Name: הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב גין או טיפול תרופתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למדו להעריך את היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לייצור HIV-1. השיטה מאפשרת סינון מהיר של עיצובי RNA חדשים לטיפול גני או תרופתי בנגיף HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה המוצגת כאן נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (מעניק DCB-120,266, PPP-133,377 ו HBF-348,967 ל AG).

1. תאי transfections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי HEK 293T במדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. כן השעית 2 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום תרבית תאים. הוספת 500, 100 ו -1,000 μl של השעיה התא היטב כל 24 גם, 96-היטב צלחות 12-היטב, לייצור ויראלי, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הצלחות דגירה אותם O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לגדל תאים כדי 50-70% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פי תוכנית transfection, להכין דילולים של RNAs מבחן ובקרות שלהם ב 1.5 צינורות מיקרו מ&quot;ל (דוגמה, איור 2B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay הייצור ויראלי, להכין 10 ng / דילול μl של פלסמיד ביטוי HIV-1 ולהוסיף 10 μl על צינור אחד. הבא להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הניסיוני RN בקרה שליליא להוסיף 2.5 או 10 μl של כל RNA מבחן ודילול בקרה שלילי על הצינורות המקביל עבור 25 או 100 ריכוזים סופיים ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay כדאיות התא, להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה דילול 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של RNA בקרה חיובית, משקל מולקולרי נמוך אני פוליפוני: C. הוסף 2 μl של רנ&quot;א בדיקה או דילולי RNA הבקרה חיוביים על הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 ריכוזים סופיים מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay ההפעלה החיסוני, להוסיף 20 μl של רנ&quot;א בדיקה או דילולי RNA בקרה חיוביים מוכנים בשלב 1.3.2. אל הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 מיקרוגרם / ריכוזיים סופי מיליליטר, בהתאמה. הערה: פלסמידים ביטוי RNA בדיקות, להכין 10 ng / דילולים μl במקום של 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה, מתן הסכומים הסופיים של 25 ו -100 ng עבור צעד 1.3.1. ו -100 ng לצעדים 1.3.2. ו 1.3.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50, 25 או 75 μl של DMEM על צינור אחד transfection למוצרים ויראליuction, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה. מבחני ההפקה ויראלי, להביא תאים וצינורות transfection מוכן מעבדה ביו בטיחות ברמה 3 (BSL3) לפני השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של ברצף מגיב transfection אל צינורות transfection דגירה 15 עד 20 דקות, כדי לאפשר מתחמי הטופס. ראה הטבלה של חומרים עבור מגיב transfection הספציפי כדי לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת transfection כולו מהצינור כל מיקרו-חכם ירידה לעמדות המקביל צלחות תרבית תאים. מערבולת בעדינות דגירה הצלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ייצור HIV-1 (סעיף 2), כדאיות התא (סעיף 3) והפעלה החיסונית (סעיף 4) ב צלחות תרבית תאים (איור 2 ג). </li></ol> 2. Assay הפקה ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות תרבית תאי 24 גם מן החממה בעדינות מערבולת הצלחות בתוך תרבית תאי BSL3מכסה מנוע. עבר 150 μl של supernatant מכל טוב על תואמים היטב צלחת תחתית שטוחה 96-היטב, אשר תשמש לכמת ייצור HIV-1. הערה: מבחני כימות ויראלי נפוצות כוללות מדידת ביטוי של חלבון קפסיד HIV-1 (p24) על ידי assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 20, לכימות רנ&quot;א נגיפי על ידי RT-PCR (RT-PCR) 21 ומדידת פעילות של האנזים RT HIV-1. צעדים 2.2 ל 2.5 להסביר שיטות לכמת HIV-1 RT פעילות 13,15,16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 5 μl של supernatant כדי מקביל בארות בצלחת 96-היטב, המכיל 25 μl של קוקטייל שיבוש ויראלי 15 (טבלה 1). דגירה את התערובת במשך 5 דקות ב RT ולהעביר את הצלחת לתחנת עבודת רדיואקטיביות. הערה: שלב 2.2. יש צורך רק אם לא זמינה עבודת רדיואקטיביות היא במעבדת BSL3. אם הצלחות לא צריכות תיוסרנהמעבדת BSL3, המשך לשלב 2.3. ולהוסיף 50 μl של קוקטייל שיבוש רדיואקטיביים / ויראלי (טבלה 1) במקום 25 μl של קוקטייל רדיואקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן רדיואקטיבי קוקטייל 15 (1 טבלה), ולהוסיף 25 μl היטב כל supernatant ויראלי קוקטייל הפרעה. