Name: אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: למד אינדוקציה של פציעה חריפה בשריר השלד בעכברים באמצעות הזרקת קרדיוטוקסין לשריר הטיביאליס הקדמי. שיטה זו מאפשרת חקר תהליכי התחדשות שריר in vivo ברמת שכפול גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לבית החיות ולמתקני המיקרוסקופיה המשולבים של IGB-CNR. עבודה זו נהנתה ממימון מחקר מתוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית בפרויקט ENDOSTEM (הפעלה של תאי גזע הקשורים לכלי דם ותאי גזע של שריר לתיקון ותחזוקה של רקמת שריר, הסכם מענק מספר 241440), משרד החינוך-אוניברסיטה-מחקר האיטלקי (MIUR-PRIN2 010-2011) ל-GM ו-S.B. ו-PON Cluster IRMI ל-GM, וקרן CARIPLO ל-GM ו-S.B.

כל הניסויים נערכו בהתאם קפדן עם ההנחיות המוסדיות עבור מחקר בבעלי חיים ואושר על ידי המחלקה לבריאות הציבור, בריאות בעלי החיים, תזונה ובטיחות המזון של המשרד האיטלקי בריאות בהתאם לחוק על ניסויים בבעלי חיים. נהלים נקע בצוואר רחם עשויים להשתנות ממוסד למוסד מבוסס על IACUC או הדרישות המקבילות שלה. 1. הזרקת Cardiotoxin בשריר השוקה הקדמית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 מיקרומטר פתרון עובדים של cardiotoxin (CTX) על ידי דילול פתרון מניות cardiotoxin ב פוספט שנאגר סטרילי מלוח (PBS) או במים לפני תחילת ההליך. הערה: CTX הוא מסיס במים הוא 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. כן פתרון מניות 70 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. CTX משמש פרוטוקול זה הוא תערובת של cardiotoxins בעל משקל מולקולרי של כ -7,000 Da. זהירות: מומלץ ללבושכפפות כפולות, מסכה היגיינה, משקפי מגן (לחלופין משקפי מגן, מומלץ לעבוד מתחת למכסת מנוע) וכדי להיות מאוד זהיר כדי להימנע מכל מגע עם הפתרון, גם אם מדוללות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים בזריקה intraperitoneal של קטמין ו xylazine (80 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו -10 מ&quot;ג / ק&quot;ג של מסת גוף) או הרדמה זמין מאושרת אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הפנים כלפי מעלה עכבר, לרסס את הגפיים האחוריים עם אתנול 70%. כדי להמחיש את המיקום המדויק של שריר השוקה הקדמי (ת&quot;א), בעזרת אזמל, לחתוך את השיער משם בחלק הקדמי של הרגל התחתונה, מתחת לברך. הערה: שריר ת&quot;א עולה מהגוף הפרוקסימלי של עצם השוק, יורד לרוחב עד העצם וכלה באזור הקרסול. הגיד הארוך שלה משתרע לתוך כף הרגל ברחבי הקרסול (ראה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר ~ 100 μL של פתרון לתוך מזרק על ידי משיכת הבוכנה חזרה לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בועות אוויר, מחזיק את המזרק כלפי מעלה (עם המחט כלפי מעלה). משוך בעדינות את הבוכנה כלפי מטה והקש על הצד של המזרק כדי לעזור בועות אוויר שהיו מחוברים אל החלק הפנימי של הצינור לבוא כלפי מעלה. לאט ללחוץ על המתג כדי לשחרר בועות אוויר גדולות. כמה טיפות של נוזל ייצא המחט. בשלב זה, הקפד לבחור את הנוזל שוב לתוך הצינור ולא לפזר אותה, בהתחשב הרעיל של cardiotoxin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התמיסה לתוך המזרק עד המינון הרצוי הוא הגיע. להזריק 20 μL של פתרון CTX עבור כל שריר ת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט במרכז ת&quot;א על ​​ידי ביצוע עמדת עצם השוקה כקו מנחה, מן הגיד לכיוון הברך. מאז ת&quot;א היא רקמה דקה, לבצע הזרקת מבלי לעבור עמוק מדי (להכניס את המחט 2/3 מ&quot;מ עמוק, בערך בשעה 10 ° עד 20 ° זווית), ולהימנע הולך מעבר השריר עצמו (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין למשוך את המחט מיד לאחר ההזרקה, אך לחכות 2 - 3 שניות כדי למנוע דליפהגיל CTX טיפות מן השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך, למקם את הכלוב על צלחת מחוממת (37 מעלות צלזיוס) עד העכברים ערים, מאז ההרדמה ואת אתנול המשמש להפחית את טמפרטורת גוף. </li></ol> בידוד 2. שוקה קדמית הערה: שרירים יכולים להיות מבודדים בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת cardiotoxin פי דרישות ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רסס את hindlimbs עם אתנול 70%. במהלך ההליך, בעל החיים יכול להיות קבוע על תמיכה להחזיק אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור ברמה של גיד הפרוקסימלית (מעל כף הרגל), הכנס אחד הלהבים של המספריים מתחת לעור, לחתוך את העור כלפי מעלה, לכיוון הברך. בעזרת מלקחיים, למשוך את העור ולחשוף את השריר לגמרי. מוציאים בזהירות את כל העור והשיער מאזור עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את fascia ידי צובט לאט או חיתוך (עם הב-קצה פינצטה או עם מייקרו בסדר לנתח מספריים) בפריפריה הקיצונית של השריר בצד הנגדי של הטיביה (האיור 1B). לאחר שבור, להסיר את fascia בעדינות בעזרת פינצטה דקה-קצה; למנוע נזק לשריר הבסיסית. הערה: כמו עם שרירים אחרים ואיברים, ת&quot;א מכוסית על ידי fascia (fascia העמוק של הרגל), שכבה דקה של רקמת חיבור שנמצאת עמוק מתחת לעור וזה צריך להיות מוסר לבודד לשריר הבסיסי בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את גיד ת&quot;א דיסטלי ואת גיד פושטי digitorum מעל כף הרגל, אשר מונחים זה לצד זה. הגיד של שריר פושטי digitorum Longus (EDL) ממוקם מעט מתחת גיד ת&quot;א. הגידים של עכברים בוגרים גלויים לעין בלתי מזוינת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שריר ת&quot;א הבא באחת משתי השיטות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים שני גידים עם מיקרו בסדר לנתח מספריים ולמשוך אותם לכיוון הצד הפרוקסימלי, מחזיקהg הגידים עם מלקחיים. הפרד את שני הגידים, מושך אותם בעדינות בכיוונים מנוגדים כדי להפריד את השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה דקה-קצה, להפריד את גיד ת&quot;א דיסטלי מן גיד פושטי digitorum ידי העברת הקצה מתחת הגיד עצמו (איור 1 ג, תמונה עליונה). חלק בעדינות את פינצטה מתחת ת&quot;א להפריד אותו מן השרירים הבסיסיים (התרשים 1C, תמונה למטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את פינצטה מתחת לשריר כדי לשמור אותו מורם מעט, לחתוך את הגיד TA, בעדינות למשוך אותו כלפי מעלה עד שרק באזור מתחת לברך מצורף (1D איור, תמונה משמאל). חותך את ת&quot;א מתחת לברך, הוא הולך על הגבולות השרירים עם המספריים (1D איור, נכון תמונה). הערה: אם השריר נשאר מחובר מעט לצדדים, השתמש מיקרו בסדר לנתח מספריים כדי לעזור לנתק אותו. הערה: אם המלקחיים לא מתאימים בקלות מתחת ת&quot;א,זה אפשרי כי fascia לא הוסר לחלוטין, וזה עדיין יכול להיות גלוי על גבי השריר. במקרה זה, הסר את