Name: מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: למד ניתוח פיזיולוגי של אוכלוסיות תאים מוגדרות באיבר vomeronasal של עכבר באמצעות רישומי patch-clamp. שיטה זו מאפשרת חקר מעמיק של מנגנוני chemosensation בסביבה טבעית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאיוון רודריגז ובנואה פון דר ויד על יצירת קו העכבר FPR-rs3-i-venus, הביקורת הבונה והדיונים הפוריים שלהם. עבודה זו מומנה על ידי מענקים של קרן פולקסווגן (I/83533), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) ועל ידי יוזמת המצוינות של הממשלה הפדרלית והמדינתית הגרמנית. MS הוא פרופסור ליכטנברג בקרן פולקסווגן.

נהלי כל החיה היו בהתאם לחקיקה מקומית ואיחוד האירופי על ההגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוי (Directive 86/609 / EEC) ועם המלצות שהועלו על ידי הפדרציה של אגודות מדע בעלי חי מעבדה אירופאיות (FELASA). שניהם C57BL / 6 עכברים ועכברים FPR-RS3-i-ונוס שוכנו בקבוצות של שני המינים בטמפרטורת החדר על מחזור אור 12 שעות / כהה עם מזון כרצונך מים זמין. בניסויים צעירים (6-20 שבועות) של שני מינים היו בשימוש. אין הבדלים ברורים תלויה מגדרים נצפו. 1. פתרון כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן S 1 פתרון תאי: 4- (2-הידרוקסי-אתיל) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES) שנאגר פתרון תאי המכיל (מ&quot;מ) 145 NaCl, KCl 5, 1 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 HEPES; pH = 7.3 (מנוכה עם NaOH); osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן extracelluS 2 פתרון Lar: carbogen-מחומצן (95% O 2, 5% CO 2) פתרון תאיים המכילים (מ&quot;מ) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 2 CaCl, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7.3; osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% פתרון agarose טמפרטורה נמוכה gelling (S 3) להטבעת רקמות: 4% agarose טמפרטורה נמוכה gelling. ממיסים 2 גרם נמוכה gelling agarose ב 50 מ&quot;ל של S 1 בבקבוק מעבדה זכוכית 100 מ&quot;ל יחד עם בוחש מגנטי. כדי להמס את agarose, הנחת את הבקבוק בתוך אמבט מים (עם מכסה לא סגור היטב) על 70 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות או עד הפתרון הופך שקוף תוך ערבוב. להתקרר ולשמור agarose מומסת באמבט מים שני ב 42 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן S 4 פתרון התאי: פתרון פיפטה המכיל (מ&quot;מ) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0.3 CaCl 2 (Ca חינם 2 + = 110 ננומטר), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7.1 (מנוכה עם KOH); osmolarity = 290 mOsm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות / להתאים רכב S 1, S 2 ו- S 4 פי תכנון ניסוי בודד (למשל, חוסמים תרופתיים לבודד סוגים מסוימים של זרמים מופעלי מתח). </li></ol> 2. סביבת עבודה כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מחמצני תא אחסון פרוס עם S 2 לפחות 30 דקות לפני לנתיחה, במקום על קרח למשך התאמת טמפרטורה ו- pH פתרון oxygenate ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מאגר עבור הפרוסה superfusion על הקלטת התקנה עם S 2 ו חמצן ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתיחה, למלא vibratome קאמרית עם S 2 ולסדר קרח כתוש סביב החדר. לחלופין, להעביר פתרון מחומצן חילוף קרח קר מחמצנים קאמריים לתוך vibratome קאמרית ולשמור מחמצנים ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים כלים מתכלים כירורגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חבילת ג&#39;ל קרח מתחת לנתחמיקרוסקופ, מכסים במגבת נייר כדי למנוע רקמות VNO מן המקפיא אל החלק התחתון של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין גילוח נקי על ידי שטיפה קצרה באתנול 70% ומים מזוקקים הר כדי vibratome. חלף עבור כל פגישת חיתוך. </li></ol> 3. VNO Dissection והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי חיים על ידי חשיפה קצרה ל- CO 2 לערוף באמצעות מספרי כירורגיות חדים. הערה: ככל שזמן להקריב את החיה לשים את הקפסולה VNO על קרח הוא קריטי, למזער את הזמן פחות מ -2 דקות. כדי לשמור על כדאיות רקמות, להטביע הן VNOs מלא גזור agarose תוך פחות מ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלסת התחתונה עם מספרי כירורגיות גדולים. זן דרך חלל הפה ופצע את העצמות ושרירי לסת התחתונות של כל צד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החלק הנותר של הראש הפוך על צלחת פטרי הגדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כלפי חוץ את העור של הלסת העליונה וסביב קצה האף עם מלקחיים בינוניים כדי לקבל גישה טובה יותרחותכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי עצם לחתוך את החלק הגדול ביותר של החותכות