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 5 μl של תערובת התגובה על ריבועים מקבילים סיבי זכוכית Di אתיל אמינו אתיל (DEAE) נייר filtermat ולאפשר הכתמים להתייבש במשך 10 דקות. ספוט את תערובת התגובה על כל ריבוע אחר כך ששתי אין דגימות ישירות דייר אחד אחרת. זה עוזר למנוע מעל הכלאה בין דגימות בעת קביעת ספירת לדקה (CPM) בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העיתונים 5x במשך 5 דקות עם חיץ נתרן ציטרט מלוחים 2x (SSC) (טבלה 1), ואחריו שני שוטף 1 דקות עם אתנול 95%. אפשר בעיתונים להתייבש ולאטום אותם בשקיות מדגמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף שקיות מדגם קליפntaining נייר filtermat לתוך קלטת והכניס את הקלטת לתוך מונה נצנץ microplate. הגדר הדלפק לקרוא לדקה עבור 32 P עם התאריכים להשוואה סיפק עבור אצוות של [32 P] dTTP השתמשו בניסוי. בחר בו שימוש בדגימות לקרוא באמצעות מפת צלחת ולהתחיל הדלפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל שיטת כימות ויראלי, לחלק את הערכים שהתקבלו עבור כל RNA בדיקה על ידי הביקורת השלילית הסמוכה להכפיל ערך זה על ידי 100 כדי לקבל את עיכוב אחוז הייצור HIV-1 עבור כל לשכפל של RNAs הבדיקה. דוגמה לתוצאות השוואת RNAs מבדקים שונים בריכוזים שונים מסופק באיור 3. </li></ol> Assay כדאיות התא 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 96-גם הצלחות מן החממה ולהוסיף 20 μl של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​MTT (3- [4.5-דימתיל-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium ברומיד) מדולל בופר פוספט של Dulbecco ( DPBS) זה טוב. דגירת צלחות fאו 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של isopropanol acidified עם חומר ניקוי (1% NP-40, 4 מ&quot;מ HCl ב isopropanol) זה טוב דגירה צלחות במשך שעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הספיגה ב 570 ננומטר ב ספקטרופוטומטר microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את חילוף חומרי MTT ביחס לכל RNA מלא בדיקה חיובי על ידי חלוקת הערך המתקבל עבור כל דגימה על ידי שליטת transfection הסמוכה לה. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 4. </li></ol> 4. Assay ההפעלה החיסונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 12 גם הצלחות מן החממה לשאוב את התקשורת והתרבות. לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS ולהוסיף 70 μl של חיץ תמוגה קר 22 (כולל מעכבי פרוטאז ו phosphatase, טבלה 1) זה טוב. דגירת הצלחות עבור 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר lysates תא צינורות המייקר ומהר להקפיא אותם על ידי טבילהצינורות בחנקן נוזלי. אפשר הדגימות להפשיר וחזרו על 2 יותר מחזור הפשרת הקפאה עבור סכום כולל של 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates במשך 15 דקות ב 4 ° C, 15,700 XG, כדי גלולה פסולת התא. מעבירים את supernatant צינורות מיקרו חדש ולקבוע את ריכוז החלבון באמצעות כחול Coomassie (ברדפורד) שיטה 23,24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתור 75 מיקרוגרם של חלבון מכל מדגם ב ג&#39;ל polyacrylamide denaturing 10% ולהעביר אל קרום nitrocellulose כפי שתואר לעיל 25,26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אלקטרופורזה ולהעביר קרום, לחשוף להקות חלבון על ידי דוגרי קרום Ponceau S (לוח 1) 1 דקות ואחריו כביסה במים מזוקקים פעמים. השתמש להקות סולם חלבון כמדריך לחתוך את הממברנה 80 ו -55 kDa. הערה: בשלב 4.4 דגימות ניתן להריץ על 16 x 18 ס&quot;מ 2 ג&#39;לים עד 34 kDa, כך שזה קל לחתוך את הקרום על העמדות שצוינו ולא לחתוך דרךלהקות של עניין. לחלופין, כמה ג&#39;לים ניתן להפיק דגימות אותו כדי למנוע חיתוך הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב את מכתים Ponceau S עם מי מלח שנאגרו טריס המכיל 0.05% Tween 20 (TBST, טבלה 1). להוסיף TBST עם 5% חלב דל שומן על מנת לכסות את הקרום לחלוטין. דגירה ממברנות ב RT עם תסיסה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ממברנות O / N ב TBST עם אלבומין בסרום שור 3% (BSA) ונוגדנים מדולל ל -1 מכל 1,000 נגד ADAR1 (110 ו -150 KDA), phospho-PKR (62 KDA), ו phospho-IRF3 (47 KDA), עבור החלקים העליונים, אמצעיים ותחתונים של הממברנה, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ממברנות 5x במשך 5 דקות עם TBST ו דגירה ב TBST עם חלב 5% דל שומן ו נוגדנים משני נגד ארנב עז שכותרתו peroxidase (מדולל ל 1 ב 5000) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 5x ממברנות במשך 5 דקות עם TBST ולהחיל electrochemiluminescence פתרון (ECL) כדי להמחיש את הלהקות על סרטים על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לדמיין את להקות חלבון על סרטים, לשטוף את החלקים באמצע ההר ובתחתית הממברנה במשך 10 דקות עם פתרון הפשטת נוגדן. הדגירה ממברנות O / N ב TBST עם 3% BSA ונוגדנים נגד PKR הכולל (ב 1 ב 500) ו IRF3 (ב -1 מכל 1,000), עבור באמצע והחתיכות תחתונות, בהתאמה. חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות העכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד ארנב עבור קרום PKR (באמצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הפיסה התחתונה של 5x הקרום למשך 5 דקות עם TBST ו דגירת הממברנה ב TBST עם BSA 3% במשך שעה 1 עם נוגדן נגד אקטין (מדולל ל 1 ב 5000). חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות עכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד הארנב. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 5. ראה הטבלה של חומרים עבור הנוגדנים הספציפיים כדי לשמש. </li></ol>