fascia לחלוטין לפני שתמשיך. </li></ol></li></ol> 3. טכניקת שרירים קפואה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות קטנה של מסטיק tragacanth או תרכובת הקפאת דבק דומה (למשל, טמפרטורה אופטימלית חיתוך (תרכובת OCT)) על פרוסת הפקק. לייבל פרוסה של הפקק בצד ההפוך לפני ההקפאה, במידת הצורך (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לקבל חלקים רוחביים של השריר, להטביע את ת&quot;א לתוך מסטיק tragacanth ידי החדרת הגיד הדיסטלי ולהשאיר על 3/4 של השריר בחוץ, והקפד יש שריר במצב מאונך ביחס הפקק (איור 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פחית אלומיניום (לחלופין, כוס מתכת או כוס זכוכית), עם איזופנטאן. להשעות את פחית איזופנטאן בתוך LIQUI המכיל דיוארחנקן ד, שאינו מאפשר את החנקן הנוזלי להיכנס לפח. הערה: איזופנטאן צריך להגיע לטמפרטורה הנכונה (מ -150 ל -160 מעלות צלזיוס) במשך הקפאה אופטימלית של הרקמה. הטמפרטורה הנכונה הוא הגיע כאשר כמה חלקיקים מוצקים לבן הטופס בתחתית של פחית ואת איזופנטאן הופך צמיג מעט. הערה: אין להקפיא המדגם לפני ההיווצרות של החלקיקים המוצקים, כפי שהוא יכול להוביל חפצים מקפיאים. מצד שני, אם איזופנטאן הופך לגמרי מוצק, להשאיר אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מופשר, ולוודא כי חלקיקים לבנים וחלקם עדיין קיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחי Mixter, טובל את הפקק במהירות עם השריר לתוך איזופנטאן, שמירה על מטה ממוצבת השריר, ולוודא כדי לשחרר את הפקק כאשר הוא שקוע לחלוטין בתוך הנוזל. בדרך זו, בעוד הדגימה צפה, רק הצד ההפוך של הפקק צריך להיות גלוי בתוך הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את sample ב איזופנטאן דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחי Mixter (או מלקחיים דומים), לקחת את השריר לטבול אותו בחנקן נוזל 2 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים את דגימות בנפרד בנייר אלומיניום שכותרתו ומיד למקם אותם בקרח יבש (-70 ° C), או ישירות לאחסן אותם מקפיא -80 מעלות צלזיוס. הערה: לאורך כל ההליך, מצעדי 3.4 ל 3.7, זה מאוד חשוב כדי לשמור על הטמפרטורה הנכונה ולמנוע דגימות מן המפשיר (למשל, במהלך ההעברה מקפיאה -80 מעלות צלזיוס.). תוצאות הטמפרטורה עולות פשרה מבוקרת refreezing של microcrystals המים שנמצאים בתוך הרקמה, ובסופו של דבר גורם להיווצרות של חפצים או ההתמוטטות של סיבי שריר (דמיינו על סעיפי רקמות כמו חורי לבן גדולים במרכז של הסיבים). </li></ol> 4. cryostat חתך של שרירים קפואים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את t הטמפרטורה בתא cryostato -20 עד -22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בדל הדגימה, להב, ואת הדגימה בתא cryostat, המאפשר להם לאזן במשך 30 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות קטנה של תרכובת הקפאה (למשל, במתחם אוקטובר) על בדל הדגימה לטבול את הפקק עם הדגימה לפני מתמצק מתחם מקפיא. בינתיים, למקם את הלהב בעל להב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הדגימה ואת הלהב באמצעות הברגים המצורפים כדי לכוון את בעל הדגימה עם מחזיק הלהב (תרשים 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עובי סעיף 10 מיקרומטר. המשך כדי לחתוך את הרקמה. עבור כל סיבוב של גלגל הכונן, בעל הדגימה מקדם מרחק מבוקר כלפי הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הסעיפים בשקופית מקוטב (8 עד 10 סעיף לכל שקופית) (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתך, אחסן את השקופיות ב -80 ° C. הערה: הדגימה ניתן לאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס ולעשות בהם שימוש חוזר עבור further חתך, אם ינוהלו כהלכה ומאוחסנים. </li></ol> 5. מכתים היסטולוגית שיגרתי (Hematoxylin &amp; Eosin כתם) הערה: כתמי היסטולוגית מספר יכולים להתבצע על סעיפים שריר על פי הניתוח. כתם היסטולוגית שגרתי לניתוח מורפולוגיים morphometric הוא Hematoxylin &amp; Eosin (H &amp; E) כתם bichromic. Hematoxylin מכתימה את הגרעינים סגול עמוק. מכתים גרעיני הוא counterstained עם eosin (ורוד / אדום), אשר מכתים מבנים אאוזינופילית, כגון myofibers בציטופלסמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי אוויר יבש שקופיות קפוא עם חלקים במשך 10 - 15 דקות בטמפרטורת חדר, להגיש את שקופיות מגש מכתים, ולשים את מגש שוקת מכתימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם דקות 1 עם hematoxylin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שוקת מכתים תחת סילון מים ברז חלש למדי במשך 10 דקות כדי לשטוף את hematoxylin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות עבור 5 דקות באתנול 95%, אם פתרון אלכוהוליים של eosin ישמש (לדלג tהצעד שלו במקרה של פתרון eosin מימי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain דקות 1 עם פתרון eosin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים לחסל פתרון eosin מוגזם. הערה: תזמון אופטימלי של מכתים עם או hematoxylin או eosin צריך להיות מוגדר עבור כל אצווה חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הדגימות בסדרת אתנול מדורגת: 50% ו -70% (כמה שניות כל אחד). במהירות לטבול אתנול 95%, ואחריו 2 שינויים אתנול 100%, 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה 2 שינויים של קסילן, כל 5 דקות או יותר. צעד זה חייב להתבצע מתחת למכסה המנוע כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות עם הרכבה בינונית מבוסס קסילן, החל כמה טיפות של הרכבה בינונית בשקופית ומכסה עם coverslip. המדיום גובר יכול לחול גם על coverslip ואת coverslip לשים בשקופית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע ויוצרים בועות אוויר בין שקופיות coverslip. כדי לחסל בועות אוויר, לשמור את השקופית אנכית (לאחר ההרכבה) ו לסחוט את מו העודףבינוני unting ובועות אוויר על ידי הלחיצה בעדינות על coverslip עם מלקחיים בוטים (או כלי קהה דומה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את השקופיות מתחת למכסה המנוע במשך כמה שעות או למשך הלילה כדי לאפשר קסילן להתאדות לחלוטין לפני שתמשיך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הניתוח המורפולוגי morphometric של H &amp; E מוכתמים סעיפי התחדשות שריר באמצעות תמונות הסדרה שאינן חופפות של לפחות קטע שריר אחד שלם לכל עכבר. צלמו תמונות עם מיקרוסקופ שדה בהיר, עם הגדלה 20X. הערה: ישנו מספר קטן של 5 עכברים מומלץ להשיג מובהקות סטטיסטית של המדידות. הערה: תוכנה לניתוח תמונה זמינה למטרה זו, כגון ImageJ תוכנה להורדה בחינם (http://imagej.nih.gov/ij/). </li></ol>

