Name: מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח Ustilago maydis ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למד שיטת החלפת גנים לשינוי גנטי של Ustilago maydis באמצעות פרוטופלסטים. פרוטוקול זה מאפשר יצירת מוטנטים מחוסרים לחקר תפקודי גנים בפתוגניות פטרייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה מיוחדת לד&quot;ר בנדיקט Steuten לקריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה המקורית על chitinases בוצע על ידי ד&quot;ר תורסטן Langner. המעבדה של VG נתמך לפי האשכול של מצוינות למדעי הצמח (CEPLAS, DFG EXC 1028) ו BioSC, המעבדה של KS הוא נתמך על ידי BioSC. KB נתמך על ידי BioSC. הפעילות המדעית של מרכז המדע Bioeconomy (BioSC) נתמכו כלכלית על ידי משרד חדשנות, מדע ומחקר במסגרת של NRW Strategieprojekt BioSC (מס &#39;313 / 323-400-00213). LF נתמך על ידי דוקטורט של 1525 iGRADplant קבוצת הדרכת המחקר הבינלאומי DFG.

<ol><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).</li>
<li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+development+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Fems+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis.</a> Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).</li>
<li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ustilago+maydis%2C+the+delightful+blight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ustilago maydis, the delightful blight.</a> Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).</li>
<li>Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homologous+recombination+system+of+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The homologous recombination system of Ustilago maydis.</a> Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).</li>
<li>Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mating+and+pathogenic+development+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis.</a> Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).</li>
<li>Ökmen, B., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+plant%3A+Biotrophic+strategies+to+modulate+host+immunity+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).</li>
<li>Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+approach+for+generating+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).</li>
<li>Kämper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+system+for+highly+efficient+generation+of+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).</li>
<li>Terfrüchte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+versatile+Golden+Gate+cloning+system+for+genetic+engineering+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi.</a> Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).</li>
<li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+Method+for+Assessing+Pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+Maize+and+Teosinte+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).</li>
<li>Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FLP-mediated+recombination+for+the+functional+analysis+of+an+effector+gene+family+in+the+biotrophic+smut+fungus+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis.</a> New Phytologist. 187, 957-968 (2010).</li>
<li>van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phleomycin+Increases+Transformation+Efficiency+and+Promotes+Single+Integrations+in+Schizophyllum+commune%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune.</a> Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).</li>
<li>Sarkari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+expression+of+single-chain+antibodies+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).</li>
<li>Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+loci+of+Sporisorium+reilianum%3A+Novel+pattern+with+three+a+and+multiple+b+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities.</a> Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).</li>
<li>Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+Environmental+Stresses%2C+Cell-wall+Integrity%2C+and+Virulence+Are+Orchestrated+Through+the+Calcineurin+Pathway+in+Ustilago+hordei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei.</a> Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).</li>
<li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genetic+manipulation+protocol+for+Ustilago+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta.</a> FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).</li>
<li>Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+replacements+in+Neurospora+strains+deficient+for+nonhomologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining.</a> P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).</li>
<li>Colot, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+knockout+procedure+for+Neurospora+reveals+functions+for+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).</li>
<li>Langner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases+Are+Essential+for+Cell+Separation+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis.</a> Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).</li>
<li>Langner, T., Göhre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+chitinases%3A+function%2C+regulation%2C+and+potential+roles+in+plant%2Fpathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions.</a> Current Genetics. , (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloining%3A+a+laboratry+manual%22">Molecular Cloining: a laboratry manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+in+the+bW%2FbE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).</li>
<li>Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+RNA-binding+proteins+implicated+in+pathogenic+development+of+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis.</a> Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).</li>
<li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+KH+domains+of+Khd4+recognize+AUACCC+and+are+essential+for+regulation+of+morphology+as+well+as+pathogenicity+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis.</a> RNA. 15, 2206-2218 (2009).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+and+dynein+mediate+microtubule-dependent+co-transport+of+mRNPs+and+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes.</a> Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).</li>
<li>Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FYVE+zinc+finger+domain+protein+specifically+links+mRNA+transport+to+endosome+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Kronstad, J. W., Leong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+two+Alleles+of+the+b-Locus+of+Ustilago%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago.</a> P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).</li>
<li>Koepke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+Rrm4+is+essential+for+efficient+secretion+of+endochitinase+Cts1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1.</a> Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Schuler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hxt1%2C+a+monosaccharide+transporter+and+sensor+required+for+virulence+of+the+maize+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist+206%22%5BJournal%5D)">Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis.</a> New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).</li>
<li>Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+Ustilago+maydis+using+the+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system.</a> Fungal Genetics and Biology. , (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מוטציות מחיקות למחקרים גנטיים הפוכים ב U. maydis. נקודת המוצא היא קונסטרוקציה המחיקה המכיל רצפים איגוף של הגן של ריבית המכיל רצפים של כ 1 קילו במעלה הזרם של ההתחלה במורד הזרם של תחנת-קודון וכן קלטת התנגדות מתאימה כפי שהוא היה מותאם בעבר 7,9 . הבונה יש שתופק בנפרד עבור כל גן ומאומת בקפידה עבור שגיאות רצף לפני מחיקת הגן. מוטציות פוינט החביות יכולות לגרום לשינויים לא רצויים ברצף הגנומי, בפרט כשמדובר החביות להגיע אל גן השכן או המוטציה מש...