<ol><li>Hoxie, J. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+and+gene+therapies+for+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Novel cell and gene therapies for HIV.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).</li>
<li>Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+approaches+for+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection.</a> Genome Med. 7, 50(2015).</li>
<li>Allers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+cure+of+HIV+infection+by+CCR5Delta32%2FDelta32+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation.</a> Blood. 117, 2791-2799 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hematopoietic+stem+cell+based+gene+therapy+for+HIV-1+infection%3A+considerations+for+proof+of+concept+studies+and+translation+to+standard+medical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice.</a> Viruses. 5, 2898-2919 (2013).</li>
<li>Burke, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Cellular+Resistance+to+HIV-1+Infection+In+Vivo+Using+a+Dual+Therapeutic+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).</li>
<li>Scarborough, R. J., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+Ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV and Ribozymes.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).</li>
<li>Eekels, J. J., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+durable+treatment+of+HIV-1+infection+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).</li>
<li>Blazquez, L., Fortes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+interference+%28U1i%29+for+Antiviral+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).</li>
<li>McIntyre, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((96+shRNAs+designed+for+maximal+coverage+of+HIV-1+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants.</a> Retrovirology. 6, 55(2009).</li>
<li>Sajic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+snRNAs+to+inhibit+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication.</a> Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE-directed+discovery+of+potent+shRNA+inhibitors+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1.</a> Mol Ther. 20, 820-828 (2012).</li>
<li>Scarborough, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Conserved+Target+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+is+Accessible+to+Inhibition+by+Both+an+HDV+Ribozyme+and+a+Short+Hairpin+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).</li>
<li>Lainé, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+cleavage+of+HIV-1+RNA+by+new+SOFA-HDV+ribozymes+and+their+potential+to+inhibit+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication.</a> RNA Biol. 8, 343-353 (2011).</li>
<li>Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Evaluation+of+Clinically+Relevant+SOFA-HDV+Ribozymes+Targeting+HIV+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA.</a> Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).</li>
<li>Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Inhibition+of+HIV-1+Production+by+Short+Hairpin+RNAs+and+Small+Interfering+RNAs+Targeting+a+Highly+Conserved+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+Is+Optimized+by+Evaluating+Alternative+Length+Formats%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).</li>
<li>Sarzotti-Kelsoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+the+TZM-bl+assay+for+standardized+assessments+of+neutralizing+antibodies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1.</a> J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).</li>
<li>Campos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+lasting+control+of+viral+rebound+with+a+new+drug+ABX464+targeting+Rev+-+mediated+viral+RNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis.</a> Retrovirology. 12, 1-15 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+inactivates+latent+HIV-1+proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA.</a> Retrovirology. 12, 22(2015).</li>
<li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4%28%2B%29-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue%2C+a+major+site+of+replication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li>
<li>Shan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PCR+assay+for+quantification+of+HIV-1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA.</a> J Virol. 87, 6521-6525 (2013).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PKR+activator%2C+PACT%2C+becomes+a+PKR+inhibitor+during+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication.</a> Retrovirology. 10, 96(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Battisti, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+activity+between+the+trans-activation+response+RNA-binding+protein%2C+TRBP2%2C+and+cyclin+T1+on+HIV+type+1+expression+and+viral+production+in+murine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).</li>
<li>Bannwarth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+TRBP1+promoter+by+NF-Y+transcription+factor+in+lymphocytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes.</a> J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+interacts+with+PKR+during+human+immunodeficiency+virus+infection+of+lymphocytes+and+contributes+to+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication.</a> J Virol. 83, 10119-10128 (2009).</li>
<li>Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+translation+and+its+regulation+by+cellular+factors+PKR+and+PACT%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT.</a> Virus Res. 193, 65-77 (2014).</li>
<li>ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+HIV-1+with+RNA+interference%3A+a+multiple+shRNA+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach.</a> Mol Ther. 14, 883-892 (2006).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+design+and+validation+of+antiviral+siRNA+for+targeting+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 80(2007).</li>
<li>Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+RNA+splicing+and+inhibition+of+HIV-1+replication+induced+by+modified+U1+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs.</a> J Virol. 84, 12790-12800 (2010).</li>
<li>Chang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+and+HIV-1+inhibition+of+chimeric+tRNA%28Lys3%29-ribozymes+under+dual+U6+snRNA+and+tRNA+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters.</a> Mol Ther. 6, 481-489 (2002).</li>
<li>Chang, L. J., Liu, X., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+siRNAs+targeting+multiple+highly+conserved+RNA+sequences+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1.</a> Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).</li>
<li>Daniels, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li>
<li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li>
<li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+adaptors+result+in+reduction+of+multiple+pre-mRNA+species+principally+by+sequestering+U1snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP.</a> Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).</li>
<li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+interferon+response+by+siRNA+is+cell+type-+and+duplex+length-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent.</a> Rna. 12, 988-993 (2006).</li>
<li>Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+or+stimulation%3F+siRNA+delivery+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