<ol><li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).</li>
<li>Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Precursors+from+iPS+Cells+for+Skeletal+Muscle+Cell+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy.</a> J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).</li>
<li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).</li>
<li>Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+mechanisms+regulating+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function.</a> Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).</li>
<li>Saclier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+activated+macrophages+orchestrate+myogenic+precursor+cell+fate+during+human+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration.</a> Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).</li>
<li>Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+skeletal+muscle+and+immune+cells%3A+muscle-derived+mediators+and+metabolic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li>
<li>Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Inflammation+in+Muscle+Homeostasis+and+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis.</a> Mediators Inflamm. 2015, (2015).</li>
<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).</li>
<li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li>
<li>Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiotoxin+and+phospholipase+A+in+the+blockade+of+nerve+conduction+and+depolarization+of+skeletal+muscle+induced+by+cobra+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom.</a> Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Mann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+repair+and+fibrosis+development+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle.</a> Skelet Muscle. 1 (1), (2011).</li>
<li>Pessina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+optimized+strategies+for+inducing+fibrosis+in+vivo%3A+focus+on+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Skelet Muscle. 4 (1), 7(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לגרום לפגיעה חריפה בשרירי השלד (כלומר, זריקה תוך שרירית של CTX). זה נעשה שימוש נרחב ככלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של התחדשות שריר השלד in vivo. הזרקת CTX גורמת לניוון של סיבי שריר, אשר נגרם על ידי שלילת הקוטביות של sarcolemma ואת ההתכווצות של הסיבים 12, ומפעילה המפל של אירועים שמובילים התחדשות שריר. שרירי שלד גזורים בנקודות זמן רצויות לאחר ההזרקה ופציעה, על פי דרישות ניסוי, ומשתמשים עבור ניתוחים היסטולוגית שלאחר מכן. השריר...

