Name: הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: למדו הכנת פרוסות אלכסון של חוט השדרה מעכברים צעירים לגירוי שורשים גחוניים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מוטונורונים ומחקר תאים גחוניים המעוצבים על ידי שלוחות אקסונים מוטונורליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים מרין מנואל ואוליביה גולדמן-Szwajkajzer על עזרתם לוקח את התצלומים. המחברים מודים גם ארג&#39;ון Masukar וטוביאס בוק להגהה את כתב היד. תומך פיננסי נמסרו על ידי Nationale Agence לשפוך la משוכלל ונדיר (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), ה- NIH-NINDS (R01NS077863), קרן תיירי לטראן (פרויקט OHEX), האגודה הצרפתית מיופתיה ( מספר מענק 16026) ומחיר היעד ALS הם הודו בהכרת תודה. פליקס לירוי היה הנמען של &quot;דוקטור Contrat&quot; ​​מן אקול נורמל סופרייר, Cachan.

הניסויים בוצעו בהתאם להוראות האירופי (86/609 / CEE ו- 2010-63-UE) וחקיקה צרפתית, ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פריז דקארט. 1. חוט שדרה כנה Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים יומי או יום אחד מראש. אם כל זמן הלילה, בועה עם 95% O 2, 5% CO 2 ולשמור בקירור בקבוקי סגור היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נמוך Na + מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF): 3 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 230 סוכרוז מ&quot;מ, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, 0.8 מ&quot;מ 2 CaCl, 8 מ&quot;מ MgCl 2, 25 גלוקוז מ&quot;מ, חומצה אסקורבית 0.4 מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ Na-kynurenate, 2 מ&quot;מ Na-פירובט. בועה עם 95% O 2 ו -5% CO 2 (pH 7.4). מאז Na-kynurenate הוא לעתים קרובות קשה לפזר, לוודא כדי לרכוש את הכבל מפורט בטבלת החומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן solu-גלוקונאט Ktion: 130 מ&quot;מ K-גלוקונאט, 15 מ&quot;מ KCl, 0.05 מ&quot;מ EGTA, 20 HEPES מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ גלוקוז, 1 מ&quot;מ Na-kynurenate, 2 מ&quot;מ Na-פירובט, מותאם pH 7.4 עם KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ACSF: 130 mM NaCl, KCl 2.5 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ 2 CaCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, 25 גלוקוז מ&quot;מ, 0.4 חומצה אסקורבית מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ Na-פירובט. בועה עם 95% O 2 ו -5% CO 2 (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת לנתיחה, לפזר אגר 2% ב 80 מ&quot;ל של תמיסת-גלוקונאט K, להתחמם על 60 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף intracardiac <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע הכנה זו על עכברים נשיים וגבריים, שגילן נע בין P2 ל P11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של 0.1 מ&quot;ל של 25 מ&quot;מ נתרן pentobarbital (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחטים או קלטת, לשתק את העכבר על גבה על צלחת פטרי גדולה מלאת סיליקון. השתמש microscop לנתחדואר לשארית לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת קצה עצם החזה, הרם את החזה וחתך את הסרעפת באמצעות מספריים בסדר. לאחר מכן פתח את החזה משני הצדדים על ידי חיתוך דרך הצלעות כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אטריום ימין לפני ניקוב החדר השמאלי עם מחט 27G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם ACSF Na + נמוך קר כקרח. לאחר 30 שניות, נמוך Na + ACSF יש לראות זורם החוצה של אטריום. כמויות נמוכות של נתרן למנוע את התאים מפני spiking ולהפחית מוות הסלולר במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ללחוץ על למחט בלב תחת מיקרוסקופ לנתח עד שהכבד הופך צהוב כאשר הדם מנוקז. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחת חוט שדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את החיה ולשים אותו על הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את העור של הגב (איור 1A1). בשני חתכים דרך הכתפיים יורדים כלוב החזה (איור 1A2). ואז לחתוך את חבל הטבור כפי low ככל האפשר בחלק הזנב כדי לבודד את עמוד השדרה עם תחילת הצלעות מהחלק התחתון של החיה. הפוך את החיה שוב להסיר את הקרביים עדיין מחוברים הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את עמוד השדרה למשנהו, צלחת פטרי מלאות סיליקון קטן ולהשתמש 4 סיכות חרקים להחזיק עד הגבי זה בצד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות perfuse חיה עם ACSF-מבעבע carbogen (בסביבות 4 מעלות צלזיוס) תוך ביצוע