את assay ייצור HIV-1 תיאר בוצעה באמצעות תאים HEK293T (איור 2), והוא דומה מבחני לשמש מסך HIV-1 RNA עבור ribozyme שנכנס לתוקף ב -13, shRNA 10,29, siRNA 30, ו U1i RNA 11,31 אתרי היעד. באמצעות שיטות שונות כדי לכמת ייצור HIV-1, רוב המחקרים מדדו ייצור ויראלי 48 שעות לאחר שיתוף transfection של פלסמיד ביטוי HIV-1 עם RNAs מועמד. בעקבות ייצור של HIV-1, virions בשלה לעבור מחשוף פרוטאוליטים של polyproteins שלהם על ידי הפרוטאז של ה- ...

הגבלה של טיפולי HIV-1 הנוכחיים היא שהם צריכים להתנהל באופן כרוני כדי למנוע התקדמות מחלה. להשתלות של HIV-1 עמיד לימפוציטים T, או תאי גזע hematopoietic, יש את הפוטנציאל לספק בקרה לטווח ארוך של שכפול HIV-1 בהעדר טיפול תרופתי 1,2 ויכול גם להיות גישה יעילה להשיג תרופה HIV-1 3. דרך אחת להפוך תאים עמידים שכפול HIV-1 היא להכניס גנים אחד או יותר קידוד עבור אנטי HIV-1 RNAs או פפטידים לתוך התאים של אדם שנדבק במהלך השתלה עצמית 4. כמה המועמד גנים אנטי HIV-1 עוצבו עם כמה ניסויים קליניים נכנסים שילובים של שני 5 או שלוש 6, כדי למנוע התפתחות של עמידות HIV-1 לכל גן יחיד. RNAs-1 נגד HIV הוא בין המועמדים הבולטים עבור ריפוי גנטי שילוב בשל הפוטנציאל הנמוך שלהם לעורר תגובה חיסונית ובגלל שהםמשועתק מתוך רצפי גנים מאוד קצרים. חלק RNAs נגד HIV-1 עוצב למקד כניסה ושילוב ויראלי. עם זאת, רוב RNAs נגד HIV-1 למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור החיים של הנגיף (איור 1). מעכבי פוסט אינטגרציה כוללים RNAs דמה, מיקוד חלבונים רגולטוריים HIV-1 טאט או Rev 1, ו RNAs מבוססי antisense, מיקוד אתרים שונים HIV-1 RNA, כגון ribozymes 7, shRNAs 8 ו U1i 9 RNAs. שיטות שנוצלו כדי להשוות את היעילות של RNAs נגד HIV-1 כוללות ניטור שכפולה נגיפית בתאי transduced עם גני מקודדי RNAs מועמד למדידת ייצור נגיפי בתאי transfected זמני עם פלסמידים להביע RNAs מועמד פלסמיד ביטוי HIV-1 10 -13. השתמשנו בעבר assay ייצור HIV-1 להקרין HIV-1 RNA עבור אתרי היעד ribozyme חדש 13-15. שיטות אלה שוכללו מאז כדי לייעל את הפורמט של RNAמולקולת פרעות הביעה מ- DNA פלסמיד כקובץ shRNA או נמסרה בתור siRNA סינטטי 16. את assay מודד את הייצור של וירוסים בוגרים מן הכליות עובריות אנושיים (HEK) תאי 293T, וניתן להשתמש בו כדי להשוות את ההשפעות של מעכבים כי למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור שהכפול HIV-1 (איור 1). עבור מעכבים כי למקד צעדים מראש אינטגרציה, מבחנים חלופיים כגון assay infectivity תא TZM-bl 17 נדרשים להעריך יעילות אנטי. חששות בטיחות סרן עבור המשלוח של אנטי HIV-1 RNAs במרפאת כוללים השפעות חוץ-היעד פוטנציאליות על RNAs אדם או חלבונים, והפעלה של חיישני חיסון מולדים. כדי להעריך את הרעילות של siRNAs נגד HIV-1, השתמשנו assay כדאיות התא שורות תאים שונות 16. כמו כן, אנו נמדדים הפעלה של החיישנים החיסוניים גדילי RNA הכפולים, R פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) ו אגרה כמו 3 קולטן (TLR3), כמו גם לשעברpression של אינטרפרון מגורה גן, p150 ADAR1. מבחנים אלה יכולים לשמש כדי לאשר את היעילות של RNAs נגד HIV-1 הוא לא בשל השפעות עקיפות על כדאיויות תא או הפעלת חיישן חיסונית. הם גם שימושי למעט RNAs מועמד עם רעילות פוטנציאל להתפתח הלאה. ב הפרוטוקולים הבאים, נהלים לזהות RNAs הטיפולית חדשות ולבצע אופטימיזציה של הפורמט של התנחלויות קיימות מתואר. השיטות שימושיות מעכבי אינטגרציה שלאחר מבוסס RNA הקרנת שכפול HIV-1 יכולות להיות מותאמות למסך מעכבים שלאחר אינטגרציה אחרות, כגון מולקולות קטנות מיקוד יצוא Rev בתיווך של רנ&quot;א הנגיפי 18 או CRISPR / מערכות קאש שנועדו למקד משולבות HIV-1 DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים, 96 באר, 24 באר, 6 באר.</td><td>קורנינג</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו צינורות Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>משקל מולקולרי נמוך Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>מגיב טרנספקציה עבור RNA סינתטי</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>מגיב טרנספקציה לפלסמידים</td></tr> <tr>לביטוי RNA<td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>תבנית RNA פולי(A)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 פריימר DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>נייר מסנן DEAE&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>מונה נצנוץ Microplate</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Microplate Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>טבליות חיץ ליזה</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>מעכבי פרוטאז ופוספטאז</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>מגיב ברדפורד</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>תא ריצה ג'ל</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>תא העברה חצי יבש</td><td>סולם חלבון Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת הפשטת נוגדנים</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td>נוגדן</td></tr><tr><td></td><td></td><td>PI32106 ADAR1</td><td>מנוגדני ד"ר ב.ל. באס</td></tr><tr><td>פוספו-T446-PKR</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פוספו-S396-IRF3</td><td>איתות תאים</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן</td><td></td><td></td> PKR <td>מד"ר א. הובנסיאן</td></tr><tr><td>נוגדן IRF3</td><td>איתות תאים</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אקטין</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב עם תווית פרוקסידאז</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכברים עם תווית פרוקסידאז</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת היעילות והרעילות של rnas מיקוד ייצור hiv-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

