לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

המטרה הכוללת של פרוטוקול לכידת זיקה זה היא לבודד קומפלקסים של חלבונים אנדוגניים מתאי יונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה תאית ומולקולרית, כגון אילו חלבונים נוצרים יחד למודולים פונקציונליים המקושרים פיזית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לצפות באינטראקציות פיזיקליות רבות הקשורות לחלבון המטרה המעניין בו זמנית.

גדל גרם אחד עד שמונה גרם של תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. יוצקים את מצע הגידול לכוס גדולה. לאחר מכן, הניחו את צלחת התרבות על קרח בתבנית קרח מלבנית גדולה.

הוסף 20 מיליליטר של תמיסת מלח 1x חוצץ פוספט קר כקרח, או PBS, לצלחת התרבית ושחרר את התאים מהצלחת באמצעות מגרד תאים גדול. העבירו את התאים לצינור של 50 מיליליטר מקורר מראש על קרח. הוסף לאותה מנה 10 מיליליטר 1x PBS קר כקרח.

אוספים את התאים הנותרים ומעבירים אותם לצינור של 50 מיליליטר. חזור על תהליך זה עבור כל מנה. ניתן לשלב תרחיפי תאים מכלים שונים כדי להפחית את מספר הדגימה ופסולת הפלסטיק.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורה של 1,000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, שפכו בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש כל כדור בעשרה מיליליטר של PBS 1x קר כקרח.

אחד את הכדורים התלויים עד חמישה לכל צינור של 50 מיליליטר. שוטפים את הצינורות הריקים עם 10 מיליליטר PBS. הוסף את הפתרון לדגימות המאוחדות ולצנטריפוגה כמו קודם.

לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של PBS 1x קר כקרח. מוציאים את הבוכנה ממזרק של 20 מיליליטר ומניחים בצד. כסו את זרבובית המזרק, הניחו את המזרק בתוך צינור של 50 מיליליטר והעבירו לשם את מתלה התאים.

צנטריפוגה למשך חמש דקות בחום של 1000 x גרם, ארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט עם פיפטה עדינה המחוברת למערכת מלכודת ואקום עד שהשכבה העליונה של התאים מתחילה להישאב החוצה. התוצאה היא כדור תא רטוב.

פתחו את מכסה המזרק, הכניסו את הבוכנה וטפטפו את התאים ישירות לכוס פלסטיק גדולה מלאה בחנקן נוזלי המוחזקת באמבט חנקן נוזלי בקופסת קלקר. צללו בכוח את התאים הנותרים מהמזרק. לאחר מכן, שפכו את התאים הקפואים לצינורות של 50 מיליליטר.

מכסה את הצינורות באופן רופף כדי לאפשר לעודף חנקן נוזלי להתאדות. החזיקו אותם למשך הלילה בחום של 80 מעלות צלזיוס. הדק את המכסים במלואם למחרת.

ניתן לאחסן את התאים הקפואים בדרך זו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד להקפאה. הסר את חרוזי התא מהמקפיא של 80 מעלות צלזיוס והניח אותם במחזיק צינור של 50 מיליליטר באמבט חנקן נוזלי. מצננים מראש צנצנת של 50 מיליליטר, שני כדורים של 20 מילימטר ואת מכסה הצנצנת בדלי קרח מלבני נקי המכיל חנקן נוזלי.

כמו כן, יש לקרר מראש מבודד PTFE. השתמש בסט של פאקים או בשרוול ודיסקית. הגדר את האיזון המתאים על הטחנה.

בעזרת מלקחיים מניחים את שני כדורי הטחינה בקוטר 20 מילימטר מקוררים מראש ואת התאים הקפואים בתוך צנצנת הטחינה שהתקררה מראש. מוסיפים חנקן נוזלי לצנצנת עד חצי מלא, מניחים את המכסה על הצנצנת ומעבירים את המכלול לטחנה. מהדק את המכלול במקומו ובצע שלושה מחזורי כרסום, באמצעות תוכנית של 400 סל"ד, שלוש דקות, סיבוב הפוך בכל דקה וללא הפסקת מרווח.

זה קריטי לשמוע את הכדורים מקשקשים במהלך הטחינה, זה מצביע על כך שהכדורים מתנגשים ומרסקים את החומר. אי שמיעת צליל זה פירושה שלא מתרחשת כרסום. עם השלמת שלושה מחזורי כרסום, החזירו את הצנצנת לחנקן נוזלי ותנו לה לנוח לרגע להתקרר.

הסר בזהירות את המכסה. מוציאים את הכדורים בעזרת מלקחיים ומעבירים את האבקה לצינור מקורר מראש של 50 מיליליטר בעזרת מרית מקוררת מראש. שימו לב שהוספת חנקן נוזלי לצנצנת יכולה לעזור להוציא אבקה שמונחת על הכדורים.

להכנת תמצית תאים, שקלו 100 מיליגרם של אבקת תאים לתוך צינור מיקרופוגה מקורר מראש של 1.5 או שני מיליליטר. יש איזון אנליטי עם צינור המיקרופוגה הריק. הוצא את אבקת התאים לתוך הצינור באמצעות כף מקוררת חנקן נוזלי או מרית.