בזווית ~ 45 ° בכיוון המקורי (איור 1 א). זה יקל הסרת הקפסולה VNO מחלל האף. הערה: אין לחתוך את שורש השן כדי למנוע נזק קצה הקפסולה VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את החיך העליון הנוקשה חלק המקורי שלה עם מלקחיים בינוניים ובזהירות לקלף בחזרה בחתיכה אחת בזווית שטוחה (איור 1 ב). הערה: שוב ושוב לשטוף עם S קר כקרח 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את היתוך הגרמי בין קצה העצם vomer והלסת. הכנס את הטיפים מספריים עם החלק המעוגל של קצה מצביע כלפי חוץ מן VNO בזהירות לחתוך את העצם בצעדים קטנים משני שמאל לרוחב בצד ימין הקפסולה VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הקפסולה VNO, להשתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את העצם vomer בחלק הזנב ובזהירות להרים את עצם vomer מתוך nASAL חלל באמצעות מלקחיים בינוניים. מיד להעביר את VNO אל צלחת פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ סטריאו על חבילת ג&#39;ל הקרח שבו השלבים הנותרים של הניתוח יבוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את VNO כמות קטנה של קר כקרח S 2 כדי למנוע את רקמות מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את כמוסות סחוסים המכילות רקמות הרכות VNO ידי גרירה האחורית של עצם vomer עם מלקחיים בינוניים. מקם את הקפסולה עבור תצוגה הגבי כך פיצול בין שני VNOs הופך לגלוי (איור 1D i). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה מלקחיים בסדר להפריד הסחוס הוא כמוסות VNO מהעצם המרכזית, תוך שמירה על עצם vomer מרותק בחלק האחורי. הערה: שימוש במלקחיים רק בשולי הקפסולה הסחוס להיזהר מאוד שלא לחדור מבעד הסחוס כמו האפיתל החישה העדין נפגע בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שני VNOs מופרדים, להתחיל להסיר את הסחוס encapsulating האשוחיםt VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את השולים העליונים של קפסולה עם אחד מלקחיים בסדר התפצל קיר הסחוס שצורף בעבר עד עצם vomer (בצד המדיאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר הנותרים סחוס להפוך את VNO עם צד לרוחב המעוגל שלה לתחתית המנה ובבטחה להצמיד הסחוס בצד אחד באמצעות מלקחיים. בזהירות להזיז את מלקחיים בסדר השני מהצד האחורי בזווית מאוד שטוח בין סחוס VNO לרופף את הקשר בין רקמות הסחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לקלף את VNO מן הסחוס על ידי מחזיק אותו קצה הזנב שלה, כדי למנוע ניזק האפיתל החושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר VNO היא דחסה הקפסולה, הקפד להסיר את כל חלקי הסחוס הקטנים הנותרים כמו כל חלקים נותרים של סחוס תנתק את הרקמה שמסביב agarose במהלך תהליך החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה קטנה של קר כקרח S 2 על VNO גזור הראשון כדי למנוע נזק לרקמות. כלי דם גדולים על wil צד לרוחבl להיות גלוי המציין כי האיבר עדיין לא נפגע ולא נפגע גס במהלך הניתוח (איור 2 א ii). במקרה כלי דם ניזוק, הוא עדיין יהיה כדאי להמשיך עם חותך את VNO עוד המורפולוגיה הכוללת לא נפגמה בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לנתח את VNO השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להטביע את VNOs, למלא שתי צלחות פטרי הקטנות אל שולי עם מומסת S 3 (מאוחסן באמבט מים ב 42 ° C; ראה 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את VNO על קצה זנב הרחב עם מלקחיים בסדר, כדי למנוע פגיעת האפיתל החושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את VNO ב agarose והעבר אותו אופקי הלוך ושוב כמה פעמים כדי להסיר את הסרט של פתרון תאי וכן כל בועות אוויר מפני השטח שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את VNO אנכית עם קצה הזנב מול התחתון של המנה. במקום צובט את VNO עם המלקחיים ישירות, לשנות את הכיוון על ידי הזזת קצה מלקחי proximi הקרובty אל VNO. הערה: האורינטציה במהלך ההטבעה היא קריטית שכן היא קובעת מטוס פרוס ונגישות עצב סנסורי במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מנות על חבילת ג&#39;ל הקרח ולהמתין עד agarose יש הקרושה. הערה: אין לשנות את הנטייה VNO לאחר agarose החלה לחיזוק כמו זה יהיה לנתק את הרקמה מן agarose שמסביב. </li></ol> 4. רקמות VNO עטרה פרוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית קטנה כדי להסיר גוש agarose מצלחת קטנה לתוך המכסה של צלחת פטרי גדולה, להעיף את agarose במהופך השארת טיפ הזנב של VNO כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגוש לתוך צורת פירמידה באמצעות אזמל כירורגי (3-4 מ&quot;מ בקצה, 8-10 מ&quot;מ בתחתית). יש להיזהר שלא לגרום נזק לרקמות מוטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בדבק סופר לתקן את בלוק בצורת פירמידה למרכז הצלחת הדגימה vibratome ולחכות ~ 1 דק &#39;על הדבק להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את