טיפולי RNA קטנים המכוונים לשלבים שלאחר האינטגרציה במחזור השכפול של HIV-1 הם בין המועמדים המובילים לטיפול גנטי ויש להם פוטנציאל לשמש כטיפולים תרופתיים לזיהום HIV-1. מעכבים לאחר אינטגרציה כוללים ריבוזימים, RNA סיכת ראש קצרה (sh), RNA מפריע קטן (si), RNA הפרעות U1 (U1i) ואפטמרים RNA. רבים מהם זוהו באמצעות מבחני טרנספקציה חולפים עם פלסמיד ביטוי HIV-1 וחלקם התקדמו לניסויים קליניים. בנוסף למדדי היעילות, RNA קטן הוערך על הפוטנציאל שלו להשפיע על ביטוי RNA אנושי, לשנות את צמיחת התאים ו/או התמיינות ולעורר תגובות חיסוניות מולדות. בפרוטוקולים המתוארים כאן, מתוארת קבוצה של מבחני טרנספקציה חולפים שנועדו להעריך את היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה במחזור השכפול של HIV-1. השתמשנו במבחנים אלה כדי לזהות ריבוזימים חדשים ולייעל את הפורמט של shRNAs ו-siRNAs המכוונים ל-HIV-1 RNA. השיטות מספקות סט מהיר של בדיקות שימושיות לסינון RNA חדש נגד HIV-1 וניתן להתאים אותן לסינון מעכבים אחרים לאחר האינטגרציה של שכפול HIV-1.

סכימטי הכללי של הנהלים מוצג באיור 2 עם תכנית transfection לדוגמה עבור שלושה RNAs ניסיוניים RNA מלא מסופק באיור 2B. עבור מבחני כדאיות התא ייצור ויראליות, מחוץ לקרוא לכל מבנה המבחן מנורמל כביקורת שלילית. משכפל הם transfected בסטים, כך שכל RNA המבחן מנורמל בקרה שלילית הסמוכים לה. הדבר נעשה על מנת למנוע נתונים לא מדויקים הקשור לעיתוי בין complexing ו transfection, אשר עלול לגרום אם, למשל, כל הבקרות השליליות הם transfec...