laminectomy של הצד הגבה, וחשיפת חוט השדרה של הסוף המקורי (איור 1 ב). לשם כך, הכנס את הקצה מספרי בסדר בין העצם ואת חוט השדרה וחתכת את עצם טיפות טיפות המסוף המקורי, והקפד להתרחק בחומר הלבן. מתחלף בכל צד תוך שימוש בפינצטה כדי להרחיק את הלהקה של העצם כבר לחתוך (איור 1B1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספרי האביב זמינים הקטנים פינצטה, להרים את הדורה וחותךמשני הצדדים בעת החזקת חלק רופף של דורה כדי למנוע נזק לחוט השדרה עם מספריים. חותכים לאורך ציר rostro- הזנב. הערה: הדורה היא קרום רציף שקוף למחצה; בגיל זה מאטר פיא היא שברירית מדי יתפורר במהלך הניתוח וחותך (איור 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדורה היא שימוש שהוסר כוס בוטה או קצה פלסטיק לדחוף את הכבל בעדינות בצד השמאל של החריץ שנוצר על ידי עמוד השדרה חצי לחתוך, לחתוך את שורשי גחון ועל גב בצד ימין, החלה מהצד המקורי קליעה, ממקום שבו הם מזינים את הכבל (כמה מ&quot;מ לפחות, איור 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה בצד שמאל, תמיד הולך מ מקורי כדי הזנב. אם שמאלי, להתחיל מהאגף השמאלי ולאחר מכן לעבור לצד ימין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוץ אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק את החוט מתוך עמוד השדרה. בעזרת מערוך חרקים קטן להצמידאת הכבל עם פני השטח הגבה עד ולהסיר כל פיסת הממברנה בעדינות עדיין קשור אליו (איור 1C1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לנקות, לקצץ את שני הקצוות (איור 1C2). הכנס סיכה חרקים bended בחלק הקדמי של חוט כדי לתפעל את כבל ושים לב האוריינטציה שלו (החץ באיור 1C2). ואז להעביר את חוט השדרה פתרון קר כקרח K-גלוקונאט. הערה: פתרון זה מחק את הרכב התאי של CSF וימנע תאים מהמוות של הלם אוסמוטי פעם motoneurons יקוצץ 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חוט השדרה הוא בתוך פתרון תוך התאי, לקחת הכוס עם אגר מתוך האמבטיה היבשה לקרר אותו על תערובת של קרח ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחוש תוך מדידת הטמפרטורה. כאשר הטמפרטורה מגיעה 38 ° C לטבול את חוט השדרה, מחזיק אותו על ידי סיכת החרק ולמקם אותו מקורי צד למטה. ודא חוט השדרה הוא כמו straight ככל האפשר, הרחק מהקירות, חלק הזנב מעט כלפי מעלה (איור 1D1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הכוס בתערובת של קרח ומים לאפשר אגר לגבש מהר ככל האפשר. ודא שהוא נשאר במקום שהכבל הוא וישר ככל האפשר (איור 1D1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פִּלוּחַ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמצקות, חותך את הגוש אגר המכיל את חוט השדרה בצורה כזאת, כי הבסיס של הבלוק הוא בזווית 35 מעלות עם החלק המותני של החוט (חץ באיור 1D2). המשטח הגבה צריכה להיות פונה משם מהבסיס (האיור 1D2). הערה: זהו צעד קריטי בהליך עבור שמירה על הרצף של ברכות motoneuron לשורשי הגחון שממנו הם יוצאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את הבלוק לתוך התא של vibratome באמצעות דבק cyanoacrylate. לטבול אותו פתרון K-גלוקונאט ולהוסיף פתרון-גלוקונאט K קפוא דשדשנו לשמורבאמבטיה מקוררת (מתחת ל -2 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 350 - 400 מיקרומטר פרוסות עבות של האזור המותני (לזיהוי על ידי העקמומיות שלה בקוטר גדול יותר). ב הכיוון הנכון שלה (ראה 1.4.1.), השתמש להב לחתוך מן הגב אל פני השטח הגחון ולעשות פרוסות ברציפות יותר מקורי. בדרך כלל, ישנם 4-5 פרוסות מתאימות עם שורשי גחון הארכת 2 מ&quot;מ או יותר. השתמש בפרמטרים הבאים: 10 ° זווית, 70 הרץ תדירות הרטט 10 מ&quot;מ / דקה מהירות של חיתוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דְגִירָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפרוסות ACSF ב 34 ° C. לאחר כ 30 דקות, לצנן את הפרוסות עד RT ולהתחיל את ההקלטות. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> באיור 1. Dissection A1:. הסרת העור של הגב לחשוף בעמודה הגבה A2:חיתוך של הכתפיים והצלעות לשחרר את הגב טור B1:. עמוד השדרה הצמיד על צלחת פטרי מלאות סיליקון (צד הגב למעלה, בצד הזנב השמאלי) B2:. אותו דבר עם חוט השדרה חשוף גזור C1:. חוט השדרה מבודד . (מקורי בצד שמאל) C2: חוט שדרה מוכן להיות מוטבעים (עד צד הגחוני, בצד מקורה שמאל). שים לב סיכת החרק הקטנה בצד המקורי D1:.. חוט שדרה בכוס אגרה (דאו צד מקורי, בצד גחון מול התחתון) D2: בלוק אגר Cut עם חוט השדרה המוטבע. הערת זווית 35 ° צורות חוט השדרה עם הבסיס של הבלוק ואת ההרחבה המותני (חץ). ברי סולם 1 סנטימטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2. הצבת Slice לתוך הקאמרי הערה: Veשורשי ntral הם באורך משתנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן קופסא טפטפות שונים בקטרי טיפ הנעים בין 40 ל 170 מיקרומטר מראש. כדי להכין טפטפות יניקה, להכין טפטפות רבים עם להתחדד ארוך. בעזרת סכין יהלום, לעשות חתך שהוצבו בנקודות שונות. אז תחת מיקרוסקופ לנתח, לשבור אותו על ידי להכות את הקצה עם פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תא המיקרוסקופ הקלטה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרוסה המכילה שורש גחון של אורך מספיק (2 מ&quot;מ או יותר) כדי להיות מותקנות על האלקטרודה גירוי יניקה. בחר את הכיוון הנכון של הפרוסה עם שורשי הגחון כלפי מעלה (איור 2 א) ובעדינות לחתוך את אגר סביב שורשי הגחון ולהשאיר את השאר של אגר ברחבי הפרוסה (התרשים 2B). הערה: מאחר אגר הוא נחוש יותר הפרוס, זה יאפשר את החוטים של העוגן של הפרוסה לנוח על אגר ולא על הפרוסה ובכך אnchor לא לגרום נזק לרקמות. ודא החוטים של העוגן של הפרוסה הם מעל ברכת motoneuron (באדום באיור 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרית בחזרה אל המיקרוסקופ ברציפות perfuse לתא הקלטה עם ACSF בשיעור של 1 - 2 מ&quot;ל / דקה, ב RT. בעזרת פיפטה זכוכית מלאה ACSF ומחובר מזרק, למצוץ אחד שורש הגחון (חץ באיור 2C). על מנת להשיג גירוי טוב של שורש הגחון, קצה פיפטה צריך להיות הדוק סביב שורש הגחון. מוט אחד צריך להיות ב האלקטרודה מגרה והשני באמבטיה (או מחובר הפניה אלקטרודה-clamping תיקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקלטת תיקון- clamp של תא מהסוג הרצוי ולהקליט את השפעת גירוי שורש הגחון כמתואר previsouly 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, השתמש מגבר לרכישת נתונים. מסנן כל תא הקלטות ב 3 קילוהרץ. לספרה ב 10 קילוהרץ. לפצות התנגדות גשר curreמצב NT-מהדק. </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> איור 2. גחון רוט כן ת: פרוסת חוט השדרה המותני מוטבע אגר עם השורש הגחוני פונה כלפי מעלה ב:. פרוסת חוט השדרה המותני עם השורשים הגחון משוחרר מן אגר C:. פרוסת חוט השדרה המותני עם אלקטרודה מגרה הניח בחוזקה סביב השורשים הגחון (חץ) . שים לב למיקום של תאי רנשו להביע קרינה אדומה chrna2-Cre עכבר 28 חצה עם כתב העכבר R26 טום 17. ברי סולם 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol><li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li>
<li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li>
<li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li>
<li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417(2007).</li>
<li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li>
<li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals%3A+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li>
<li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li>
<li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86(1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li>
<li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G%2893A-Low%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li>
<li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li>
<li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li>
<li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li>
<li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li>
<li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li>
<li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li>
<li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li>
<li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li>
<li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gower%27s+tract+and+spinal+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li>
<li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Psychiatr+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li>
<li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li>
<li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-%2C+T-%2C+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li>
<li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חיתוך אלכסוני של חוט השדרה הוא חשוב שכן הוא מאפשר גירוי חד-צדדי של ברכות motoneuron ותאי Renshaw בכל מגזר בחוליות יחיד באופן אמין, מקיף וספציפי. יתר על כן, היא מאפשרת זיהוי מהיר, אלגנטי ולא מעורפל של motoneurons מוקלט. לאחר מכן, אנו נדגיש את היתרונות של טכניקה זו לעומת שיטות כנות פרוסה אחרות, ולאחר מכן אנו נדגיש את החסרונות הנפוצים ביותר כדי להימנע בעת ביצוע הליך זה. רוב המחקרים באמצעות פרוסות רוחביות לבסס הזדהות...