צלחת דגימת ג החיתוךhamber ולהכין את VNO השני, בהתאם. שמור צלחת עם הדגימה השנייה ב 4 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microtome להב רוטט עם ההגדרות הבאות: עובי: 150-200 מיקרומטר; מהירות: 3.5 au = 0.15 מ&quot;מ / sec; תדירות: 7.5 au = 75 הרץ. עבר פרוסות לתא מחמצנים עד לשימוש לאחר שבדק פרוסת מורפולוגיה לזמן קצר תחת מיקרוסקופ לנתח. פרוסות יכולות להישמר במשך כמה שעות. </li></ol> 5. הקלטות אלקטרו מתא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקלטות, משתמש במיקרוסקופ קבועה בשלב זקוף מצוידות מטרות טבילה במים, Dodt או בניגוד הפריע הפרש אינפרא אדום (IR-DIC), ואת קרינת EPI וכן CCD-מצלמה מקוררת. עבור רכישת נתונים, השתמש מגבר תיקון- clamp, לשלב את הראש, AD / לוח הממשק DA לבין מחשב (כולל תוכנת צריבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של 10-20 טפטפות תיקון (4-7 MΩ). טפטפות משוך מן נימי זכוכית בורוסיליקט (1.50 מ&quot;מ OD / 0.86 מזהה מ&quot;מ) usinחולץ micropipette ga ו-פולנית אש עם microforge. הערה: אש ליטוש הטיפים פיפטה הוא חיוני כאשר תיקום VSNs קטן למדי. זה יעזור למנוע פקיעת קרום התא בעת הפעלת לחץ שלילי על מנת לקבל חותמת עמידות גבוהה. לאחר ליטוש פתיחת פיפטה צריך להיות כ 1 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור טפטפות בצנצנת אחסון פיפטה כדי למנוע נזק הצטברות אבק עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מערכת זלוף ידי מילוי מאגרי פתרון צינורות פי תכנון ניסוי. הערה: הסר בועות אוויר וצינורית לחלוטין כפי שהם יפריעו הקלטות אלקטרו בחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם הלחץ להשיג ~ 3 מ&quot;ל / זרימת דקות. הערה: בלחצים גבוהים יגרמו לתנועה של פרוסת רקמות וכן סיום הקלטות אלקטרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר VNO פרוסה תא הדמיה ולתקן את העמדה פרוסה באמצעות עוגן נירוסטה חוטית עם 0.1 מ&quot;מ עובי syntסיבי hetic (התרשים 2B - C). הערה: אין לכסות את פרוסת רקמה עם אחד הנושאים סיבים סינתטיים אלא agarose סביב פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לחדר ההדמיה כדי הקלטה להתקנה פרוסה Superfuse ברציפות עם S מחומצן 2 בטמפרטורת החדר באמצעות יישום אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את נימי היניקה אל פני השטח של הפתרון ליצור יניקה איטית חליפין קבועים של פתרון אמבטיה. התאם את &quot;עיפרון זלוף&quot; 8-in-1 רב חבית מעל וקרוב החלק הלא-חושית של הפרוסה VNO המכיל את כלי הדם (איור 2 ג, 3 ​​א) 50. זה יהיה מועיל לארגן עיפרון זלוף פיפטה ההקלטה להיות מול הפרוסה מכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודה השוואתית ופתרון אמבטיה באמצעות גשר אגר בצורת L (מלא 150 KCl מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה תיקון עם פיפטה פתרון S 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר פיפטה על האלקטרודה תיקון כסף מצופה כלוריד מחוברת אל במת הראש ללא מקרצף את הציפוי ולצרף בתקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ חיובי קלה (כ 1 מ&quot;ל על מזרק פלסטיק 10 מ&quot;ל) ל פיפטה את התיקון לפני הכניסה לאמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את פיפטה לתוך האמבט באמצעות מניפולטורים מיקרו רחוק מספיק כדי להיות מסוגל להטביע את המטרה מבלי להכות אותו (2D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התנגדות פיפטה (PIP R, בין 4-7 MΩ) באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה מחובר לשלב את הראש. הערה: אם R פיפ &lt;4 MΩ קצה זכוכית שבורה. אם R פיפ&gt; 10 MΩ, קצה יש סתימה ככל הנראה ואת פיפטה חייב להיות מוחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את פרוסת VNO עם המצלמה CCD באמצעות התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום אופטימיזציה (DIC) ולזהות תאים FPR-RS3-i-ונוס לבטא (או נוירונים שכותרתו דומה) באמצעות תאורה פלואורסצנטיו קוביית מסנן מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס פלורסנט היעד או תאים שאינם פלורסנט בהתאם לעיצוב ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתקרב גוף התא, השתמש גלגלי יד רגישות מקסימלית. בשל לחץ חיובי, שקע קטן בקרום סומה תא הופך לגלוי פעם קצה פיפטה נמצא בסמיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר לחץ חיובי להפעיל לחץ שלילי קל למצוץ בקרום התא על מנת להשיג חותם עמידות גבוהה (1-20 GΩ). החל יניקה קצרה ועדינה לשבש את קרום התא ולבסס את תצורת כל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התנגדות גישה ללא הרף במהלך הניסוי. הערה: רק כולל נוירונים מפגינים התנגדות גישה קטנה ויציבה (≤3% של מכניסה; שינוי &lt;20% במהלך הניסוי) לתוך ניתוח. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