Ustilago maydis היא פטרייה מודל phytopathogenic כי נחקרה בהרחבה במשך עשרות שנים 1,2. היא קיימת בשני מורפולוגיות, שלב שמרים דמוי, שאינם פתוגניים וטופס filamentous, זיהומיות 3. תגליות פריצת דרך יוניברסל כגון מנגנוני רקומבינציה ותיקון DNA הומולוגיים נעשו בשלב הגדילה דמוי השמרים של פטריית 4 זו. יתר על כן, בורר מורפולוגיים לגורמי הנימה ארסי זיהומיות החשובים לזיהום הם היטב מאופיינים 5,6. הידע המולקולרי הגדיל אודות ביולוגיה ארסית של פטריית התועבה הזה מסתמך על אסטרטגיית התחדשות גן פשוט 7-9 הנתמך על ידי ביאור הגנום מעולה 10 ואת הקלות של גנטיקה הפוכה באמצעות, למשל, באוסף פלסמיד המאורגן היטב במכון שלנו (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). סטנדרטיים, מבחני זיהום מהירים של תירסeedlings לאפשר מחקרים מפורטים של פתוגניות גורמי 11. הגנום של U. maydis מכיל כ 6,900 גנים 10. כדי ללמוד את תפקידם, הם יכולים להימחק בנפרד או בשילוב בשל מערכת הומולוגית יעילה. אזורי איגוף של כ 1 kb המכילים קצוות הומולוגיים מושלם הם אידיאליים עבור שיעורים הומולוגיים יותר מ -50%, אבל כבר 250 נ&quot;ב עם קצוות שאינם הומולוגיים לאפשר מידה מסוימת של אינטגרציה הנכונה של המבנה 9. נכון לעכשיו, חמש קלטות התנגדות שונות, hygR, cbxR, natR, G418R, ו phleoR בתיווך התנגדות נגד hygromycin, carboxin, nourseothricin, G418 ו- phleomycin, מועסק כדי לבחור עבור transformants 7,9. בנוסף, התנגדות hygromycin כבר התפתחה קלטת למחזור (FRT-hygR) כי ניתן להסיר על ידי הביטוי החולף של recombinase FLP Heterologous 12. זה מאפשר סר של הקלטת התנגדות ובכך ב שינויים גנטיים בלתי מוגבלים תאוריה. Phleomycin הוא מוטגנים 13, כך שעם הקלטות החדשות, בפרט את קלטת hygR למחזור, שימוש phleoR הולך ופוחת. מוטציות Quadruple ולכן יכולות להיוצר באמצעות הקלטות הארבעה אחרים, אבל עבור מוטציות מחומשות, מערכת FRT-hygR מומלצת 14. אסטרטגיה מחיקת גן כללית זו הועברה בהצלחת פטריות תועבה אחרות כגון Sporisorium reilianum 15, ע &#39; 16 hordei, או U. אסכאלאנטה 17 ולכן מציע את הפוטנציאל עבור יישומים נוספים באורגניזמים עדיין גנטי סוררים עם מערכת הומולוגית יעילה. יתר על כן, אורגניזמים חסרי הומולוגיים יכול להיות שונה כדי לשפר את ההנדסה הגנטית כפי שהודגם על ידי מחיקה של גנים המעורבים שאינם הומולוגיים-אןד-מצטרף Neurospora crassa 18,19. כאן אנו מתארים את האסטרטגיה המחיקה גן שפורסם U. maydis 7,9 בפירוט הניסיון עם דגש על האימות המהירה ומדויקת של המועמדים. כדוגמא, אנו משתמשים chitinases פטרייתי מתארים את הדור של מוטציות יחידות, כמו גם מחיקת מספר זני 20,21. Chitinases הם דוגמאות מעניינות, כי הם פועלים על כיטין בקיר התא הנוקשה. שיפוץ דופן התא נדרש עבור שינויים מורפולוגיים במהלך חלוקת התא, לעבור לצמיחה פילמנטיות, ולאחר יצירת הנבגים. לפיכך, מוטנטים מחיקה פנוטיפים לאורך כל מחזור החיים ניתן לצפות.