שרירי שלד מבוגרים יונק נוצרים על ידי קבוצות של fascicules של תאי שריר multinucleated (myofibers) כי הם מיוחדים עבור התכווצות. כל myofiber הוא syncytium מוארך, מוקף sarcolemma (קרום plasmatic) ו במיופיברילים המכיל, אשר עשויים מחלבונים התכווצות מאורגן קבוע וחוזר (סיבי אקטין ו שרירן). בהבגרות ובתנאים המנוחים, שרירי שלד יש תחלופה נמוכה מאוד של myonuclei שלהם 1; ואכן, myonuclei, אשר ממוקמים בפריפריה של myofiber, תחת sarcolemma, נעצרים בשלב G0 של מחזור התא אינם מסוגלים להתרבות 1,2. יש שרירי השלד יכולת מופלאה להתחדש בעקבות נזקים והגיע הומאוסטזיס לאחר מספר אירועים של שיפוץ רקמות שאינן קשורות באופן הדוק זה לזה. לאחר פציעה או טראומה חריפה, ניוון מושרה, ואחריו תהליכי התחדשותשכוללים אוכלוסיות תאים שונות, כולל אוכלוסיית תושב תאי שריר, תאי הלווין (SCS). ואכן, בהעדר כל לגירויים סביבתיים, תאי הלווין נמצאים במצב שקט וממוקמים בתוך גומחה בין sarcolemma ואת 3,4 lamina הבסיס. בעקבות פציעה או מחלה, גיל להיות מופעל, להתרבות, נודד אל האזורים שנפגעו, ובסופו של דבר להבדיל, והוליד להרכיב חדש myofibers 5. גיל הופעל להקים הצטלבות עם אוכלוסיות תאים שונות, תאים דלקתיים בעיקר, אשר מגויסות באתר של טראומת 6-8. הצטלבות זו מאפשרת לתאים אחרי פרדיגמה מוסדר שבו אותות מולקולריים לנהוג שינויים מבניים, המוביל בסופו של דבר הומאוסטזיס 9. מלבד גיל, תאים דלקתיים ביניים, תהליכי אנגיוגנזה, ואירועים מחדש עצבוב מעורב גם, מתנהג באופן מתואם כדי לתקן המאורגן הזה מאוד שלמבנה pecialized. יש עניין רב בלימוד היבטים שונים של התחדשות שריר שלד, לא רק להבין את הפיסיולוגיה של השריר, אלא גם כדי לשפר אסטרטגיות טיפוליות הדורשות ידע עמוק של התהליך כולו. גישות ניסוייות קיימות מספר כרגע ללמוד את זהותו ותפקידו של אוכלוסיות תאים שונות, מסלולי איתות, ואת המנגנונים המולקולריים המעורבים. מודלים עכבר של פגיעה חריפה מייצגים כלי רב עוצמה כדי לחקור היבטים רבים של תהליך זה. שונים השתמש בטכניקות נפוצות כדי לגרום ניזק לשרירים חריף מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תהליך ההתחדשות in vivo, מן בשלבים מוקדמים מאוד עד סוף התהליך. פרוטוקול זה מתאר את השלבים מן זריקה תוך שרירית של cardiotoxin הנגזרות ארס נחשים (CTX), אשר גורם myolysis ומפעיל את תהליך השיקום, עד מועד ניתוח של דגימות רקמה. בעקבות הזרקת CTX, מילce אפשר להקריב בנקודות זמן שונות בהתאם לדרישות ניסוי, ואת שרירי השלד יכולים להיות גזור ומעובד לניתוח נוסף. לבסוף, אנו מתארים את פרוטוקול מכתים סעיפי רקמות לבצע תצפיות מורפולוגיים ניתוחים כמותיים בסיסיים. פרוטוקול זה מאפשר לחקר התחדשות שרירי השלד חריפה in vivo באופן מאוד לשחזור 10.