VNO הוא מבנה chemosensory מאתר semiochemicals. נכון להיום, רוב הקולטנים vomeronasal נותר deorphanized כזוגות קולטן ליגנד רק כמה זוהו. בין אלה, V1rb2 תואר להיות מופעל על-ידי יצרן פרומון 2-heptanone שתן זכר 30, V2rp5 להיות מופעל על ידי ESP1 פרומון ספציפי זכר 57 וכן V2r1b ו V2rf2 כדי להיות מופעלים על ידי פפטידים MHC SYFPEITHI 48 ו SEIDLILGY 58, בהתאמה. תנאי מוקדם להבנת יחסים ליגנד לרצפטור אות תמרה הוא ידיעת מאפייני biophysical של אוכלוסיות ...

רוב בעלי החיים להסתמך בכבדות על החושים הכימיים שלהם לתקשר עם סביבתם. חוש הריח ממלא תפקיד חיוני למציאת והערכת מזון, הימנעות טורפים ואיתור שותפים ההזדווגות מתאים. ברוב היונקים, מערכת חוש הריח מורכב מלפחות ארבעה תת היקפי אנטומית והן מבחינה תפקודית ברורים: אפיתל ההרחה הראשי 1,2, גנגליון Grueneberg 3,4, האיבר במחיצה של Masera 5,6 ואת איבר יעקובסון. VNO כוללת המבנה החושי ההיקפי של מערכת חוש ריח האבזר (AOS), אשר ממלאת תפקיד מרכזי באיתור לאותות כימיים המעבירים מידע על זהות, מגדר, מעמד חברתי ומדינה מינית 7-10. VNO ממוקם בבסיס של מחיצת האף ממש מעל החיך. בעכברים, זה הוא צינור דו צדדי שהסתיים סמיות מגודר בתוך הקפסולה סחוסי 11-13. האורגן מורכב הן של epithe חושית המדיאלי בצורת חצי סהרlium כי מטפח את VSNs ושל חלק הלא-חושי בצד לרוחב. בין שניהם epithelia טמון לומן מלא ריר אשר מחובר אל חלל האף דרך הצינור הצר vomeronasal 14. כלי דם לרוחב גדולים בתוך הרקמה הלא-החושית מספקים מנגנון שאיבת כלי דם כדי להקל על כניסה של גדולות יחסית, בעיקר מולקולות בלתי נדיף כגון פפטידים או חלבונים קטנים לתוך לומן VNO באמצעות לחץ שלילי 15,16. הרכיבים המבניים של VNO נוכחים בלידה והאיבר מגיע לגודלו זמן קצר לפני גיל ההתבגרות 17. עם זאת, אם AOS מכרסם כבר תפקודי קטינים עדיין נושא לויכוח 18-20. VSNs מאופיין הוא מיקומם אפיתל את סוג הקולט שהם מבטאים. VSNs להראות מורפולוגיה דו קוטבית עם אקסון מחוסר מיאלין לבין דנדריט פסגה יחיד שבולט כלפי הלום ומסתיים ידית הדנדריטים microvillous. גרזן VSNons fasciculate ליצור את עצב vomeronasal שמשאיר הקפסולה סחוסי בסוף dorso-הזנב, עולה לאורך מחצה, מעביר את הצלחת cribriform ופרויקטים הנורה חוש הריח אביזר (AOB) 21,22. האפיתל חושית vomeronasal מורכב משתי שכבות: השכבה הפסגה ממוקם קרוב יותר אל הצד luminal ונמלים הן V1R- וכל אבל סוג אחד של FPR-rs-להביע עצב. נוירונים אלה coexpress G-חלבון α-למקטע G αi2 ופרויקט לחלק הקדמי של AOB 23-25. עצב סנסורי ממוקם V2Rs המפורש שכבת בסיס יותר או FPR-rs1 לצד αo G ולשלוח האקסונים שלהם לאזור האחורי של AOB 26-28. נוירונים vomeronasal מופעלים ככל הנראה על ידי semiochemicals קטן למדי 29-33 (V1Rs) או תרכובות חלבוניים 34-38 (V2Rs) כי מופרשים לתוך נוזלים שונים בגוף כגון שתן, רוק ולקרוע נוזל 37,39-41 </sup&gt;. בניסויים באתרו הראו כי VSNs גם מופעלים על ידי פפטידים formylated שונים תרכובות מיקרוביאלית / צמודי דלקת 25,42. יתר על כן, heterologously הביע חלבונים-rs FPR לשתף ספקטרום אגוניסט עם FPRs לידי ביטוי את המערכת החיסונית, מה שמעיד על תפקיד פוטנציאלי גלאי עבור מחל conspecifics או מקורות מזון מקולקלים 25 (ראה אסמכתא 43). יסוד להבנת יחסים ליגנד רצפטור ומפלה איתות במורד באוכלוסיות ספציפיות VSN הוא הערכה מפורטת של מאפייני biophysical הבסיסיים שלהם בסביבת ילידים. בעבר, ניתוח של איתות הסלולר יש יתרון מאוד מבעלי חיים מהונדסים גנטית המציינים אוכלוסיה מוגדרת של נוירונים ידי coexpressing חלבון בסמן פלורסנטי 30,44-49. בפרוטוקול זה, קו עכבר מהונדס המבטא FPR-RS3 יחד עם סמן פלואורסצנטי (FPR-RS3-i-ונוס) משמש.גישה זו מדגימה איך להעסיק כזה זן עכבר מהונדס גנטי כדי לבצע ניתוח אלקטרו של אוכלוסיית תאים לזיהוי אופטי באמצעות הקלטות תיקון- clamp נוירון הבודד בחתכי רקמת VNO עטרה חריפים. לחץ מונחה אוויר מערכת זלוף רב-קניים עבור גירויים חושיים וסוכנים תרופתיים מאפשר מהיר, הפיך מוקדי גירוי עצבי או עיכוב במהלך הקלטות. הקלטות כל תא בהכנות פרוסות לאפשר ניתוח מפורט של תכונות מהותיות, conductances מופעל במתח, כמו גם דפוסי פריקת פוטנציאל פעולה בסביבה המקורית של התא.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז (טמפרטורת ג'ל נמוכה)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>ביס(2-הידרוקסיאתיל)-2-אמינו-אתן-חומצה סולפונית (BES)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>51120</td><td></td></tr> <tr><td>(2-הידרוקסיאתיל) -1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES)</td> <td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן פחמתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td></td><td>S8045</td> <חזק>שם</חזק><td></td></tr><tr><td></td><td><חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>כלים כירורגיים וחומרים מתכלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי גדולה, עריפת ראש VWR 90 מ"מ</td><td>, דיסקציה של קפסולת VNO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי קטנה, מכסה VWR 35 מ"מ</td> לדיסקציה <td>VNO</td><td></td><td>, צלחת להטמעה באגרוז</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים גדולים חדים</td> כלי <td></td><td>מדע עדינים</td><td>עריפת ראש, הסרת לסת תחתונה</td></tr><tr><td>מספריים עצם חזקות</td><td>Fine</td><td></td> Science <td>Tools חותכות חיתוך</td></tr><tr><td>מלקחיים בינוניים, פינצטה Dumont #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>להסרת עור וחך</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו קפיצים, 8.5 ס"מ, מעוקלים, 7 מ"מ להבים&nbsp;</td>כלים <td></td><td>מדעיים עדינים</td><td>חותכים VNO&nbsp;</td></tr><tr><td>שני זוגות מלקחיים עדינים, פינצטה של דומונט #5</td> כלי <td></td><td>מדע עדינים</td><td>המנתחים VNO מתוך קפסולה סחוסית</td></tr><tr><td>מרית נירוסטה קטנה</td><td>כלי</td><td></td> מדע עדינים <td>לטיפול בבלוק אגרוז ופרוסות רקמות</td></tr><tr><td>אזמל</td><td></td><td></td> כירורגי <td>לחיתוך בלוק אגרוז לצורת פירמידה</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבר</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט (1.50 מ"מ OD/0.86 מ"מ ID)</td><td>מוצרי</td><td></td><td></td>מדע</tr><tr><td>CCD-מצלמה</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>קוביית סינון, עירור: BP 450-490, דיכוי: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>מנורת פלואורסצנטיות</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מגנטי פלטה חמה</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td>מכשיר מיקרומניפולטור <td>MF-830</td><td></td> <td>Narishige</td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>לואיגס & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה, אנכי דו-שלבי</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>מסלק רעשים 50/60 הרץ (HumBug)</td><td>Quest מטרה מדעית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>אוסילוסקופ</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>אוסמומטר&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>מערכת זלוף 8 ב-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד pH חמש צנצנת</td> אחסון <td>קלה של מטלר טולדו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td> World <td>Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה&nbsp;</td><td>לואיגס & </td> סכיני גילוח <td>מיני תא</td><td></td>Neumann Slice</tr><tr><td></td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword תא אחסון קלאסי</td><td></td></tr><tr><td>של פרוסות חמצן; תאים מסחריים חלופיים הם: למשל , BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) או Pre-chamber (BSC-PC; וורנר אינסטרומנטס)</td>מיקרוסקופ סטריאו <td>בהתאמה אישית</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>ממשק טריגר&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>ויברטום&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים&nbsp;</td><td>ממרט</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