מבחינה היסטורית, הקלטות motoneuron באמצעות אלקטרודה חדה נערכו in vivo על בעלי חיים גדולים כגון חתולים או חולדות 1 או על חוט השדרה כולו מבודד בעכברים 2. הופעה של טכניקת הקלטת תיקון- clamp במהלך 1980, קרא גישה ישירה אל motoneuron somas איטום צריך להיות מושגת תחת הנחיה חזותית. לפיכך, הכנת פרוסת חוט השדרה הושגה בקלות מאז תחילת שנות 1990 3. עם זאת, להכנת פרוסה מוקדם לעתים קרובות לא מאפשרת הגירוי של שורשי הגחון. למיטב ידיעתנו, רק שני מחקרים דיווחו גירוי מוצלח של שורשי הגחון פרוסים רוחבי, ואף אחד הושג מעכברי 4,5. במאמר זה אנו מציגים טכניקה כדי להשיג פרוסות חוט השדרה קיימא של עכברים בילוד (P2 - P11) שבו הבריכה motoneuron שומרת אקסונים היוצאים שורש הגחון שלה. לפרוקגירוי שורש RAL מפעיל פוטנציאל פעולת antidromic בחזרה somas על ברכת motoneuron יציאה מאותו שורש הגחון. זה גם מלהיב את המטרות בטחונות motoneuron, motoneurons האחר 6-10 ותאי Renshaw 11-13. מאז רק motoneurons לשלוח האקסונים שלהם למטה השורשים הגחון, אנו משתמשים הקלטה של פוטנציאל פעולה antidromic כדרך פשוטה סופי physiologicaly לזהות motoneurons 10. בנוסף לשימוש פוטנציאלי הלא כלול או מטעה קריטריונים אלקטרו וצורני כדי לוודא את זהותו motoneuron, מחקרים שנעשו לאחרונה על motoneurons חוט השדרה הסתמך גם על 16 מייגע זמן רב פוסט הוק stainings. זיהוי כאלה בדרך כלל מבוצע רק על מדגם של התאים המוקלטים. באסטרטגיות זיהוי אחרים מסתמכים על קווי עכבר שבה motoneurons להביע הקרינה אנדוגני <sup&gt; 17-19. עם זאת, באמצעות סמנים מקודדים גנטי עלול להיות קשה בגיל צעיר כאשר ביטוי סמן עדיין משתנה או אם המחקר כבר דורש באמצעות קו עכבר מהונדס. לחלופין, הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic יכולות להתבצע באופן שגרתי על כל העכברים מתחיל הקלטת תא. מבצעי ניסוי עובדים על הכנות חוט שדרה שלמות של החתול, חולדה ועכבר, משתמשים באופן מהימן טכניקות זיהוי כאלה מאז 1950 1,2,20,21. בתנאים אופטימליים, הצלחנו לעורר פוטנציאל פעולה antidromic מן כמעט כל motoneurons מוקלט. יתר על כן, גירוי שורש גחון יכול לשמש כדי להלהיב motoneurons האחר מהימן 22,23 או המטרות שלהם. 10,24,25 התאים Renshaw. אנו מציגים כאן יישומים של גירוי שורש הגחון בצורת הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic מ motoneuron somas, וכן עירור של תאי רנשו.