<table><tbody><tr><td>חומצה אמינובנזואית (חומצה חופשית)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar&nbsp;</td><td>BD</td><td>214010</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>תמצית שמרים Bacto&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>10234</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Ca-Pantothenat (מלח Hemi-Ca)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2250</td><td></td></tr><tr><td>Carboxin&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>45371</td><td></td></tr><tr><td>חומצות קסאמינו&nbsp;</td><td>BD</td><td>223050</td><td></td></tr><tr><td>כולינכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C-1879</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>ChemSolute</td><td>24,321,000</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>CuSO4*5H2O</td><td>Fluka</td><td>61240</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>D(+)סוכרוז&nbsp;</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>DNA degr. חומצה חופשית&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D-3159</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3*6H2O</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>10288</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Geneticin (G418) מלח דיסולפט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma lysing Enzymes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glucose</td><td>Caelo</td><td>2580</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>פישר כימיקלים</td><td>G065015</td><td>לחלופין להשתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td>חומר מסוכן. אנא בדוק את הוראות הבטיחות של היצרן.</td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B-solution</td><td>Roth</td><td>1287.2</td><td>חומר מסוכן.&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>26764298</td><td>לחלופין להשתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A3620</td><td>לחלופין להשתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>MgSO4 ללא מים</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td><td>ללא מים הוא קריטי. לחלופין, השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>MnCl2*4H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2087</td><td>לחלופין השתמש בספק מקומי</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA*2H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>לחלופין השתמש בספק מקומי</td></tr><tr><td>Na2MoO4*2H2O</td><td>Roth</td><td>0274.2</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>12174</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S316060</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ChemSolute</td><td>13,751,000</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Roth</td><td>K299.1</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>חומצה ניקוטינית (חומצה חופשית)</td><td>Sigma אולדריץ'</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>נורסאותריצין דימימן גופרתי&nbsp; &nbsp;</td><td>Werner BioAgents</td><td>5,001,000</td><td></td></tr><tr><td>ציר מזין&nbsp;</td><td>ספקים מקומיים</td> <td>של Difco</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1) pH 6.7</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3803</td><td>חומר מסוכן. אנא בדוק את הוראות הבטיחות של היצרן.</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול (PEG)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>AppliChem</td><td>121479</td><td>לחלופין להשתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>פירידוקסין (מונוהידרוכלוריד)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P-9755</td><td></td></tr><tr><td>ריבופלבין&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R5503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>Cn30.3</td><td>לחלופין השתמש במזרק קטן של ספק מקומי</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>300300</td><td>לחלופין השתמש</td></tr><tr><td>במסנן סטרילי של ספק מקומי, 22 ומיקרו; m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>סורביטול</td><td>רוט</td><td>6213.1</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Thiamin-hydrochloride</td><td>Serva</td><td>36020.02</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>tri-Na-Citrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S332060</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Tris- (hydroxymethyl) aminomethane</td><td>VWR</td><td>103156X</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Roth</td><td>9090.4</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>סרווה&nbsp;</td><td>37240</td><td>לחלופין