ברוב היונקים, האיבר הוומרונזאלי (VNO) הוא מבנה כימו-סנסורי המזהה רמזים חברתיים הטרו-וספציפיים כאחד. נוירונים חושיים Vomeronasal (VSNs) מבטאים סוג ספציפי של קולטן מצומד לחלבון G (GPCR) מלפחות שלוש משפחות גנים שונות של קולטנים כימיים המאפשרים זיהוי רגיש וספציפי של רמזים כימו-סנסוריים. משפחות אלה כוללות את משפחות הגנים V1r ו-V2r וכן את משפחת הרצף הקשור לקולטן פפטיד פורמיל (FPR) (Fpr-rs) של גנים כימורקולטנים משוערים. על מנת להבין את הפיזיולוגיה של אינטראקציות קולטן-ליגנד וומרונזאליות ואיתות במורד הזרם, חיוני לזהות את התכונות הביופיזיקליות הטבועות בכל סוג ספציפי של VSNs.
הגישה הפיזיולוגית המתוארת כאן מאפשרת זיהוי וניתוח מעמיק של אוכלוסייה מוגדרת של נוירונים חושיים באמצעות קו עכבר טרנסגני (Fpr-rs3-i-Venus). עם זאת, השימוש בפרוטוקול זה אינו מוגבל לקו ספציפי זה ולכן ניתן להרחיב אותו בקלות לקווים מהונדסים גנטית אחרים או לחיות בר מסוג בר.