בדוק את מסת האבקה המחולקת בתוך הצינור באיזון האנליטי לפני החזרת הצינור לחנקן נוזלי. פתח את הצינור עם אבקת תאים ותן לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי לשחרר לחץ בתוך הצינור ולמנוע הקפאה מיידית של מאגר החילוץ בעת הוספתו לאבקה. הוסף לצינור 400 מיקרוליטר של חומר מיצוי, בתוספת מעכבי פרוטאז.

מערבל את הצינור לזמן קצר ואז החזק קרח. השתמש באולטרסאונד מיקרו קצה כדי לתת לדגימה דופק קצר באנרגיה נמוכה ולפזר כל אגרגטים. הבהירו את התמצית על ידי צנטריפוגה.

לבסוף, הסר את הסופרנטנט והמשך ללכידת האהדה. כדי לשטוף מראש את מדיום הזיקה, הנח את הצינורות המכילים חרוזים פרמגנטיים מצומדים לנוגדנים על המגנט. החרוזים יצטברו בצד הצינור תוך שניות, ויאפשרו להסיר את תמיסת האחסון.

לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מיצוי לחרוזים. מערבולת קצרה במהירות בינונית לערבוב. בנוסף סובב את הצינורות במיני צנטריפוגה כדי לאסוף את כל התכולה לתחתית הצינור.

לאחר מכן הניחו את הצינורות על המגנט ושאבו את התמיסה. התחל את לכידת הזיקה על ידי העברת תמצית התאים המובהרת לצינורות המכילים מדיום זיקה ומערבולת שטופים מראש לזמן קצר. דגרו את הצינורות למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין רציף על גלגל מסובב.

החרוזים צריכים להישאר תלויים לאורך כל הדגירה. שאפו את הסופרנטנט ושטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר מיצוי קר. כדי לנטרל את החלבונים, הוסף מאגר דגימת דף SDS ללא חומר מפחית, כדי להפחית את שחרור שרשראות הנוגדנים מהחרוזים.

דוגרים במשך חמש עד עשר דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה. אספו ושמרו את הסופרנטנט, ואז העבירו את הדגימות לדף SDS, ולאחר מכן צביעת חלבון בטכניקות סטנדרטיות. ניתן לכרות רצועות חלבון בודדות לזיהוי, או לאפיין את הדגימה כולה בניתוח יחיד על ידי אלקטרופור הדגימה לזמן קצר בלבד.

החומר המהווה את המדיום הבלתי מסיס המשמש ללכידת הזיקה יכול להשפיע על הפרוטאום המשוחזר. מוצגים כאן חרוזים מגנטיים, אגרוז ספוג ברזל ואגרוז מסורתי. כל מדיום הוצמד לנוגדנים נגד FLAG M2, ושימש ללכידת פוספטאז אלקליין חיידקי מתויג FLAG בתמציות המיוצרות מתאי HEK 293 בהקפאה.

חרוזים מגנטיים בקנה מידה מיקרוני הראו את הפרופיל הנקי ביותר, מה שמצביע על רמה נמוכה יחסית של ספיחת חלבון לא ספציפית. שיטת ליזיס התאים יכולה להשפיע גם על הפרוטאום המשוחזר. כאן, קומפלקס חלבון אנדוגני היה נתון ללכידת זיקה מתמציות תאים קריומיליים או סוניקטיביות.

פחות מזהמים בעלי מסה גבוהה נצפו כאשר תמצית התאים הופקה מאבקת תאים בהקפאה. למרות שמדיה מגנטית עשויה להציג רקע נמוך יותר ממדיה אחרת, הנוגדן עצמו עשוי להקל על ספיחה של זיהום חיובי כוזב, במיוחד בהיעדר אנטיגן המטרה שלו. כדי לקבוע את קשירת הרקע שתורם המדיום המגנטי נגד FLAG כאשר פרטופים של נוגדנים תפוסים או אינם תפוסים, נערכו ניסויי לכידת זיקה מדומים באמצעות תמציות תאי HEK 293T בנוכחות, או בהיעדר, של ספייק אין של פפטיד FLAG פי 3.

בהיעדר האפיטופ הקוגנטי שלו, מדיום אלפא FLAG אכן לוכד רמה ניתנת לזיהוי של חלבוני רקע שניתן להתחמק מהם באופן תחרותי עם פפטיד 3x FLAG ולהתחמק במידה רבה יותר על ידי מאגר דגימת דפי SDS. מין מזהם דומיננטי נצפה בין 37 ל-50 קילו-דלטון. בנוכחות אפיטופ מתחרה, גם 3x FLAG וגם SDS נקיים יחסית מקשירת חלבון רקע.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעבוד בזהירות, במהירות ובדייקנות. עקוב אחר הנהלים שלך וכל הווריאציות שנצפו, כדי ללמוד אילו שלבים הם הקריטיים ביותר לתוצאות שלך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספקטרומטריית מסה, צנטריפוגה אזורית קצב ומיקרוסקופ אלקטרונים כדי לנתח את הרכב התערובת, רמת ההומוגניות שלה וגודל וצורה של קומפלקסים מקרומולקולריים מרכיבים.

לאחר פיתוחו, לכידת זיקה סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטאומיקה לחקור את ההרכבים של קומפלקסים פיזיולוגיים של חלבונים בפירוט שאין שני לו, שנותר מאמץ מחקרי עולמי מתמשך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תאים של יונקים להקפאה, וכיצד לבצע לכידת זיקה של חלבון מעניין.