השתמש בספק המקומי</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Fluka</td><td>96470</td><td>לחלופין השתמש בספק מקומי</td></tr><tr><td>הרכב תמיסות/הכנת חומר</td><td></td><td></td><td>הרכב התמיסות</td></tr><tr>מלאי<td>קרבוקסין</td><td></td><td></td><td>: 5 מ"ג/מ"ל במתנול, ריכוז סופי: 2 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td> CM <td>0.25% (w/v) חומצות קסאמינו, 0.1% (w/v) תמצית שמרים, 1.0% (v/v) תמיסת ויטמין Holliday, 6.25% (v/v); תמיסת מלח הולידיי, 0.05% (w/v) DNA degr. חומצה חופשית, 0.15% (w/v) NH4NO3, 2.0% (w/v) Bacto Agar; להתאים ל-pH 7.0 באמצעות 5 M NaOH; לאחר החיטוי יש להוסיף 1% גלוקוז&nbsp;</td></tr><tr><td>גנטיצין (G418)</td><td></td><td></td> <td>מלאי: 50 מ"ג/מ"ל ב-H2O, ריכוז סופי: 500 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית שטופים ב-HCl (0.35-0.45 מ"מ)</td><td></td><td></td><td>מכסים חרוזי זכוכית ב-HCl מרוכז (25%, 7.8 מ') ודוגרים למשך 60 דקות. שפכו HCl (שמרו על נוזל מפורק) ושטפו חרוזי זכוכית עם 3 M HCl (שמרו על נוזל מפורק). שטפו חרוזי זכוכית מספר פעמים עם H2O מזוקק כפול עד שה-pH הוא 7 (הנוזל לא צריך להיות צהוב-ירוק יותר). ציטטו את חרוזי הזכוכית וייבשו אותם בטמפרטורה של 180 מעלות צלזיוס. יש לנטרל את ה-HCl המושקע לפני השלכתו.&nbsp;</td></tr><tr>מלאי <td>הפרין</td><td></td><td></td><td>: 15 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> מלח הולידיי <td>16.0 ופרמיל; (עם / נ) KH2PO4, 4.0 ופרמיל; (עם / נ) Na2SO4, 8.0 &permil; (עם / נ) KCl, 1.32 ופרמיל; (עם / נ) CaCl2*2H2O, 8.0 &permil; (V/V) יסודות קורט, 2.0 ופרמיל; (עם / נ) MgSO<תת>4; תמיסת ויטמין הולידיי מסוננת סטרילית</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1&פרמיל; (עם / נ) תיאמין, 0.05 ופרמיל; (עם / נ) ריבופלבין, 0.05 ופרמיל; (עם / נ) פירידוקסין, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) Ca-Pantothenat, (0.05 ופרמיל; (עם / נ) חומצה אמינובנזואית, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) חומצה ניקוטינית, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) כולינכלוריד, 1.0 ופרמיל; (w/v) מיו-אינוזיטול; ניתן לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td></td><td></td><td>Stock: 50 מ"ג/מ"ל ב-PBS, ריכוז סופי: 200 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מלאי נורסאותריצין</td><td></td><td></td><td>: 200 מ"ג/מ"ל ב-H2O, ריכוז סופי: 150 ומיקרו; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>NSY-גליצרול-בינוני</td><td></td><td></td><td>0.8% (w/v) ציר תזונתי, 0.1% (w/v) תמצית שמרים, 0.5% (w/v) סוכרוז, &nbsp; 80.0% (v/v) 87% גליצרין (f.c. 69.6%)&nbsp;</td></tr><tr><td>RegLight</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) תמצית שמרים&nbsp; 0.4% (w/v) בקטו פפטון, 0.4% (w/v) סוכרוז, 18.22% (w/v) סורביטול, 1.5% (w/v) Agar</td></tr><tr><td>SCS, pH 5.8</td><td></td><td></td><td>תמיסה 1: 20 מ"מ tri-Na-ציטראט, 1 M סורביטול; קולוטיון 2: 20 מ"מ חומצת לימון, 1 מ' סורביטול, הוסף תמיסה 2 לתמיסה 1 עד שמגיעים ל-pH 5.8; חיטוי</td></tr><tr><td>STC, pH 8</td><td></td><td></td><td>1 M סורביטול, 10 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 100 מ"מ CaCl2; מסנן סטרילי</td></tr><tr><td>STC/PEG</td><td></td><td></td><td>40% (v/v) PEG במאגר STC&nbsp;</td></tr><tr><td>חוצץ TE, pH 8</td><td></td><td></td><td>1.31 מ"מ Tris-Base, 8.69 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ Na2-EDTA*2H2O</td></tr><tr><td>TE/RNase</td><td></td><td></td><td>10 ומיקרו; גרם/מ"ל RNaseA במאגר TE</td></tr><tr><td>יסודות</td><td></td><td></td> קורט <td>0.06&permil; (עם / נ) H3BO3, 0.14&permil; (עם / נ) MnCl*4H2O, 0.4 &permil; (עם / נ) ZnCl2, 0.4 &permil; (עם / נ) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 &permil; (עם / נ) FeCl3*6H2O, 0.04&permil; (עם / נ) CuSO4*5H2O</td></tr><tr>תמיסת <td></td><td></td><td>אנזימי ליזינג Trichoderma</td><td>12.5 מ"ג/מ"ל SCS; מסנן סטרילי; הכן זמן קצר לפני השימוש</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.5</td><td></td><td></td><td>806 מ"מ Tris-HCl, 194 מ"מ Tris-Base; בדוק את ה-pH ובמידת הצורך התאם עם HCl; חיטוי</td></tr><tr><td>מאגר Usti-lysis 1, pH 8</td><td></td><td></td><td>10 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 10 מ"מ NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. אין למדוד pH באמצעות מד pH.&nbsp;</td></tr><tr><td>מאגר Usti-lysis 2</td><td></td><td></td><td>תערובת מאגר Usti lysis 1 עם 1x TE ביחס של 1:1</td></tr><tr><td>YEPS-Light בינוני</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) תמצית שמרים, 0.4% (w/v) בקטו פפטון, 0.4% (w/v) סוכרוז, לצלחות: 1.5% (w/v) בקטו אגר</td></tr></tbody></table>

