים ללא קלוריות. לפני תחילת ההליך, הכינו תרבית לילה של E.coli המבטא TreT. כדי להתחיל בהליך הביטוי TreT, הניחו 750 מיליליטר של מדיום גידול שחפת בבקבוק תרבית פרנבך של 2,800 מיליליטר וחיטויו אותו.הוסף אמפיצילין למרק כדי להשיג ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר. השג קובטות לספקטרוסקופיה של UV-vis ומלא קובטה אחת במרק מהבקבוק כריק. לאחר מכן, הוסיפו לבקבוק שלושה מיליליטר של תרבית הלילה המוכנה של E.coli המבטאת TreT.דגרו את הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול ב-200 סל"ד. בדוק את ספיגת המרק ב -600 ננומטר כנגד המרק הריק מעת לעת. כאשר ערך הספיגה ב-600 ננומטר הוא בין 0.5 ל-1.0, הוסף 750 מיקרוליטר של ארבינוז לבקבוק כדי לגרום לביטוי TreT.דגרו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה תוך כדי טלטול ב-200 סל"ד. לאחר מכן, הניחו את התרבות בבקבוק צנטריפוגה מפוליפרופילן ליטר אחד וצנטריפוגה את התרבות בטמפרטורה של 4,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במי מלח של 15 מיליליטר פוספט.העבירו את המתלה לצינור צנטריפוגה חרוטי וצנטריפוגה באותם תנאים. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט ובמידת הצורך אחסנו את הגלולה במינוס 80 מעלות צלזיוס. ממיסים טבלית מיני מעכב פרוטאז ב -20 מיליליטר של מאגר כביסה.הוסף את תמיסת מעכב הפרוטאז לגלולה ומערבל את התערובת כדי להשעות מחדש את הגלולה. העבירו את המתלה לכוס של 100 מיליליטר. לאחר מכן, סוניקציה של המתלה כדי למקם את התאים הממקמים את הגשושית כסנטימטר אחד מתחתית הכוס.מניחים את הליזאט בצינור חרוטי מתכתי ומצנטריפוגה את הליזאט ב -15, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. מסננים את הליזאט בעזרת פילטר מזרק. בודד את TreT על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון והעריך את הטוהר עם דף SDS.לאחר מכן החלף את TreT למאגר Tris על ידי דיאליזה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי ליצור את תמיסת TreT לסינתזה אנלוגית של טרהלוז. אוספים את הריק משטיפת הדיאליזה. קבע את ריכוז ה-TreT על ידי ספקטרוסקופיה UV-vis כנגד ריק הדיאליזה.כדי להתחיל בסינתזה של 6-אזידו-טרהלוז באמצעות TreT בסולם של 20 עד 30 מיליגרם, הנח 0.08 מילימול 6-אזידו-גלוקוז, 0.16 מילימול UDP-גלוקוז ו-0.08 מילימול מגנזיום דיכלוריד בצינור חרוטי של 15 מילימטר. הוסף את מאגר TreT ו-Tris. מדללים את התערובת עם Tris buffer לפי הצורך כדי להשיג ריכוז אנזים של 300 מיקרוגרם למיליליטר בנפח סופי של ארבעה מיליליטר.מכסים והופכים את הצינור כדי להמיס את המוצקים. דגרו את תערובת התגובה למשך שעה ב-70 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור ב-300 סל"ד. במהלך הדגירה, הכניסו שלושה מיליליטר מים נטולי יונים ליחידת מסנן צנטריפוגלית של 10 קילודלטון וצנטריפוגה ב-3,000 פעמים G עד שכל הנוזל נמצא בצינור.חזור על הכביסה פעמיים נוספות כדי להבטיח שטיפה יסודית של יחידת המסנן. בסיום התגובה, מצננים את התערובת לטמפרטורת החדר על קרח. לאחר מכן העבירו את תערובת המוצר ליחידת המסנן הצנטריפוגלי.