<table><tbody><tr><td>קינורנט</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>מתמוסס טוב יותר ממותגים אחרים</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<תת>3</תת>&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<תת>2</תת>&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>איכות ביולוגית</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>למחשב&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-גלוקונאט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041-GTP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>חומצה</td><td></td> <td>גלוקוניתG1951</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת צזיום הידרוקסיד</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים של Vannas - 2.5 מ"מ&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>משמש רק לחיתוך הדורה, עלול להינזק אם חיתוך עצמות</td></tr><tr><td>סטימולטור</td><td>מערכות A-M</td><td>ממריץ דופק מבודד דגם 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>רטט מיקרוטום 7000 - דגם 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

קלטות אלקטרו מתוך פרוסות חוט שדרה הוכיחו להיות טכניקת ערך לחקור מגוון רחב של שאלות, מן הסלולר מאפייני רשת. אנחנו מראים איך להכין פרוסות קיימא אלכסוניות של חוט השדרה של עכברים צעירים (P2 - P11). בהכנה זו, motoneurons לשמור האקסונים שלהם יוצאים מן שורשי הגחון של חוט השדרה. גירוי של אקסונים אלה מעורר גב הפצת פוטנציאל פעולה פולש somas motoneuron ומרגשים בטוחות motoneuron בתוך חוט השדרה. הקלטה של ​​פוטנציאל פעולה antidromic היא דרך מיידית, מוחלטת ואלגנטית לאפיין זהות motoneuron, אשר עולה שיטות זיהוי אחרות. יתר על כן, מגרה בטוחה motoneuron היא דרך פשוטה ואמינה כדי להלהיב את המטרות בטחונות של motoneurons בתוך חוט השדרה, כגון motoneurons אחר או Renshaw תאים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הקלטות antidromic מן motoneuron somas וכן עירור התא Renshaw, הנובע גירוי שורש הגחון.

אישור של זהות Motoneuron שימוש פוטנציאל פעולה Antidromic מיקוד נייד Motoneurons נמצאים צופר הגחון (גלוי באדום באיור 2C). התחל מהצרור של אקסונים להרכיב שורש הגחון וללכת עד הצרור מפזר באופן מלא ואחד מת...

אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון.