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מחיקת ג&#39;ין ממלאת תפקיד חשוב בניתוח של תפקוד גן. אחת השיטות היעילות ביותר לשבש גנים באופן ממוקד הוא החלפת הגן כולו עם סמן לבחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגי. במהלך הומולוגי, חילופי DNA מתרחשים בין רצפים עם דמיון גבוה. לכן, רצפי הגנום ליניארי איגוף גן מטרה ניתן להשתמש כדי לכוון סמן לבחירה במיוחד לאתר אינטגרציה הרצוי. קצוות בלאנט של לבנות את המחיקה להפעיל את מערכות תיקון דנ&quot;א של התא ובכך לקדם אינטגרציה של המבנה או דרך רקומבינציה הומולוגי או שאינו הומולוגיים סוף-שהצטרף. באורגניזמים עם הומולוגיים יעילים, שיעור מחיקת גן מוצלח יכול להגיע ליותר מ -50% ביצוע אסטרטגיה זו מערכת שיבוש הגנטי יקרה. פטריית התועבה Ustilago maydis היא מיקרואורגניזם מודל אוקריוטים מראה recombinat הומולוגי יעיל כזהיוֹן. מתוך שלה על 6,900 גנים, רבים מתאפיינים תפקודי בעזרת מוטציות מחיקות, וחזר על כישלון נקודות ניסיונות החלפת גן על תפקוד חיוני של הגן. האפיון הבא של תפקוד הגן על ידי תיוג עם סמני ניאון או מוטציות של תחומים ניבאו גם מסתמך על חילופי דנ&quot;א באמצעות רקומבינציה הומולוגי. כאן, אנו מציגים את U. דור אסטרטגית זן maydis בפירוט באמצעות הדוגמא הפשוטה ביותר, את מחיקת הגן.