מתוארות שיטות להערכת היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה של מחזור השכפול של HIV-1. שיטות אלו שימושיות לסינון מולקולות חדשות ולאופטימיזציה של הפורמט של מולקולות קיימות.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשוות את היעילות והרעילות של RNAs חדשים המכוונים לייצור HIV-1. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי של מולקולות RNA חדשות לשימוש בטיפול גנטי או תרופתי ב-HIV-1, כגון short hairpin או small interfering RNAs, ריבוזימים (ribozymes) ו-RNA decoys. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לסנן מספר עיצובים חדשים של RNA בו-זמנית תוך זמן תגובה קצר.אף ששיטה זו תוכננה להערכת תרופות RNA חדשות או טיפולים גנטיים עבור HIV, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון מולקולות קטנות או משימות CRISPR. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הקמנו ניסויים לסריקת מספר רב של ריבואזימים לבחינת השפעות אנטי-HIV. לתחילת הדברים, הכינו תרחיף של תאי כליה עובריים אנושיים 293T בריכוז 2 × 10⁵ תאים ל-mL ב-DMEM עם 10% FPS ו-1% penicillin streptomycin.הוסיפו 500, 100 ו-1,000 microliters של תגלי התאים לכל אחת מהבארות בלוחות של 24, 96 ו-12 בארות עבור בדיקות ייצור נגיפי, חיוניות תאים והפעלה חיסונית, בהתאמה. סובבו את הלוחות בעדינות והדגירו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5% carbon dioxide עד להגעה ל-50%to 70% confluency. עבור בדיקת ייצור הנגיפים, הכינו מהילה של 10 nanogram per microliter של פלסמיד ביטוי של HIV-1 והוסיפו 10 microliters לכל מבחנה של הבדיקה.בשלב הבא, הכין מהילולים של 5 µM של ה-RNAs לבדיקה ושל RNA לשליטה שלילית. לאחר מכן, הוסף 2.5 µL או 10 µL מכל מהילול של ה-RNA לבדיקה ושל השליטה השלילית למבחנות המתאימות, כדי להגיע לריכוזים סופיים של 25 nM או 100 nM. עבור בדיקת חיות התאים, הכין מהילולים של 5 µM של ה-RNAs לבדיקה ומהילול של 10 mg/mL של ה-RNA לשליטה חיובית, poly(I:C) בעל משקל מולקולרי נמוך. הוסף 2 µL מהמהילולים של ה-RNA לבדיקה או של ה-RNA לשליטה החיובית למבחנות המתאימות, כדי להגיע לריכוזים סופיים של 100 nM או 200 µg/mL, בהתאמה.עבור בדיקת ההפעלה החיסונית, יש להוסיף 20 µL של מהילול RNA של הדגימה או של ביקורת חיובית, כפי שהוכנו עבור בדיקת חיות התאים, למבחנות המתאימות עבור ריכוזים סופיים של 100 nM או 200 µg/mL, בהתאמה. לאחר מכן, יש להוסיף 50, 25 או 75 µL של DMEM לכל מבחנת טרנספקציה עבור בדיקות ייצור נגיפי, חיות תאים והפעלה חיסונית, בהתאמה. עבור בדיקות ייצור נגיפי, יש להעביר את התאים ואת מבחנות הטרנספקציה המוכנות למעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 3, או BSL-3, לפני השלב הבא.הוסיפו שני מיקרוליטרים של ריאגנט הטרנספקציה באופן רצף לצינורות הטרנספקציה, והדגירו למשך 15 עד 20 דקות כדי לאפשר יצירת קומפלקסים. הוסיפו את כל תערובת הטרנספקציה מכל מיקרו-צינור בטיפות למיקומים המתאימים בצלחות תרבית התאים. סובבו בעדינות, והדגירו את הצלחות למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.לביצוע בדיקת הייצור הוויראלי, לאחר הוצאת פלטות תרבית התאים בעלות 24 הבארות מהאינקובטור, העבירו אותן למטחת תרבית תאים ברמת BSL-3. סובבו בעדינות את הפלטות ולאחר מכן העבירו 150 microliters של העלייה (supernatant) מכל באר לבאר תואמת בפלטה בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה, שתשמש לכימות ייצור HIV-1. העבירו חמישה microliters של העלייה לבארים התואמות בפלטה בעלת 96 בארות המכילה 25 microliters של תערובת לפירוק ויראלי (viral disruption cocktail).לאחר דגירה של התערובת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, העבירו את הפלטה לתחנת עבודה לרדיואקטיביות. לאחר מכן, הכינו תערובת רדיואקטיבית (cocktail), והוסיפו 25 µL לכל באר של על-נוזל ויראלי ותערובת פירוק (disruption cocktail). דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים.טפטפו 5 µL מתערובת התגובה על המשבצות המתאימות בדף סינון מסיבי זכוכית/DEAE, והניחו לנקודות להתייבש במשך 10 דקות. השתמשו בבופר 2x SSC כדי לשטוף את הדפים חמש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם, ולאחר מכן בצעו שני שטיפות של דקה אחת עם 95% ethanol. הניחו לדפים להתייבש לפני איטומם בשקיות דגימה.הצמידו בעזרת אטבים את שקיות הדגימות המכילות את נייר סינון המט לקסטה, והכניסו את הקסטה למונה סינٹیגציה של מיקרו-פלייטים. לאחר מכן, הפעילו את המונה. עבור כל שיטת כימות נגיפי, חלקו את הערכים שהתקבלו עבור כל RNA נבדק בביקורת השלילית הסמוכה, והכפילו ערך זה ב-100 כדי לקבל את אחוז העכבה של ייצור HIV-1 עבור כל חזרה של ה-RNAs הנבדקים.