<table><tbody><tr><td>קרדיוטוקסין מ&nbsp; Naja mossambica mossambica</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C9759</td><td></td></tr><tr><td>מזרק לאינסולין BD Micro-Fine+ מחט 30 גרם x 8 מ"מ - Da 0.3 מ"ל</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth</td><td>Gum MP BIOMEDICALS, LLC 104792</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-מתילבוטן (איזופנטן)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>78-78-4.</td><td></td></tr><tr><td>OCT Killik פתרון להכללה Cryostat</td><td>Bio-optica</td><td>&nbsp; 05-9801</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוטום נוצה S35</td><td>ביו-אופטיקה</td><td>&nbsp; 01-S35</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית Superfrost בתוספת</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>09-OPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Dumon #5 מלקחיים בגימור מראה&nbsp;</td><td>2מכשירים ביולוגיים</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישר חד / חד</td><td>2מכשירים ביולוגיים</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים נויס ישר</td><td>2מכשירים ביולוגיים</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס עדין ישר חד / חד 10.5 ס"מ</td><td>2מכשירים ביולוגיים</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>יוקיט</td><td>ביו-אופטיקה</td><td>09-00100</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי שקופיות</td><td>BIOSIGMA</td><td>VBS651</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 100%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>02860-2.5 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>J.T. BAKER</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>LEICA</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי cardiotoxin הזרקה