הקונסטרוקציות המחיקות של כל ארבעת הגנים chitinolytic רשומים U. הגנום maydis נוצרו על ידי שיבוט גולדן גייט באמצעות קלטת hygR למחיקה של cts1, את natR למחיקה של cts2, הקלטת G418R למחיקה של cts3 ואת cbxR למחיקה של cts4 20. סקירה כללית של אסטרטגיית התחדשות הגן מודגמת על ידי מחיקת cts3 (איור 1). מוטציות יחידות וכפולות של cts1...

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לשנות גנטית את פטריית הזימה, ustilago maydis. שיטת יצירת זנים זו מאפשרת אפיון פונקציונלי של גנים במגוון דרכים. לדוגמה, אנו יכולים למחוק את הגנים, אנו יכולים להחליף את הפרומוטוס, או אנו יכולים ליצור מבני היתוך.היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שאנו יכולים לאמת במדויק את השינוי, כך שניתן לקשר כל פנוטיפ ישירות לשינוי בגן המעניין. הדגמה חזותית של שיטה זו היא חיונית, מכיוון שהידיעה מתי לעצור את תגובת הפרוטופ-מתמשך היא קריטית לטרנספורמציה מוצלחת. בהכנה יש לקרר שני צינורות תחתונים עגולים של מיליליטר במינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, חסנו תרבית מוקדמת של שלושה מיליליטר ב-YEPS-Light באמצעות צלחת טרייה. דגרו אותו למשך 24 שעות על גלגל מסתובב בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. למחרת, הוסף 25 מיקרוליטר של התרבות המוקדמת ל -50 מיליליטר YEPS-Light בבקבוק מבולבל.לאחר מכן, גדל את התרבית על שייקר מסלולי עד שהיא מגיעה לשלב האקספוננציאלי. צפיפות אופטית של 1.0 מתאימה לאחד עד שניים כפול 10 לתאים השביעיים באוסטילגו מאידי. בדוק את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר.ערך של 0.6 עד 1.0 מקובל. לאחר מכן, בדוק את התאים לאיתור זיהום בהגדלה של פי 40. ניתן לזהות זיהומים חיידקיים כתאים קטנים ולעתים קרובות נעים.ניתן לזהות זיהומים פטרייתיים על סמך צורתם או גודלם. השליכו תמיד תרביות מזוהמות ועבדו רק מתרבויות נקיות. לאחר הטלת התאים במשך חמש דקות בטמפרטורה של 1,500 גרם, השליכו את הסופרננטנט.לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-25 מיליליטר SCS. חזור על הצנטריפוגה. ובינתיים, הכינו שלושה מיליליטר של תמיסה מתמשכת לכל כדור תא.העבירו את הפתרון הזה דרך פילטר 22 מיקרון. כעת השליכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של תמיסה פרוטופליסטית. לאחר מכן הניחו לתאים לנוח בטמפרטורת החדר עד ש-30 עד 40% מהם עגולים או בצורת ראש סיכה.התגובה יכולה להימשך חמש עד 20 דקות. התחל להתבונן בו מתחת למיקרוסקופ לאחר חמש דקות. כדי להשיג את יעילות הטרנספורמציה המקסימלית, יש להפסיק את התגובה הפרוטופלסטית ברגע הנכון.ואז, יש לטפל בפרוטופלסטים בזהירות רבה כאילו היו בועות סבון. המשך עם הפרוטוקול, תמיד שמור את הפרוטופלסטים על קרח. השלב הבא הוא לשטוף אותם עם 10 מיליליטר SCS קר, ואז לאסוף אותם בסיבוב של חמש דקות ב -1, 000 גרם.חזור על שלב כביסה זה בסך הכל שלוש פעמים.לאחר השטיפות, השעו מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר STC קר. לאחר מכן אספו את התאים שוב עם סיבוב של חמש דקות נוספות ב-1,000 גרם, ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-1 מיליליטר של STC קר. כעת הכינו 100 מיקרוליטר אליקוטים בצינורות הקרים, ואחסנו את האליקוטים הללו במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי להמיר פרוטופלסטים של ustilago maydis, הכינו שתי בחירות לכל טרנספורמציה. ראשית, ממיסים את אגר RegLight ומצננים אותו ל-60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחלק מהאגר המומס, הוסיפו את האנטיביוטיקה הסלקטיבית בריכוז כפול מהריכוז העובד, והוסיפו 12 מיליליטר לכל צלחת ליצירת השכבה התחתונה.יש לערבב את הדגימה בזהירות. הימנע מיצירת בועות. שמור את יתרת ה-RegLight ללא אנטיביוטיקה על 60 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הפשירו צינור אחד של פרוטופלסטים על קרח עבור כל טרנספורמציה. לאחר ההפשרה, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת הפרין ומיקרוגרם אחד של DNA מבנה ליניארי. לאחר מכן שמור אותם על קרח למשך 10 דקות.בזמן ההמתנה, מורחים 12 מיליליטר של RegLight ללא אנטיביוטיקה על ה-RegLight עם אנטיביוטיקה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של STC/PEG לכל צינור טרנספורמציה וערבב אותם בזהירות עם היפוכים. לאחר מכן המשיכו את הדגירה על קרח למשך 15 דקות נוספות.