כדי לקבל תובנות לגבי מאפייני biophysical ופיזיולוגיים של אוכלוסיות תאים מוגדר, אנו מבצעים בחתכי רקמה העטרה חריפה של העכבר VNO (איור 1 - 2). לאחר דיסקציה, פרוסות יכולות להישמר פתרון תאי מחומצן קר כקרח (S 2) במשך כמה שעות. בשעה הגדרת הקלטה, חילופי מתמיד עם פתרון מחומצן טרי (איור 2 ד) מבטיח הכדאיות רקמות לאורך הניסוי. אנחנו כאן להעסיק מודל עכבר מהונדס (FPR-RS3-i-ונוס). VSNs ב coexpress זן ז...

כאן, אנו מתארים גישה פיזיולוגית המאפשרת זיהוי וניתוח מעמיק של אוכלוסייה מוגדרת של נוירונים חושיים בפרוסות רקמה קורונלית חריפות של האיבר הוומרונזאלי של העכבר באמצעות רישומי מהדק טלאי של תא שלם.

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע אנליזה אלקטרו-פיזיולוגית של תא בודד עבור אוכלוסייה מוגדרת של נוירונים תחושתיים בתוך פרוסות רקמה חיות מהאיבר הוומרונזלי של עכבר. שיטה זו יכולה לסייע בהבהרת שאלות מרכזיות בתחום החיש תחושתי (chemosensation), כגון מנגנוני זיהוי כימיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבאמצעות הקלטה מנוירונים תחושתיים בפרוסות רקמה חיות, ניתן לבחון תאים אלה בסביבתם הטבעית.כדי להתחיל בפרוצדורה זו, לאחר הקרבת בעל החיים, הסיר את הלסת התחתונה על ידי הכנסת מספריים כירורגיים גדולים דרך חלל הפה, וגזור את עצמות המנדיבולה ואת השרירים מכל צד בנפרד. לאחר מכן, הסר בעזרת פינצטה בינונית את העור של הלסת העליונה ומסביב לקצה האף, כדי להשיג גישה טובה יותר לשיריים החותכות. לאחר מכן, השתמש במספרי עצם כדי לגזור את החלק הגדול ביותר של השיריים החותכות בזווית של 45 מעלות לכיוון הרוסטרלי, כדי להקל על הסרת קפסולת ה-VNO מחלל האף.אין לחתוך את שורש השן כדי למנוע נזק לקצה הקפסולה של ה-VNO. לאחר מכן, אחזו בחלק הקדמי (rostral) של החך העליון הקשיח בעזרת פינצטה בינונית, וקלפו אותו בזהירות כחתיכה אחת בזווית שטוחה. שטפו שוב ושוב את חלל האף עם תמיסה S2 קרה מאוד. לאחר מכן, השתמשו במספרי קפיץ מיקרוסקופיים כדי לחתוך את בליטת העצם בין קצה עצם הרסן (vomer) לבין הלסת.החדירו את חוד המספריים כאשר החלק המעוקל פונה הרחק מה-VNO. גזרו בזהירות את העצם בצעדים קטנים הן בצד שמאל והן בצד ימין, לטרלית לקפסולת ה-VNO. כדי להסיר את קפסולת ה-VNO, גזרו את עצם הוומר (vomer bone) בחלקה הזנבי (caudal), והרימו בזהירות את עצם הוומר אל מחוץ לחלל האף באמצעות פינצטה בינונית.העבירו מיד את ה-VNO לצלוחית פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ סטריאו המונח על מארז ג'ל קירור, שם יבוצעו שאר שלבי הניתוח. לאחר מכן, שטפו את ה-VNO בכמות קטנה של S2 קר מאוד, כדי למנוע מהרקמה להתייבש. לאחר מכן, הפרידו את הקפסולות הסחוסיות המכילות את הרקמות הרכות של ה-VNO על ידי תפיסת החלק האחורי של עצם ה-vomer באמצעות פינצטה בינונית.לשם כך, מקם את הקפסולה למבט גבי (dorsal view) כך שהפיצול בין שני ה-VNOs יהיה גלוי. השתמש בקצה של פינצטה עדינה כדי להפריד את שתי קפסולות הסחוס של ה-VNO מהעצם המרכזית, תוך השארת עצם הוומר (vomer bone) מקובעת בחלק האחורי. ודא שדופן הסחוס המדיאלית, שהייתה מחוברת קודם לכן לעצם הוומר, הוסרה.בעת הסרת סחוס מסביב ל-VNO, השתמשו בפינצטה רק בשולי קפסולת הסחוס. והיו זהירים מאוד שלא לפגוע באפיתל החושי העדין. כדי להסיר את שאריות הסחוס, הפכו את ה-VNO כך שהצד הצידי המעוקל שלו יפנה לתחתית הצלחת, וקבעו את הסחוס בצד אחד באופן מאובטח באמצעות פינצטה.לאחר מכן, העבירו בזהירות את הפינצטה העדינה השנייה מהצד האחורי בזווית שטוחה מאוד בין הסחוס לבין ה-VNO כדי לשחרר את החיבור בין הרקמה לסחוס. כדי למנוע פגיעה באפיתל החושי, קלפו לאט את ה-VNO מהסחוס על ידי החזקתו בקצה הקודאלי (הזנבי). לאחר שה-VNO הופרד מהקפסולה, הסירו את כל חלקי הסחוס הקטנים שנותרו, שכן כל חלקי סחוס שיישארו יגרמו להיפרדות הרקמה מהאגרוז מסביבה במהלך תהליך הפריסה.בשלב הבא, הניחו טיפה קטנה של S2 קר מאוד על ה-VNO הראשון שהופרד כדי למנוע נזק לרקמה. כדי להטמיע את ה-VNOs, מלאו את שתי צלחות הפטרי הקטנות עד השפה ב-S3 מומס. לאחר מכן, טבלו כל VNO באגרוז ותנו לו תנועות אופקיות הלוך ושוב מספר פעמים כדי להסיר את שכבת התמיסה החוץ-תאית וכן בועות אוויר מפני השטח שלו. מקמו את ה-VNO בצורה אנכית, כאשר הקצה הרוסטרלי פונה לתחתית הצלחת.