שטפו את צינור התגובה במים נטולי יונים של מיליליטר שלוש פעמים והעבירו כל שטיפה ליחידת המסנן הצנטריפוגלי. צנטריפוגה את התערובת ב -3, 000 פעמים G עד שכל הנוזלים עברו לצינור. הוסף שלושה מיליליטר מים דה-יונים ליחידת המסנן ולצנטריפוגה שוב באותם תנאים.יש לחזור על השטיפה לפי הצורך כדי למקסם את התאוששות המוצר. הוסף שלושה גרם שרף חילופי יונים מעורב לסינון. מערבבים את התערובת עם מוט ערבוב בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר ערבוב יש לשפוך ולסנן את הסופרנטנט. שוטפים את השרף בחמישה מיליליטר מים דה-יונים ומסננים את השטיפה. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך כדי למקסם את התאוששות המוצר ולשלב את כל המסננים.רכז את הסינון המשולב. לאחר מכן כדי לבדוק אם יש מבשר 6-GlcAz שלא הגיב, הכינו צלחת TLC סיליקה ג'ל עם כתמים של 6-GlcAz, 6-TreAz, המוצר המרוכז ונקודה משותפת. מפתחים את הצלחת בתערובת של n-בוטנול, אתנול ומים נטולי יונים.לאחר שהצלחת יבשה, דמיינו את הכתמים על ידי טבילת הצלחת בחומצה גופרתית של 5% ואתנול וחימום הצלחת על פלטה חמה בהגדרה גבוהה למשך כחמש דקות. אם נצפה מבשר שלא הגיב, טהר את תערובת המוצרים בעמודת אי הכללת גודל וחזור על ניתוח TLC. לאחר קבלת האנלוגיה הטהורה של טרהלוז, הסר מים כדי להשיג את המוצר המיובש 6-TreAz.סטריאו האנזים TreT מצטרף באופן סלקטיבי לאנלוגי הגלוקוז ול-UDP-גלוקוז כדי ליצור את אנלוגי הטרהלוז המתאים. היקף התגובה כולל שינויים כימיים סטריאו deoxifluoro, thio ו-azido. עם זאת, מחליפים בעמדה הרביעית בטבעת נסבלים פחות.באמצעות הליך זה, אנלוגי הגלוקוז 6-GlcAz הומר כמותית לאנלוגי הטרהלוז 6-TreAz תוך פחות מ-60 דקות כפי שאושר על ידי TLC. המוצר הטהור בודד בשיטת טיהור חילופי יונים של דיאליזה ספין לא כרומטוגרפית והתאפיין בתמ"ג ב-HPLC. לאחר מכן נעשה שימוש בתמיסת 6-TreAz הטהורה לביצוע תיוג אזיד של חיידק המודל M.smegmatis.תיוג פלואורופור לאחר מכן על ידי תגובה כימית קליק עם אזידים על פני התא הראה כי M.smegmatis עם טרנספורטר טרהלוז פונקציונלי סומן בהצלחה עם אזידים בעוד שהזן ללא אזידים לא. לאחר השליטה, ניתן לבצע את תגובת הזרז של ה-TreT והטיהור שלאחר מכן תוך שעה עד ארבע שעות, בהתאם למספר שלבי השטיפה המשמשים למקסום התאוששות הייצור. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי תמיד יש לנתח את תוצר התגובה על ידי NMR ו-TLC או HPLC כדי לאשר את טוהר ומבנהו.לאחר הליך זה, ניתן להעריך או להשתמש באנלוגי הטרהלוז המסונתז כבדיקת הדמיה חיידקית, עוקב מטבולי, מעכב אנזים או חומר מייצב ביו-מולקולה. שיטה זו מספקת דרך לחוקרים להכין אנלוגים של טרהלוז עם שינויים כגון איזוטופ יציב או תוויות רדיואיזוטופים. בסך הכל, התרכובות הנגישות בשיטה זו אמורות להיות שימושיות במחקר שחפת ובתחומי מחקר ביו-רפואיים אחרים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא ולטהר את האנזים TreT, להשתמש ב- TreT כדי לסנתז אנלוגים של טרהלוז בשלב אחד ולטהר את המוצרים האנלוגיים של טרהלוז.