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

התחדשות שריר שלד היא תהליך פיסיולוגי המתרחש שרירי שלד מבוגרים בתגובת פציעה או מחלה. פגיעה הנגרמת חריפת התחדשות שריר שלד היא בשימוש נרחב, מערכת מודל רבה עצמה כדי לחקור את האירועים מעורבים התחדשות שרירים, כמו גם את מנגנוני שחקנים שונים. אכן, ידע מפורט של תהליך זה הוא חיוני להבנה טובה יותר של מצבים פתולוגיים שמובילים ניוון שרירי שלד, וזה מסייע בזיהוי אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות חדשות. העבודה הנוכחית מתארת ​​פרוטוקול מפורט לשחזור להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים באמצעות זריקה תוך שרירית אחת של cardiotoxin (CTX). CTX שייך למשפחת מרעלים ארס נחשים וגורם myolysis של myofibers, אשר בסופו של דבר מעורר את אירועי התחדשות. הדינמיקה של התחדשות שריר שלד מוערכת על ידי ניתוח היסטולוגית סעיפי שריר. הפרוטוקול גםממחיש את הפרוצדורות עבור לנתח, מקפיא, חיתוך השריר הקדמי tibialis, כמו גם מכתים Hematoxylin &amp; Eosin שגר כי נעשה שימוש נרחב לניתוח מורפולוגיים morphometric הבא.