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין חתכים אלכסוניים של חוט השדרה המאפשרים גרייה של השורשים הבטניים (ventral roots). היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי של תאי עצב מוטוריים לצורך גרייה של השורשים הבטניים, ולימוד של התאים הבטניים המעצבבים על ידי ענפים צדדיים (collaterals) של אקסונים מוטוריים. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נדרשה דרך מהימנה לגריית תאים בטניים.אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקשו בביצועה בשל המורכבות של השלבים השונים של הניתוח. התחילו בביצוע פרפוזיה לעכבר בגיל P2 עד P11 באמצעות ACSF דל בנתרן. לאחר עריפת העכבר והסרת העור מהגב, בצעו שני חתכים דרך הכתפיים ומטה לאורך כלוב הצלעות.לאחר מכן, חתכו את חבל השדרה נמוך ככל האפשר בחלק הזנבי (caudal) כדי להפריד את עמוד השדרה והצלעות מהחלק התחתון של בעל החיים. הפכו את עמוד השדרה והסירו את האיברים הפנימיים שעדיין דבוקים לצלעות. העבירו את עמוד השדרה לצלחית פטרי קטנה יותר וממולאת בסיליקון.הוסיפו ACSF קר, האריגו בבובלס של carbogen והשתמשו בארבעה סיכות לחרקים כדי להחזיק את הרקמה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, בצעו למינקטומי (laminectomy) של הצד הגבי על ידי החדרת קצה של מספריים עדינים בין העצם לחוט השדרה וחיתוך העצם מהקצה הרוסטרלי, תוך הקפדה להתרחק מהחומר הלבן. בצעו את החיתוכים לסירוגין בכל צד, תוך שימוש בפינצטה להחזקת רצועת העצם שכבר נחתכה.בשלב הבא, השתמשו בפינצטה קטנה כדי להרים את הקשיח (dura) ובמספריים קטנים כדי לגזור לאורך גישת ה-rostral caudal משני הצדדים. הסרת הקשיח היא שלב קריטי. כדאי להקדיש מספר דקות נוספות כדי לבצע זאת ביסודיות.לאחר הסרת הקשיה (dura), השתמש בקצה זכוכית קהה כדי לדחוף בעדינות את חוט השדרה לעבר הצד השמאלי של החריץ שנוצר על ידי חיתוך חציו של עמוד השדרה. לאחר מכן, חתוך את השורשים הוונטרליים והדורסליים בצד המואר, רחוק ככל האפשר מהנקודה שבה הם נכנסים לחוט השדרה. חזור על הפעולה בצד שמאל, תוך התקדמות תמידית מכיוון רוסטרלי לכיוון קודאלי.לאחר הניתוח, החלק את חוט השדרה החוצה מעמוד השדרה. לאחר מכן, השתמש בסיכה קטנה לחרקים כדי לקבע את חוט השדרה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. הסר בעדינות כל פיסות של קרומי חיבור.לאחר הניקוי, יש לקצץ את שני קצות השרוך ולהחדיר סיכת חרקים כפופה לחלק הקדמי של השרוך כדי לסמן את הכיוון שלו. לאחר מכן, העבירו את חוט השדרה לתמיסה תו-תאית קרה במיוחד. בשלב הבא, קררו את האגר המומס שהוכן מראש על תערובת של קרח ומים.ערבבו את האגר תוך כדי מדידת הטמפרטורה. כאשר טמפרטורת האגר מגיעה ל-38 °C, החזיקו את השריר השדרני באמצעות סיכת החרקים וטבלו אותו בתוך האגר, כאשר הצד הרוסטרלי פונה כלפי מטה. ודאו שהשריר השדרני ישר ככל האפשר, רחוק מהדפנות, כאשר החלק הקודאלי פונה מעט כלפי מעלה.השאירו את הכלי בתוך תערובת של קרח ומים כדי לאפשר לאגר להתמצק מסביב לחוט השדרה במהירות המקסימלית. לאחר ההתמצקות, חתכו את גוש האגר המכיל את חוט השדרה באופן שבו בסיס הגוש יהיה בזווית של 35 מעלות ביחס לחלק המותני של חוט השדרה. הפני השגב (הצד הגבי) צריכים לפנות הרחק מהבסיס.הדביקו את הבלוק לתא של הוויברטום (vibratome), באמצעות דבק ציאנואקרילט. קריטי להרכיב את הבלוק בצורה נכונה כדי לשמור על הרצף של מאגרי המוטורונים (motor pools) עם השורשים הבטניים (ventral roots) מהם הם יוצאים. טבלו את הבלוק בתמיסת אשלגנים גלוקונט.הגדירו את פרמטרי הוייברטום (vibratome). לאחר מכן, גזרו פרוסות בעובי 350 400 מיקרון מאזור המותניים (lumbar region), שניתן לזהותו על פי הקימור והקוטר הגדול יותר שלו. העבירו את הפרוסות המתאימות ל-ACSF בטמפרטורה של 34 degrees Celsius.