לאחר מכן, הניחו את שתי הצלחות על מארז קרח ג'ל, והמתינו עד שהאגרוזה תתמצק. אין לשנות את כיוון ה-VNO ברגע שהאגרוזה החלה להתמצק, שכן פעולה זו תגרום להיפרדות הרקמה מהאגרוזה שסביבה. בהליך זה, השתמשו בשפכטל קטן כדי להוציא את גוש האגרוזה מהצלחת הקטנה אל מכסה של צלחת פטרי גדולה, והפכו את האגרוזה, כך שהקצה הרוסטרלי של ה-VNO פונה כלפי מעלה.בשלב הבא, חתכו את הבלוק לצורה פירמידלית באמצעות סכין מנתחים, והקפידו לא לפגוע ברקמה הטמיעה. לאחר מכן, השתמשו בדבק מהיר (super glue) כדי לקבע את הבלוק בעל הצורה הפירמידלית למרכז פלטת הדגימות של הוייברטום. המתינו כדקה עד שהדבק יתייבש לחלוטין.חתכו את הדגימה לפרוסות בעובי של 150 עד 200 מיקרומטר. בחנו בקצרה את מורפולוגיית הפרוסות תחת מיקרוסקופ חוקר. לאחר מכן, העבירו את כל הפרוסות לתא חמצון עד למועד השימוש.בשלב זה, העבר פרוסה של VNO לתא הדמיה וקבע את מיקום הפרוסה באמצעות עגני פלדת אל-חלד המחוברים בסיבים סינתטיים בעובי 0.1 מ"מ. אין לכסות את פרוסת הרקמה באף אחד מחוטי הסיבים הסינתטיים. לאחר מכן, העבר את תא ההדמיה למערכת ההקלטה ובצע סופרפוזיה רציפה של הפרוסה ב-S2 מחומצן בטמפרטורת החדר.כוון את קפילרת השאיבה לפני השטח של התמיסה כדי ליצור חילוף קבוע של תמיסת האמבט. לאחר מכן, כוון את עיפרון ההזרקה הרב-חורי (eight in one multi barrel profusion pencil) מעל ובסמיכות לחלק הלא-חושי של נתח ה-VNO המכיל את כלי הדם. לאחר מכן, חבר את אלקטרודת הייחוס ואת תמיסת האמבט באמצעות גשר אגר בצורת L הממולא ב-150 millimolar potassium chloride.לאחר מכן, מלא את פיפטת הפאץ' (patch pipette) בתמיסת פיפטה S4. התקן את הפיפטה מעל האלקטרודה המצופה בכסף כלורי המחוברת לשלב הראש (head stage) ללא קילוף של הציפוי, וחבר אותה בחוזקה. לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי קל על פיפטת הפאץ' לפני הכנסתה לאמבט. עקוב אחר הפיפטה וודא שההתנגדות שלה היא בין 4 megaohms ל-10 megaohms.בצעו ויזואליזציה של נתח ה-VNO באמצעות מצלמת CCD תוך שימוש ב-DIC המותאם לאינפרא-אדום, וזהו תאים המבטאים FPR-rs3 i-Venus או נוירונים מסומנים באופן דומה באמצעות הארה פלואורסצנטית וקוביה של פילטר מתאים. התקרבו לגוף התא באמצעות גלגלי היד כדי להשיג רגישות מקסימלית. עקב הלחץ החיובי, שקע קטן בממברנת הסומה של התא יהיה נראה ברגע שקצה הפיפטה נמצא בקרבה רבה.לאחר מכן, שחררו את הלחץ החיובי והפעילו לחץ שלילי קל כדי לשאוב את ממברנת התא, במטרה להשיג חסימה בעלת התנגדות גבוהה של 1 עד 20 gigaohms. לאחר מכן, הפעילו שאיבה קצרה ועדינה כדי להפר את ממברנת התא וליצור קונפיגורציית תא שלם (whole cell configuration). בדמות זו, תמונה קונפוקלית של פרוסה קורונלית של רקמת VNO מראה את התפוצה של נוירונים פלואורסצנטיים חיוביים ל-FPR-rs3 Tau Venus באפיתל החושי הוומרונזלי.הנוירונים החיוביים ל-FPR-rs3 Tau Venus מציגים דנדריט אפיקלי בודד המסתיים במבנה דמוי פגז בגבול הלומנלי. כאן מוצגות הקלטות whole cell patch clamp שבוצעו מסומת של VSN. אלו הם עקבות מייצגים מהקלטות wholesale patch clamp של זרם נתרן מהיר המופעל על ידי TTX, וב-VSNs חיוביים ל-FPR-rs3.הקלטות של קפיצות מתח בתנאי בקרה חושפות זרם פנימה מהיר, חולף ותלוי-מתח. טיפול ב-TTX בריכוז של מיקרומולרי אחד מפחית משמעותית את הזרם. והעקבה עם ההחסרה הדיגיטלית המוצגת כאן חושפת את זרם הנתרן תלוי-המתח הרגיש ל-TTX.עקומות ה-current clamp המייצגות מראות דפולריזציה והיפר-פולריזציה ורצפים של פוטנציאלי פעולה שנוצרו בעקבות הזרקת זרם חיובי ושלילי במדרגות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את כל תהליך הניתוח וחיתוך הרקמות בתוך כשעה עבור שני ה-VNOs. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרים כגון הקלטות loose patch חוץ-תאיות או דימוי סידן על מנת להגביר את התפוקה בעת ניתוח של אוכלוסיות נוירונים גדולות יותר.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להכין פרוסות רקמה חדות מהאיבר הוומרונזלי של הפה, וכיצד לבצע רישומים אלקטרו-פיזיולוגיים של תא בודד מנוירונים חושיים וומרונזליים.