כעת חלקו כל תגובת טרנספורמציה על שתי לוחות RegLight סלקטיביים נפרדים. וודא שכל הנוזלים נספגו בצלחות לפני שתמשיך. לאחר מכן, דגרו את הצלחות זקופות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמישה עד שבעה ימים כדי לקבל 100 עד 200 מושבות.אם רק כמה מושבות גדלות, הפרוטופלסטים עשויים להכיל יותר מדי דופן תא, וניתן לבדוק זאת על ידי הפיכתם עם פלזמה לייצור תאים או שהם לא יוכלו להתחדש וניתן לבדוק זאת על ידי שתילתם על צלחות ללא אנטיביוטיקה. מאוחר יותר, בחר 24 שנאים לבדיקה. טהר אותם מחדש ב-YEPS-Light סלקטיבי כדי להשיג מושבות בודדות.על כל צלחת, פס גם חלק מהזן המקורי כדי לוודא שהאנטיביוטיקה בוחרת נגד חומרים שאינם טרנספורמציה. זה קריטי לאמת את המוטציות באמצעות תהליך בן שלושה שלבים הכולל שני PCR וניתוח כתם דרומי. אלה מפורטים בפרוטוקול הטקסט.סעיף זה מסביר כיצד להכין את ה-DNA הגנומי הדרוש לניתוחים אלה. ראשית, יש לחסן חמישה מיליליטר של YEPS-Light עם הטרנספורמנט המועמד, ולדגור אותו על גלגל מסתובב למשך 24 שעות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. למחרת, זרוק שני מיקרוליטר של התרבית על צלחת CM.שמור על התרבות סטרילית. לאחר מכן הכינו צינור של שני מיליליטר עם כ -200 מיקרוליטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה הידרוכלורית ושני מיליליטר של התרבות של 24 שעות. לאחר סיבוב הצינור ב -12, 000 גרם למשך חמש דקות, שאפו והשליכו את הסופרנטנט.לגלולה, שעשויה להיות קפואה לאחסון, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר usti-lysis שתיים. לאחר מכן יש לנער את השפופרת במהירות של 1,000 סל"ד על ויברקס למשך חמש עד 15 דקות. ודא שהתאים מושעים מחדש לחלוטין, ולאחר מכן דגר את הצינור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות.לאחר מכן, הניחו את הצינור על קרח למשך חמש דקות. לאחר שהתקרר, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 8 אשלגן אצטט מולארי, ומרחו מערבולת קצרה, או עשר היפוכים. לאחר מכן, סובב את הצינור בחום של 12, 000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, ציטטו 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור של 1.5 מיליליטר, והוסיפו 400 מיקרוליטר של איזופרופנול לאליקווט. לאחר הערבוב, סובב את הצינור למשך חמש דקות בחום של 12,000 גרם.השליכו את הסופרנטנט ושטפו את ה-DNA הגלולי עם 500 מיקרוליטר של 70% אתנול. כעת יש להסתובב חמש דקות ולהסיר לחלוטין את הסופרנטנט.לאחר סיבוב קצר נוסף, הניחו לכדור ה-DNA להתייבש באוויר למשך מספר דקות, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של RNase NTE. לאחר הוספת ה-RNase, יש לדגור עם טלטול, ולאחר מכן להמשיך להשתמש ב-DNA לניתוחים. מוטציות בודדות וכפולות של הדלתא cts3 של צ'ינטינאזות ומוטציות מרובות עם עד שלושת הגנים האחרים של כיטינאז נוצרו ברצף עם אותם מבנים בשני רקעים גנטיים שונים.טרנספורמנטים אושרו על ידי PCR ולאחר מכן על ידי ניתוח Southern Blot. עבור הגן cts3, שיעור הרקומבינציה ההומולוגית היה 70% בזן SG200, מה שמצביע על כך של-cts3 יש תפקיד לא חיוני. חלק מהמוטציות מובילות לפגמים ברורים בגדילה.לדוגמה, למוטציה הכפולה cts1/2 היה פגם בולט בהפרדת התאים. צביעת המחיצה הראתה שהציטוקינזיס יושלם, אך התאים יישארו מחוברים. כדי לבחון את תרומתם של כיטינאזות לאלימות, בוצעו בדיקות זיהום שתילים באמצעות מוטציות זן SG200.בעוד שמוטציה של גן מבוקר, khd4, הפחיתה את האלימות, מחיקת כל הצ'יטינאזות לא השפיעה על זיהום שתילי תירס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשנות גנטית פטריות זימה כמו ustilago maydis. לאחר השליטה, ניתן ליצור זנים בקלות תוך כארבעה שבועות.בעת שימוש בהליך זה, חשוב מאוד לתכנן את פרטי אימות הזן באמצעות תוכניות שיבוט עתידיות. עשה זאת לפני שתתחיל לעבוד עם תרביות פטרייתיות. עם שינויים קלים בהליך זה, ניתן לשנות גנטית פטריות זימה אחרות כמו sporsorium reilianum או ustilago esculenta או אפילו פטריות חוטיות, כמו piriformospora indica.אל תשכח שעבודה עם אורגניזמים מהונדסים גנטית צריכה להתבצע בהתאם לתקנות במדינה שלך.