בדרך כלל, ישנם ארבעה עד חמישה פרוסות מתאימות עם שורשים ונטרליים המשתרעים לשני מילימטרים או יותר. לאחר כ-30 דקות בטמפרטורה של 34 °C, קררו את הפרוסות לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן התחילו את סשן ההקלטה. הכינו מראש קופסה עם פיפטים שונים בעלי קטרי קצה הנעים בין 40 ל-170 מיקרון.להכנת פיפטות החתך, בחרו פיפטות בעלות טפורה (tapure) ארוכה. לאחר מכן, בעזרת סכין יהלום, בצעו חתכים במיקומים שונים, ותחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), שברו כל פיפטה על ידי הקשה על הקצה באמצעות פינצטה. לאחר מכן, הוציאו את התא ממיקרוסקופ ההקלטה והניחו אותו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.בחר פרוסה המכילה שורש בטני (ventral root) באורך מספיק כדי שניתן יהיה להרכיבו על אלקטרודת גירוי באמצעות שאיבה. הרכב את הפרוסה, כאשר השורשים הבטניים פונים כלפי מעלה, ולאחר מכן חתוך בעדינות את האגר סביב השורשים הבטניים, תוך השארת שאר האגר סביב הפרוסה, והנח את הרשת כדי להחזיק את הדגימה במקומה. הרכב את התא בחזרה על המיקרוסקופ ובצע פרפוזיה רציפה של תא ההקלטה עם ACSF בקצב של one to two milliliters per minute בטמפרטורת החדר.באמצעות פיפטה מזכוכית מלאה ב-ACSF ומחוברת למזרק, שאבו את אחד השורשים הבטניים (ventral roots). כדי להשיג גירוי יעיל של השורש הבטני, על קצה הפיפטה להיות הדוק סביב השורש. בצעו הקלטת patch-clamp של סוג התא הרצוי והקליטו את השפעת הגירוי של השורש הבטני כפי שתואר קודם לכן.תמונה זו מציגה את התוצאות מהקלטת voltage-clamp. ההקלטות בלוחות העליונים נלקחו מנוירונים מוטורים שונים מאלו שבלוחות התחתונים. הלוח העליון מראה את התגובה האנטידרומית של נוירון מוטורי לגירוי של 1V באדום, ולגירוי של 5V בשחור.העקבה התחתונה מראה את תגובת פוטנציאל הפעולה האורתודרומי לגירוי של 20 volt באדום, ולגירוי של 30 volt בשחור. נקודות שחורות מציינות את תזמון הגירוי. ראשי החצים הכפולים מדגישים את ההבדל בשיהויים בין הספייקים האורתודרומיים לאנטידרומיים.כאן מוצגות הקלטות של סגירת זרם (current clamp). הפאנל העליון מציג את התגובה האנטידרומית לגירויים של 10 וולט ו-15 וולט באדום ובשחור, בהתאמה. הפאנל התחתון מציג את התגובה האורתודרומית לגירויים של 25 ו-40 וולט באדום ובשחור, בהתאמה.שוב, תזמון הגירוי וההבדלים בzמני השהייה מצוינים. תמונה זו של מאגר תאי Renshaw הושגה באמצעות קונדנסור אלכסוני ועדישה פי 20. שימו לב לאקסונים של הנוירונים המוטוריים המתמזגים לתוך השורש הוונטרלי, כפי שמוצג על ידי החץ.תמונה זו של אותו אזור צולמה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 40x. תאי Renshaw משוערים מסומנים בחצי חצים. מוצגת כאן הקלטת voltage-clamp של תא Renshaw בעקבות גרייה של השורש הגבי (ventral root), המסומן בנקודה שחורה.QX-314 בתמיסה התוך-תאית מנע מהתא לבצע פריקה, ותגובות הגליצין וה-gaba נחסמו על ידי 3 µM gabazine ו-1 µM strychnine, בהתאמה. העקומה האדומה היא ממוצע העקומות האפורות. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך 20 או 30 דקות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להחזיק את הדגימה במדיום קר בכל עת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת חתכים אלכסוניים של חוט השדרה המתאימים לגירוי של השורשים הבטניים (ventral-root stimulation). ניתן להשתמש בגירוי של השורשים הבטניים כדי לאשר בקלות את הזהות המוטורו-עצבית, וחשוב מכך, כדי לגרות באופן מהימן את התאים הבטניים.

