שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסיוני זה היא לספק הליך לא פולשני ולא אינטנסיבי מבחינה טכנית לגרימת דלקת ריאות חיידקית בעכברים וכימות לאחר מכן של תגובת ההגנה של המארח in vivo בריאות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי מחלות זיהומיות ואימונולוגיה, על הגנים והמסלולים המולקולריים השולטים בתגובת המארח לזיהום. היתרון העיקרי של שיטת דלקת ריאות זו הוא הפשטות הטכנית שלה.

מה שמאפשר אפילו למעבדות עם מומחיות מועטה בפרוצדורות ריאתיות לחקור את התגובה החיסונית המולדת הריאתית. במתקן ברמת בטיחות ביולוגית שנייה, יש להפשיר מלאי גליצרול של K.pneumoniae ולהעביר מיליליטר אחד של החיידקים לבקבוק תרבית של 500 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של מרק סויה טריפטית. דגרו את תרבית המתלים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 עד 225 סל"ד.

למחרת בבוקר, יש לדלל 1 עד 5 מיליליטר מתרבית החיידקים בבקבוק חדש המכיל 50 מיליליטר מרק סויה טריפטי ולדגור את התרבית, בשייקר, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות נוספות כדי להגיע לשלב היומן. בתום הדגירה השנייה, העבירו מיליליטר אחד של חיידקים מהתרבית השנייה לצינור של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לפלטה והשהה בעדינות את החיידקים במיליליטר אחד של מי מלח סטריליים לשלוש כביסות נפרדות.

לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את החיידקים במיליליטר נוסף של מי מלח סטריליים, והגדירו דילולים סדרתיים של החיסון. מדוד מיליליטר אחד של אחד עד 10 ואחד עד 100 דילולים בקובטות חד פעמיות, בשכפול, כדי לקבוע את ה-OD600 של ה-K.pneumoniae השטוף. OD600 של 1.0 שווה בערך לארבע עד שבע כפול 10 לשמינית CFUs למיליליטר.

לאחר חישוב ריכוז החיידקים בכל דילול, השעו מחדש את מינון ה-CFU הרצוי של החיסון ב-50 עד 60 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים לכל בעל חיים בן שמונה עד 12 שבועות. כדי להעביר את החיידקים לבעלי החיים, משכו את חיסון המינון לקצה פיפטה P200, והניחו את העכבר המורדם בתנוחת שכיבה למחצה, תלויה על ידי החותכות המקסילריות, מגומייה המתוחה בין יתדות לוח פרספקס מלוכסן. בעזרת זוג מלקחיים קהים ולא מרוכסים, משוך בעדינות את הלשון הצידה והפקיד את המינון בחלל הפה של בעל החיים תוך הקפדה להימנע מגרימת טראומה ללשון או ללוע הפה.

שמור על הלשון נסוגה, חסום בעדינות את האף באצבע עטויה כפפה, עד שהבית שואף פעמיים-שלוש. כאשר לא נראה נוזל בחלל הפה, העבירו את העכבר מלוח החיסונים לכלוב שלו, במצב שכיבה, כדי למנוע חסימה של הנרסים בזמן שהעכבר מתאושש. בצע חתך אורכי ממש מתחת לעצם החזה.

לאחר מכן, הרם את עצם החזה בעזרת מלקחיים, חתך את הסרעפת, ואפשר לריאה ליפול בחזרה לחלל החזה. המשך את החתך למעלה דרך חלל החזה משני צידי כלי הדם ולמעלה דרך הצוואר. כאשר קנה הנשימה נראה, חתכו בזהירות את אמצע הצוואר ודחפו את הרקמה לצדדים כדי למנוע פגיעה בכלי הדם שמסביב.

כעת חתכו את קנה הנשימה כרבע מהדרך למטה מהראש, והכניסו לקנה הנשימה צינורית המחוברת למזרק מיליליטר אחד טעון מראש במיליליטר אחד של PBS. דחפו את הנפח לריאות, לאט, ואפשרו לכל האונות להתנפח. לאחר מכן משוך את הנפח בחזרה החוצה עם המזרק ואסוף את השטיפות שנאספו בצינור של 15 מיליליטר, על קרח.

בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, אספו את הדם מהחדר השמאלי והעבירו אותו לצינור הפריני כדי למנוע קרישה. לאחר מכן קצרו את כל אונות הריאה בצינור של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר PBS, ואת הטחול בצינור של 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר PBS. לאחר מכן, השתמש בהומוגנייזרים חד פעמיים בודדים לכל דגימה, כדי להשרות את הרקמות על קרח, ולאחר מכן דילול סדרתי של תמיסות הרקמות.

צלחת את הדילול, בשכפול, בצדדים נפרדים של צלחת TSA אחת, ואפשר לדגימות להתייבש, לזמן קצר. לאחר מכן הפוך את הצלחות ותרבית את הדגימות באינקובטור סטטי של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, תוך ממוצע מושבות החיידקים משני צידי הצלחת ומכל דילול למחרת בבוקר. ב-2000 CFU של K.pneumoniae, עכברים, בדרך כלל, מתחילים להפגין תסמינים קליניים 12 עד 24 שעות לאחר ההדבקה.

תוך 48 עד 72 שעות, רבים מבעלי החיים מציגים תסמינים של מחלה ותחלואה שבדרך כלל קודמים להם ירידה ממוצעת של 20 אחוזים במשקל. עם זאת, מינון LD50 מאפשר לזהות הן את ההישרדות המוגברת יחסית והן את הירידה בהישרדות בקבוצת הניסוי, ועשוי להיות מועדף למחקרים ארוכי טווח. זיהום בדרכי הנשימה התחתונות עם K.pneumoniae מאופיין בזרם חזק של לויקוציטים לדרכי הנשימה תוך שש שעות מההדבקה, שמגיע לשיא ב-24 שעות ומיוצג בעיקר על ידי נויטרופילים.

ציטוקינים ניתנים לזיהוי בנוזל שטיפת הסימפונות הן 24 והן 48 שעות לאחר ההדבקה ב-K.pneumoniae, ומספקים תובנה לגבי המיקרו-סביבה של הריאות והגיוס העצמי החיסוני שלה בתגובה לפלישת חיידקים. העומס החיידקי בריאות, בדם ובטחול גדל באופן דרמטי בין 24 ל-48 שעות של הדבקה. לאחר השליטה, ניתן לבצע את שיטת השאיפה האורופרינגיאלית של זיהום ריאות תוך דקה עד שתיים בלבד לכל עכבר אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא להשתמש בנפח שאיפה מוגזם. נפח של 50 עד 60 מיקרוליטר עובד בדרך כלל היטב עבור עכבר בן שמונה עד 12 שבועות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מגוון שיטות על רקמות הריאה וההיקפיות כדי לאפשר כימות של התגובה החיסונית בפינוי פתוגנים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לדלקת ריאות חיידקית ניסיונית באמצעות העברת פתוגן אורו-לוע ולקבוע את עומס הפתוגן בעכברים. אל תשכח שעבודה עם חיידקים עלולה להיות מסוכנת וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות ושיטות בסיסיות של BSL-2 בעת ביצוע הליך זה.