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

במאמר זה, שיטת תפוקה גבוהה מוצג לסינתזה של אוליגוסכרידים ו חיבורן אל פני השטח של חלקיקים polyanhydride לשימוש נוסף מיקוד קולטנים ספציפיים על תאים מציגי אנטיגן.

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

גליקוזידים של אינדוקסיל הם כלים מבוססים ונמצאים בשימוש נרחב לסינון אנזימים ולניטור פעילות אנזימים. במיוחד עבור מבנים מסוג גלוקוז, סינתזות קודמות הוכיחו את עצמן כמאתגרות ומניבות נמוכות. הגישה החדשנית שלנו משתמשת באסטרים של חומצה אינדוקסילית כחומרי ביניים יקרים כדי להניב מספר ניכר של גליקוזידים אינדוקסיל בתשואות טובות.

סינתזה של Indoxyl-גליקוזידים לאיתור של פעילויות glycosidase

בגישה מודולרית הסינתזה של N- glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

2-azido-1-חנקת-אסתר ניתן להמיר את המקביל 2-azido-1-trichloroacetimidate בהליך סיר אחד. המטרה של כתב היד היא להדגים את השירות של הכור מיקרוגל בסינתזה של פחמימות.

סיר אחד בסיוע מיקרוגל ההמרה של חנקת Anomeric-אסטרים Trichloroacetimidates

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים מאת regioselective O- גליקוזילציה של ribonucleosides באמצעות הגנה זמנית של שלהם 2', 3'-diol moieties ניצול של אסתר boronic מחזורית. שיטה זו חל על מספר נוקלאוזידים לא מוגן כמו אדנוזין, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine 5-fluorouridine לתת נוקלאוזידים דו-סוכר המתאימים.

Regioselective O- גליקוזילציה של נוקלאוזידים via זמני 2', 3'-Diol הגנה על ידי אסתר Boronic לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בתוכנת Auto-CHO לסינתזה הירארכית וניתנת לתיכנות של oligosaccharides. כמו כן, הוא מתאר את הנוהל הכללי לניסויים בקביעת RRV וגליקוציה של סיר אחד של SSEA-4.

הירארכי וניתן לתיכנות Oligosaccharide סינתזה של סיר אחד

הליכים ניסיוניים מייצגים לתוספת של אמין נוקלאופילים לטריקרבוניל (טרופון) ולאחר הדרומטוזיס של התסביכים המתקבלים מוצגים בפרוטרוט.

הכנת 6-האמילוציהועד 2, 4-דיין-1-הנגזרים באמצעות טריקרבוניל (טרופון) ברזל

CO2 שינויי צורה מתנהלים בתהליך של שני שלבים לסינתזה של מולקולות מורכבות. סלקטיבית 4 e- הפחתה של CO2 עם הידרובוראן ההידרוסטנט מעניקה bis והרב תגובתי (boryl) acetal ביניים אשר מעורב לאחר מכן התגובה התעבות או carbene מתווך c-c הדור צימוד.

CO רב-תכליתי2 העתקות לתוך מוצרים מורכבים: אחד-סיר 2-צעד אסטרטגיה

אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים הם מרכיבים הנמצאים בכל מקום במסלולים ביולוגיים חיוניים וראו שימוש הולך וגובר ביישומי ביוטכנולוגיה. כאן אנו מתארים טכניקות לסינתזה וטיהור שגרתיים של אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים, החל מאוליגונוקלאוטידים שהוכנו על ידי טכניקות סינתזה אוטומטיות סטנדרטיות.

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

למד סינתזה אנזימטית מהירה של אנלוגי טרהלוז בצעד אחד עם טיהור במים בלבד. שיטה זו מספקת תשואה גבוהה וידידותית לסביבה לייצור חומרי גילוי למיקובקטריה ולמחקר שחפת.

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

גלה סרטונים נוספים