צביעת H &amp; E מאפשרת ההערכה של המורפולוגיה של תהליך ההתחדשות בנקודות זמן ספציפי במהלך רגנרציה שרירי שלד. איור 3 מציג את הניתוח כמובן הזמן שבוצע על שרירי ת"א נפצעו של עכברי סוג ברים. שרירים בודדו בבית 3, 7, 15, ו -30 ימים לאחר הזרקת CTX, כמו schematized באיור 3 א. תמונות נציג של H &amp; חלקים רוחביים מוכתם E להראות הדינמיקה של תיקון שרירי שלד לאורך זמן (איור 3 ב-ה). ביום 3 לאחר פציעה, הארכיטקטורה ...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים בוגרים ומניפולציות הבאות של השרירים, כגון לנתיחה, מקפיא, חיתוך, מכתים שיגרתי, וניתוח שטח החתך myofiber.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מודל עכבר של פגיעה חריפה בשרירי השלד כדי לחקור את תהליך ההתחדשות in vivo, מהשלבים המוקדמים ביותר ועד לסוף התהליך. מודלים עכבריים של פגיעה חריפה בשרירים הם כלי רב עוצמה לחקירת היבטים רבים של תהליך ההתחדשות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יכולת השחזור הגבוהה של כל השלבים המעורבים.כדי להתחיל בהליך זה, יש למרוח כמה טיפות של אתנול 70% על הגפה האחורית של עכבר מורדם. כדי לדמיין את המיקום המדויק של שריר השוקה הקדמי, הסר את השיער בחלק הקדמי של הרגל התחתונה בעזרת אזמל. כדי להזריק את תמיסת הקרדיוטוקסין, יש לשאוב 100 מיקרוליטר ממנה למזרק.החזק את המזרק זקוף והסר את בועות האוויר. לאחר מכן, הכנס את המחט במרכז TA מהגיד לכיוון הברך, בעקבות מיקום עצם השוקה כהנחיה. בצע את ההזרקה מבלי להעמיק מדי, והימנע ממעבר לשריר עצמו.המתן שתיים עד שלוש שניות לפני שתשלוף את המחט כדי למנוע דליפה של קרדיוטוקסין מהשריר. מרחו כמה טיפות של אתנול 70% על הגפה האחורית של החיה המורדמת. חותכים את העור בגובה הגיד הפרוקסימלי, ואז מכניסים את אחד מלהבי המספריים מתחת לעור וחותכים את העור לכיוון הברך.משוך את העור כלפי מעלה כדי לחשוף את השריר לחלוטין. הסר בזהירות את כל העור והשיער מאזור העניין. לאחר מכן, הסר את הפאשיה על ידי צביטה איטית או חיתוך של ההיקף הקיצוני של השריר.לאחר השבירה, הסר בעדינות את הפאשיה בעזרת הפינצטה הדקה, הימנע מפגיעה בשריר הבסיסי. דמיין את הגיד הקדמי של הטיביאליס הדיסטלי מעל כף הרגל, ולאחר מכן הפרד את הגיד הקדמי של הטיביאליס הדיסטלי מגיד ה-extensor digitorum על ידי העברת קצה הפינצטה מתחת לגיד. החלק בעדינות את הפינצטה מתחת לטיביאליס הקדמי כדי להפריד אותו מהשריר הבסיסי.החזק את הפינצטה מתחת לשריר כדי לשמור עליו מורם מעט. חותכים את גיד השוקה הקדמי ומושכים אותו בעדינות כלפי מעלה עד שרק האזור שמתחת לברך מחובר. לאחר מכן, חותכים את ה-TA מתחת לברך, בעקבות קצה השריר בעזרת המספריים.מניחים כמות קטנה של מסטיק טרגקנט על פרוסת שעם. הכניסו את הגיד הדיסטלי של ה-TA לתוך מסטיק הטראגקנת, והשאירו כ-3/4 מהשריר בחוץ, וודאו שהשריר נמצא במצב מאונך ביחס לפקק. לאחר מכן, מלאו פחית אלומיניום באיזופנטן.תלו את פחית האיזופנטן בדיואר המכיל חנקן נוזלי. כאשר איזופנטן מגיע לטמפרטורה המתאימה, נוצרים חלקיקים מוצקים לבנים בתחתית הפחית. טבלו במהירות את הפקק עם השריר לאיזופנטן, תוך שמירה על תנוחת השריר כלפי מטה.בזמן שהדגימה צפה, רק הצד האחורי של הפקק צריך להיות גלוי בנוזל. השאירו את הדגימה באיזופנטן למשך דקה אחת. לאחר מכן, טבלו את השריר בחנקן נוזלי למשך שתי דקות לפחות.לאחר מכן, עטפו את הדגימות בנפרד בנייר אלומיניום מסומן והניחו אותן מיד בקרח יבש. במהלך ההליך, חשוב ביותר לשמור על הטמפרטורה הנכונה ולמנוע את הפשרת הדגימה. בהליך זה, הנח את בדל הדגימה, הלהב והדגימה בתא הקריוסטט, ואפשר להם להתאזן למשך 30 דקות לפחות.לאחר מכן, הניחו כמות קטנה של תרכובת הקפאה על בדל הדגימה, וטבלו את הפקק עם הדגימה בתרכובת ה-OCT לפני שתרכובת ההקפאה מתמצקת. הנח את הלהב במחזיק הלהב. הנח את הדגימה במחזיק המתאים שלה.חותכים את החלקים בעובי של 10 מיקרומטר. לאחר מכן, הנח את החלקים על שקופית מקוטבת. לאחר החיתוך, אחסן את השקופיות בחום של 80 מעלות צלזיוס.במכסה המנוע הכימי, יש לייבש לחלוטין את המגלשות הקפואות באוויר עם חלקים למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את השקופיות במגש מכתים. מכתימים את החלקים למשך דקה אחת עם המטוקסילין.לאחר מכן, הניחו את שוקת הצביעה מתחת לסילון מי ברז חלש למדי למשך 10 דקות כדי לשטוף את ההמטוקסילין. לאחר מכן, הכתים את החלקים בתמיסת אאוזין למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטפו אותם במים כדי למנוע תמיסת אאוזין מוגזמת. לאחר מכן, יש לייבש את הדגימות בסדרת אתנול מדורגת ב-50% ואחריה 70% לאחר מכן, לטבול במהירות את הדגימות ב-95% אתנול, ואחריו שני שינויים ב-100% אתנול.נקה את הדגימות בשני החלפות של קסילן, כל אחד למשך חמש דקות לפחות. כדי להרכיב את השקופיות, מרחו כמה טיפות של אמצעי ההרכבה על בסיס קסילן על כל שקופית, וכסו אותו בהחלקת כיסוי. שמור את השקופיות במכסה האדים למשך כמה שעות, או למשך הלילה.מוצגת כאן תוכנית הניסויים של הפגיעה החריפה בשרירי השלד. להלן התמונות המייצגות של חלקים מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין של שרירים שטופלו בקרדיוטוקסין בימים שצוינו לאחר הפציעה. כמה סיבים נמקיים, המוקפים בקו הרציף השחור, ככל הנראה פולשים על ידי התאים הדלקתיים.הקו המקווקו מסמן אזור של התאים החד-גרעיניים החודרים. מיופייבר יחיד לא בוגר עם גרעין הממוקם במרכז מסומן על ידי העיגול השחור. להלן סיבי השריר האאוזינופיליים הגדולים המתחדשים, עם הגרעינים הממוקמים במרכז המסומנים על ידי העיגולים השחורים.גרף זה מציג את הממוצע של ערכי גודל השריר המרכזי בחלקי שריר TA. והגרף הזה מראה את התפלגות שטח חתך השריר 6, 15 ו-30 יום לאחר הזרקת קרדיוטוקסין. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בקטעי שרירי השלד לביצוע פרוטוקולים היסטולוגיים ואימונופלואורסצנטיים שונים לזיהוי מאפיינים ספציפיים של רקמת השריר.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור היבטים שונים של תהליך התחדשות שרירי השלד בעקבות פציעה חריפה.

