שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

המטרה הכללית של פרוטוקול ניסיוני זה היא לספק הליך שאינו פולשני ואינו עתיר עבודה טכנית להשראה של דלקת ריאות חיידקית בעכברים, ולאחר מכן לבצע כימות של תגובת הגנת המארח in vivo בריאות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי המחלות הזיהומיות והאימונולוגיה, בנוגע לגנים ולמסלולים המולקולריים השולטים בתגובת המארח לזיהום. היתרון המרכזי של שיטה זו להשראת זיהום בריאות הוא הפשטות הטכנית שלה.

דבר זה מאפשר אפילו למעבדות עם מומחיות מועטה בפרוצדורות ריאתיות לחקור את התגובה החיסונית המולדת בריאות. במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 2, הפשיר מנתב גליצרול של K.pneumoniae והעבר מיליליטר אחד של החיידקים לבקראק תרבית של 500 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של Tryptic Soy Broth. דגרי את תרבית הסספנסיה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 עד 225 RPM.

בבוקר למחרת, יש לדלל בין מיליליטר אחד לחמישה מיליליטרים של תרבית החיידקים בבקראח חדש המכיל 50 מיליליטר של Tryptic Soy Broth, ולהדגיר את התרבית, במכשיר השייקר, בטמפרטורה של 37 °C למשך 2.5 שעות נוספות כדי להגיע לשלב הלוגריתמי (log phase). בסיום ההדגיה השנייה, העבירו מיליליטר אחד של חיידקים מהתרבית השנייה למבחנה של 1.5 מיליליטר לצורך סנטריפוגה. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע, וסספנדו בעדינות את החיידקים במיליליטר אחד של תמיסת מלח סטרילית, ובצעו זאת בשלושה שטיפות נפרדות.

לאחר השטיפה השלישית, השהו שוב את החיידקים במיליליטר נוסף של תמיסת סליין סטרילית, והכינו דילולות סדרתיות לוגריתמיות של האינוקולום. מדדו מיליליטר אחד של הדילולות 1:10 ו-1:100 לקובטאות חד-פעמיות, בשתי חזרות, כדי לקבוע את ה-OD600 של ה-K.pneumoniae השטוף. OD600 של 1.0 שקול בקירוב לארבעה עד שבעה כפול 10 בחזקת 8 CFUs למיליליטר.

לאחר חישוב ריכוז החיידקים בכל דילול, השהו מחדש את מינון ה-CFU הרצוי של האינוקולום ב-50 עד 60 microliters של תמיסת מלח סטרילית עבור כל חיה מקבלת בגיל 8 עד 12 שבועות. כדי להחדיר את החיידקים לבעלי החיים, שאבו את האינוקולום למינון לתוך טיפ של פיפט P200, והניחו את העכבר המורדם במצב גב חצי-שכיבה, תלוי מהשיניים החותכות העליונות, באמצעות גומייה מתוחה בין הפינים של לוח Plexiglas נטוי. באמצעות פינצטה קהה ללא חריצים, משכו בעדינות את הלשון הצידה והחדירו את המינון לחלל הפה של בעל החיים, תוך הקפדה להימנע מגרימת טראומה ללשון או ללוע.

תוך כדי שמירה על הלשון במצב רטרואקטיבי (מוסוגה), חסמו בעדינות את הנחיריים באמצעות אצבע עם כפפה, עד שהעכבר שואף פנימה פעמיים או שלוש. כאשר לא נראה נוזל בחלל הפה, העבירו את העכבר מלוח ההזרקה אל כלובו, במצב שכיבה על הגב, כדי למנוע חסימה של הנחיריים בזמן התאוששות העכבר. בצעו חתך לאורכי ממש מתחת לעצם הסטרנום (עצם החזה).

לאחר מכן, הרימו את עצם החזה (sternum) בעזרת פינצטה, בצעו חתך קטן בסרעוף כדי לאפשר לריאה לחזור אל חלל בית החזה. המשיכו בחתך מעלה דרך חלל בית החזה משני צידי כלי הדם ועד להגיע לצוואר. כאשר הקנה (trachea) נראה לעין, חתכו בזהירות במרכז הצוואר והסיטו את הרקמה לצדדים כדי למנוע פגיעה בכלי הדם שסביבו.