לביצוע בדיקת חיוניות תאים, לאחר הוצאת פלטות ה-96 בארות מהאינקובטור, יש להוסיף לכל באר 20 µL של MTT בריכוז 5 mg/mL ו-DPBS. לאחר מכן, דגרו את הפלטות למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 °C. הוסיפו לכל באר 150 µL של איזופרופנול מוחמץ עם דטרגנט, ודגרו את הפלטות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר למיקרו-פלטה כדי לקבוע את הבליעה ב-570 ננומטר. חשב את מטבוליזם ה-MTT היחסי עבור כל ביקורת חיובית ו-RNA נבדק על ידי חלוקת הערך שהתקבל עבור כל דגימה בביקורת הטרנספקציה הסמוכה לה. עבור בדיקת ההפעלה החיסונית, לאחר הוצאת פלטות ה-12 בארות מהאינקובטור, שאב את מצע התרבית והשתמש ב-DPBS כדי לשטוף בעדינות את התאים פעמיים.לאחר מכן, הוסיפו 70 µL של בופר ליזיס קר המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז לכל באר, והדגירו את הפלטות על קרח למשך 10 דקות. העבירו את ליזאטי התאים למיקרוטובות, והקפיאו אותם במהירות על ידי טבילת המבחנות בחנקן נוזלי. לאחר שהדגימות הופשרו, בצעו שני מחזורי הקפאה-הפשרה נוספים, לסך הכל שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה.בשלב הבא, סבבו את הליזאטים בצנטריפוגה ב-15,700 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות כדי להשקיע את פסולת התאים. לאחר מכן, בעקבות אלקטרופורזה והעברה לממברנה, חשפו את רצועות החלבון על ידי דגירה של הממברנה ב-Ponceau S למשך דקה אחת. לאחר מכן, שטפו אותה במים מזוקקים פעמיים.השתמשו בפסים ובסולם החלבונים כמדריך כדי לחתוך את הממברנה ב-80 וב-55 kilodaltons. כעת, השתמשו ב-TBS עם 0.05%TWEEN 20 או ב-TBST כדי לשטוף את צביעת ה-Ponceau S. הוסיפו TBST עם 5%non-fat milk כדי לכסות את הממברנות באופן מלא, והדגירו אותן בטמפרטורת החדר עם ערבוב למשך שעה אחת.העבירו את הממברנות ל-TBST עם 3% BSA ונוגדנים המדוללים ביחס של 1:1,000 עבור ADAR, phosphor-PKR ו-phosphor-IRF3 עבור החלקים העליון, האמצעי והתחתון של הממברנה, בהתאמה. הדגירו בטמפרטורה של 4 degrees Celsius עם ערבוב למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את הממברנות חמש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם באמצעות TBST, לפני ההעברה ל-TBST עם 5% חלב דל שומן ונוגדנים משניים של עיזים נגד ארנב המסומנים בפרוקסידאז בריכוז של 1:5,000 למשך שעה אחת.לאחר ויזואליזציה של פסי החלבון על סרטי צילום, השתמשו בתמיסת stripping כדי לשטוף את החלקים האמצעי והתחתון של הממברנה למשך 10 דקות, לפני דגירה של החלק האמצעי של הממברנה עם נוגדנים ל-PKR ואת החלק התחתון עם נוגדנים ל-IRF3. כביקורת חיובית, בצעו probing לממברנה התחתונה עם נוגדנים ל-Actin בהתאם לפרוטוקול הכתוב. סכימה כללית של הבדיקות מוצגת כאן עם דוגמה לתוכנית טרנספקציה עבור שלושה RNA בדיקה ו-RNA ביקורת.עבור בדיקות של ייצור ויראלי וחיוניות תאים, הקריאה של כל מבנה ניסיוני מנורמלת אל מול ביקורת שלילית. באמצעות בדיקת ייצור HIV-1 בתאים שעברו טרנספקציה עם פלסמיד המבטא את זן HIV-1 NL4-3, חושב אחוז פעילות ה-RT בתאים שעברו טרנספקציה משותפת עם אחד מה-siRNAs המוצגים כאן, בהשוואה לתאים שעברו טרנספקציה עם siRNA חסר משמעות (nonsense) המהווה סובסטרט ארוך ל-Dicer, וזאת כדי לזהות את האורך האופטימלי של מולקולות השתקת RNA (RNA interference) המכוונות לאתר שמור ב-HIV-1 RNA. באמצעות ה-siRNAs היעילים ביותר שזוהו, נקבע אחוז מטבוליזם של MTT עבור התאים שעברו טרנספקציה.בדומה ל-RNA דו-גדילי, poly(I:C) הפחית את חיות התאים רק במינון הגבוה ביותר. לא נצפתה ירידה משמעותית בחיות התאים עבור siRNAs המכוונים לאתר 1498 ב-RNA של HIV-1, ללא קשר לאורכם. כפי שהודגם כאן באמצעות Western blot, אותה קבוצה של RNA נבחנה במערך לבדיקת הפעלת מערכת החיסון.בתנאים שבהם poly(I:C) הפעיל את הביטוי של ADAR1-p150 והשרה פוספורילציה של PKR ו-IRF3, לא נצפתה השפעה משמעותית על אף אחד ממסמני האינאקטיבציה עבור אף אחד מה-RNAs שנבדקו. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שבעה ימים, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בדגימות באיכות גבוהה הן של RNA והן של DNA לצורך טרנספקציה.יתרה מכך, כדי לכלול את הביקורות השליליות והחיוביות המתאימות. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון הדבקת תאים שעברו טרנסדוקציה ב-HIV, כדי להעריך את היעילות והרעילות לטווח ארוך של מועמדים פוטנציאליים לטיפול נגד HIV. לאחר פיתוחה, טכניקה זו אפשרה לנו לזהות אתר מטרה נגיש ושמור ב-HIV RNA ולבצע אופטימיזציה לפורמטים של ריבוזימים, shRNAs ו-siRNAs המכוונים אליו.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לסנן במהירות מועמדי RNA חדשים המכוונים לייצור HIV לבדיקת יעילות באמצעות בדיקת ייצור נגיפי, ולבדיקת רעילות פוטנציאלית באמצעות בדיקות הפעלת מערכת החיסון וחיוניות תאים. זכרו כי עבודה עם HIV ונוקלאוטידים מסומנים רדיואקטיבית עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש במעבדות מאושרות לבטיחות ביולוגית ורדיואקטיביות, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