induction-acute-skeletal-muscle-regeneration-cardiotoxin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מודל murine של גירוי חשמלי neuromuscular (NMES), שיטת קליני בטוח ולא יקר, אל השרירים תא הקדמי מתואר. מודל זה יש את היתרון של שינוי התקן קליני זמינים לצורך לעורר התכווצויות שרירים ממוקד וספציפי בעכברים.

דגם Murine של אימון שרירים באמצעות גירוי חשמלי neuromuscular

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אקו מייצגת שיטה יעילה, אמינה, וניתן למקד עבור המשלוח של סוכני העברת גנים או תאים לתוך הלב העכברי. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.

הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

אנו מתארים פרוטוקול in vivo למדידת כיפוף הגב של כף הרגל בעקבות גירוי של העצב הפרונאלי והתכווצות התא האחורי הקדמי של הגפה האחורית של החולדה. מדידות כאלה הן כלי תרגומי הכרחי להערכת פתולוגיה של שרירי השלד וגישות הנדסת רקמות לתיקון והתחדשות שרירים.

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של הדגם פעילות כויץ כרונית של תרגיל להתבונן הנוצרות על-ידי גירוי שרירי השלד עיבודים ב hindlimb החולדה.

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

אנו מתארים בשיטה vivo לחקור את אובדן פונקציונלי של גן ספציפי בתאי לווין באמצעות שילוב של קרדיאטוקסין בתיווך הפציעה של שריר השלד ואת הזריקה של siRNA הספק.

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

פרוטוקול זה מתאר מכשיר פשוט המחקה את שיטת הגלגול של דינג, מבסס מודל חולדה של פגיעה בשרירי השלד, ומשתמש בצביעת המטוקסילין-אאוזין כדי לבחון את הפתולוגיה של רקמות פגועות ובדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים כדי לזהות שינויים בסמני נזק בסרום.

חיקוי שיטת הגלגול של דינג על פגיעת שריר הנגרמת על ידי נוטקסין בחולדות

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר זיהוי וניתוח ממדי גבוה של תאי גזע שריר ותאי אב על ידי ציטומטריית מסה של תא בודד וטיהורם על ידי FACS לצורך מחקרים מעמיקים של תפקודם. גישה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור דינמיקה התחדשות במודלים של מחלות ולבדוק את היעילות של התערבויות פרמקולוגיות.

זיהוי וניתוח של אבות מיוגניים in vivo במהלך פגיעה חריפה בשרירי השלד על ידי ציטומטריית מסה חד-תאית חד-ממדית גבוהה

למד אינדוקציה של פציעה חריפה בשריר השלד בעכברים באמצעות הזרקת קרדיוטוקסין לשריר הטיביאליס הקדמי. שיטה זו מאפשרת חקר תהליכי התחדשות שריר in vivo ברמת שכפול גבוהה.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

גלה סרטונים נוספים