genetic-manipulation-plant-pathogen-ustilago-maydis-to-study-fungal

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג...

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

השימוש בשיטת הזרקת מחט לחסן תירס וצמחי teosinte עם פתוגן ביוטרופי Ustilago maydis מתואר.  שיטת החיסון להזרקת מחט מקלה על מסירה מבוקרת של הפתוגן הפטרייתי בין עלי הצמח שבהם הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות appresoria. שיטה זו יעילה ביותר, ומאפשרת חיסונים הניתנים לשחזור עם U. maydis.

שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של מיאדי אוסטילגו על קווי תירס וטוסינטה

מערכת cocultivation הידרופוני שתואר תומך צמחים שלם עם מסכי רשת מתכת cocultivates אותם עם חיידקים. רקמות הצמח, חיידקים, ומולקולות מופרדים אז ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים במורד הזרם, בו זמנית מאפשר תגובות מולקולריות של שני המארחים צמח אינטראקציה חיידקים או microbiomes להיחקר.

הידרופוני Co- טיפוח מערכת לניתוח סימולטני ושיטתי של הצמח / מיקרובי אינטראקציות מולקולרית איתות

פטריות הזימה לגרום למחלות רבות החקלאי הרסנית. הם מופצים כמו teliospores רדום זה לנבוט בתגובה לאותות סביבתיים. אנו מכינים שתי שיטות כדי לחקור את השינויים המולקולריים במהלך הנביטה: מדידת נשימה עלייה כדי לזהות מטבולית הפעלה והערכה שינוי האירועים המולקולריים המתרחשים על-ידי בידוד teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים.

חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לבדוק התקפה אלימה צמח עם המחלה צמח Magnaporthe grisea. דוח זה לתרום הקרנת בקנה מידה גדול pathotypes של פטריות מבודד, לשמש נקודת התחלה מצוינת להבנת מנגנוני עמידות הצמחים במהלך ההתרבות מולקולרית.

הבדיקה זיהום צמח: ריסוס, בתיווך הפצע חיסון עם הפתוגן של צמח Magnaporthe Grisea

עבודה זו מתארת את שכפול של זן סוס טרויאני פחמון זקן התירס למסירה באתרו של חלבונים תירס מופרשים לתוך שלושה סוגים שונים של רקמות תירס.

בעזרת פחמון זקן התירס כמו סוס טרויאני ב באתרו משלוח של תירס חלבונים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9 היא עורכת גנום קלה לשימוש ששימשה למינים מודלים ולא דגם. כאן אנו מציגים גרסה מבוססת חלבון של מערכת זו ששימשה להכנסת קודון עצירה מוקדמת לגן הזדווגות של פטריית אסקומיסט לא מודלית.

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל וניתן לשכפול לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora, שמתאים גם ל-P. capsici.

שיטה מפושטת לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora

למד שיטת החלפת גנים לשינוי גנטי של Ustilago maydis באמצעות פרוטופלסטים. פרוטוקול זה מאפשר יצירת מוטנטים מחוסרים לחקר תפקודי גנים בפתוגניות פטרייתית.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח

גלה סרטונים נוספים