evaluation-efficacy-toxicity-rnas-targeting-hiv-1-production-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

נוכחי HIV-1 אסטרטגיות לפעול כדי לדכא את מחזור החיים של נגיפי אבל לא יעיל למיגור זיהום. כאן, אנו מראים כי recombinase מהונדסים יכולים הבלו ביעילות משולב DNA HIV-1 proviral מן הגנום של תאים נגועים.

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

מספר 2'-Fluoro aptamers נגד HIV-RNA 1Ba-L gp120 עם זיקה nanomole מבודדים מספריית RNA על...

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

החיזוי של שימוש coreceptor של HIV-1 נדרש לניהול קבוצה חדשה של תרופות תרופתיות, יריבי coreceptor כלומר. זה יכול להתבצע על ידי ניתוח...

ניבוי של שימוש בנגיף HIV-1 Coreceptor (זיקה) על ידי ניתוח רצף באמצעות גישת genotypic

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת...

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

פיתחנו פרוטוקול עבור הדור והערכה של הומניזציה ונגיף הכשל החיסוני האנושי חעוגה מודל העכבר מבוסס על השתלת תא גזע, הנגיף החיסוני intravaginal האדם חשיפה, ו-droplet דיגיטלי PCR RNA כימות.

הומניזציה חעוגה עכברים עבור חשיפה Intravaginal HIV וטיפול בזיהום HIV

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ותיקוף של שיטות מעבדה טובות בזיהוי תואם של וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית לתמיכה בפיתוח קליני של וקטורים של ריפוי גנטי.

בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות

מחקר זה השתמש באסטרטגיות in-silico כדי לזהות Etravirine שנספר כחומר טיפולי מבטיח ל-HIV. הממצאים שלנו על אינטראקציות ודינמיקה מולקולריות תומכים בתכנון הרציונלי של NNRTI חדשים כחלופות אפשריות לטיפול ב-HIV.

יחסי מבנה-פעילות כמותיים, חיזוי פעילות ודינמיקה מולקולרית של מעכבי טרנסקריפטאז הפוך שאינם נוקלאוטידים

למדו להעריך את היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לייצור HIV-1. השיטה מאפשרת סינון מהיר של עיצובי RNA חדשים לטיפול גני או תרופתי בנגיף HIV.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג'ין או טיפול תרופתי

גלה סרטונים נוספים