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים הליכי הכנה הקלטה אלקטרו מן פרוסות המוח השומרים על הציר הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי entorhinal (MEC). בגלל קידוד עצבי של מיקום כדלקמן הארגון הגב, הגחון בתוך MEC, נהלים אלה להקל על החקירה של מנגנונים תאיים חשובים לניווט וזיכרון.

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

סרטון זה מתאר את ההקלטה התוך-תאית in vivo של מוטונוירונים של חולדות תחת גירוי זרם ישיר טרנס-שדרתי. הפרוטוקול מתאר כיצד למדוד את תכונות הממברנה ולתעד את הירי הקצבי של מוטונוירונים לפני, במהלך ואחרי קיטוב אנודלי או קתודיאלי של חוט השדרה.

גירוי זרם ישיר טרנס-שדרתי של מוטונורון עמוד השדרה של חולדה

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת מערך מיקרואלקטרודות לחקר פעילות הרשת העצבית באזורי חוט השדרה של עכבר. ראשית, נרשמת הפעילות האלקטרופיזיולוגית מהקרן הגבית השטחית (SDH) של הפרוסה. לאחר מכן, מעכב תעלת אשלגן מוצג כדי להאריך את הדפולריזציה, וכתוצאה מכך פעילות ריתמית סינכרונית על פני הרשת העצבית.

הערכה מבוססת מערך מיקרואלקטרודות של רשתות עצביות בפרוסות חוט השדרה של עכבר

הקלטת זרמי Ca2+ בקרום הפנים של השחרור הפרה-סינפטי היא המפתח להבנה מדויקת של כניסת Ca2+ ושחרור נוירוטרנסמיטרים. אנו מציגים דיסוציאציה חריפה של חוט השדרה הצמד המניב אקסונים רשתית מבודדים פונקציונליים, המאפשרים הקלטה ישירות מקרום הפנים המשוחרר של מסופים פרה-סינפטיים בודדים.

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

היעילות של ספיגה תוך שרירית והובלה לאחור של מולקולות לנוירונים מוטוריים מתאימים תלויה במיקום אתרי ההזרקה ביחס ללוחות הקצה המוטוריים (MEPs). כאן, אנו מתארים כיצד לאתר MEPs על שרירי השלד כדי לייעל את ההובלה לאחור של עוקבים לנוירונים מוטוריים.

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

פרוטוקול זה מתקשר ההכנה גזע המוח-עמוד השדרה של מבהיר את הכנת פרוסות רוחבי גזע המוח באופן מקיף שלב אחר שלב. זה נועד להגדיל את הפארמצבטית ולשפר את הסבירות של קבלת פרוסות קיימא, לאורך זמן, בקצב אחיד-פעיל עבור הקלטה פלט עצבית מהאזורים הנשימה של גזע המוח.

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

פרוטוקול זה מתאר בהקלטה תאית vivo של motoneurons מותני חולדה עם גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה בו זמנית. השיטה מאפשרת לנו למדוד תכונות קרום ולתעד ירי קצבי של motoneurons לפני, במהלך ואחרי קיטוב אנודל או קטודלי של חוט השדרה.

ב Vivo הקלטה תאית של מוטונורון עמוד השדרה חולדה מזוהה סוג במהלך גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה

שילוב של תשומות סינפטיות מגוונות לנוירונים נמדד בצורה הטובה ביותר בהכנה שמשמרת את כל הגרעין הטרום-סינפטי לתזמון טבעי ול פלסטיות מעגל, אבל פרוסות מוח בדרך כלל מנתקות חיבורים רבים. פיתחנו פרוסת מוח שונה כדי לחקות פעילות מעגל vivo תוך שמירה על יכולת ניסויים במבחנה.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

מתואר השימוש המשולב בטכנולוגיית מערך מיקרו-אלקטרודים ובגירוי כימי המושרה על-ידי 4-אמינו-פירידין לחקר פעילות נוציצפטיבית ברמת הרשת בקרן הגבית של חוט השדרה.

הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה

פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה (SCS) ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכולה לסייע לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ובשמירה על קיום התא בו זמנית.

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה

למדו הכנת פרוסות אלכסון של חוט השדרה מעכברים צעירים לגירוי שורשים גחוניים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מוטונורונים ומחקר תאים גחוניים המעוצבים על ידי שלוחות אקסונים מוטונורליים.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

גלה סרטונים נוספים