כעת בצעו חתך קטן בקנה הנשימה (trachea) במרחק של כרבע מהראש כלפי מטה, והכניסו לכיוון הזנב (caudally) קנולה המחוברת למזרק של 1 milliliter הטעון מראש ב-1 milliliter של PBS אל תוך קנה הנשימה. דחפו את הנפח לתוך הריאות באיטיות, כדי לאפשר לכל האונות להתנפח. לאחר מכן, שאבו את הנפח חזרה באמצעות המזרק ואספו את השטיפות שננקו אל מבחנה של 15 milliliter, על קרח.

בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, אסוף את הדם מהחדר השמאלי והעבר אותו לשפופרת עם הפרין למניעת קרישה. לאחר מכן, קצור את כל אונוי הריאה לשפופרת של 15 milliliter המכילה חמישה milliliters של PBS, ואת הטחול לשפופרת של 15 milliliter המכילה שני milliliters של PBS. לאחר מכן, השתמש בהומוגניזטורים חד-פעמיים נפרדים עבור כל דגימה, כדי למעך את הרקמות על קרח, ולאחר מכן בצע דילול סדרתי של תמיסות הרקמה.

העבירו את הדילוציות, בכפילות, לצדדים נפרדים של צלחת TSA אחת, והמתינו לייבוש קצר של הדגימות. לאחר מכן, הפכו את הצלחות והדגירו את הדגימות באינקובטור סטטי בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, ובבקר ה following הפיקו ממוצע של המושבות הבקטריאליות משני צדי הצלחת ומכל דילוציה. בריכוז של 2000 CFU של K.pneumoniae, עכברים מתחילים בדרך כלל להפגין תסמינים קליניים 12 עד 24 שעות לאחר ההדבקה.

בתוך 48 עד 72 שעות, רבים מהבעלי החיים מראים תסמינים של מחלה ותחלואה, להם קודם בדרך כלל איבוד משקל ממוצע של 20 אחוזים. עם זאת, מינון LD50 מאפשר זיהוי של both הישרדות מוגברת וירידה יחסית בישרדות בתוך הקבוצה הניסוית, ועשוי להיות מועדף למחקרים ארוכי טווח. זיהום של דרכי הנשימה התחתונות על ידי K.pneumoniae מאופיין בנחיתה מאסיבית של לוקוציטים אל תוך דרכי הנשימה בתוך שש שעות מהזיהום, המגיעה לשיאה בתוך 24 שעות ומיוצגת בעיקר על ידי נויטרופילים.

ניתן לזהות ציטוקינים בנוזל שטיפה ברונכואלוולארי הן 24 והן 48 שעות לאחר הדבקה ב-K.pneumoniae, והם מספקים תובנות לגבי מיקרו-סביבת הריאה והגיוס העצמי החיסוני שלה בתגובה לפלישה חיידקית. העומס החיידקי בריאה, בדם ובטחול עולה אף הוא באופן דרמטי בין השעה ה-24 לה-48 להדבקה. לאחר שהשיטה נלמדת, ניתן לבצע את שיטת השאיבה האורופרינגיאלית להדבקת הריאה תוך דקה אחת עד שתיים בלבד עבור כל עכבר, אם היא מבוצעת כהלכה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלא להשתמש בנפח שאיבה מופרז. נפח של 50 עד 60 microliter עובד בדרך כלל היטב עבור עכבר בן שבועות 8 עד 12. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע מגוון שיטות ברקמת הריאה וברקמות פריפריאליות כדי לאפשר את כימות התגובה החיסונית בפינוי הפתוגן.

לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי הדרך להשראת דלקת ריאות חיידקית ניסויית באמצעות הזרקת פתוגן דרך הפה והלוע, וכיצד לקבוע את עומס הפתוגן בעכברים. זכרו כי עבודה עם מיקרובים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות ובשיטות עבודה בסיסיות של BSL-2 בעת ביצוע הליך זה.