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מערך Multielectrode (MEA) הקלטות לספק שיטה ללימוד את הפעילות החשמלית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים. כאן, אנו מציגים את הפרטים של הכנה MEA להקליט האפיתל עכבר vomeronasal ובמקביל מגרה את הרקמות.

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

האיבר הוומרו-נזלי (VNO) מזהה אותות כימיים בתוך-מיניים המעבירים מידע חברתי ורבייתי. ביצענו ניסויי דימוי Ca2+ באמצעות עכברים טרנסגניים המבטאים G-CaMP2 ברקמת ה-VNO. גישה זו מאפשרת לנו לנתח את דפוסי התגובה המורכבים של נוירוני הוומרו-נזל למספר רב של גירויי פרומונים.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

סרטון זה מתאר את הבידוד של איבר vomeronasal עכבר (VNO) והכנת רקמות עבור חתך ויברטום. חלקים משמשים לאפיון התכונות הביופיזיות והפיזיולוגיות של קבוצה מסוימת של נוירונים חושיים.

הכנת איבר Vomeronasal עכבר עבור חתך Vibratome

סרטון זה מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית של נוירונים חושי ריח (OSNs) בעכברים באמצעות טכניקת מהדק טלאי מחורר. אפיתל הריח, המכיל OSN עם קולטני ריח מתויגים פלואורופור, מבודד מעכבר ומאובטח בתא הקלטה. פיפטת הקלטה מהודקת לידית הדנדריטית של OSN, וניסטטין בתוך הפיפטה מנקב את הממברנה כדי ליצור קישוריות חשמלית עם התא. לבסוף, פיפטה נוספת משמשת להעברת ממריץ ריח, והפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא המתוקן נרשמת.

רישום טלאי מהדק מחורר של נוירונים חושי ריח בעכברים

סרטון הפרוטוקול מתאר הקמת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירוני החישה של איבר הוומרונסאל (VNO) בעכברים. פרוסת VNO קורונלית עם נוירונים חושיים המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוקמת במערך הקלטה. תא עצב מסומן מתוקן עם פיפטת הקלטה בתצורה של תא שלם לרישום אלקטרופיזיולוגי בתגובה לגירויים כימיים.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירונים חושיים Vomeronasal

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

הנורה עכבר חוש הריח אבזר (AOB) כבר קשה ללמוד בהקשר של קידוד חושי. הנה, אנחנו מדגימים נתיחה שמייצרת vivo הכנה לשעבר שבו נוירונים AOB יישארו תפקודי מחוברים לתשומות ההיקפית שלהם, ומקלים על מחקרים בתחום עיבוד מידע של פרומונים העכבר וkairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

מאמר זה מספק פרוטוקול יעיל לדיסקציה ודיסוציאציה של אפיתל הריח של עכברים לצורך ריצוף RNA חד-גרעיני.

דיסקציה ודיסוציאציה מהירה של אפיתל הריח של העכבר למתלים חד-גרעיניים

למד ניתוח פיזיולוגי של אוכלוסיות תאים מוגדרות באיבר vomeronasal של עכבר באמצעות רישומי patch-clamp. שיטה זו מאפשרת חקר מעמיק של מנגנוני chemosensation בסביבה טבעית.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

גלה סרטונים נוספים