משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם, זבוב הפירות הים תיכוני

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר חומצות גרעין לעוברים של Ceratitis Capitata, מזיק חקלאי חשוב, כדי להרחיב בסופו של דבר את ארגז הכלים להדברתו. שיטה זו מסייעת בתיקון תפקודי של גנים באורגניזם חסר תנועה, כמו גם ביצירת זנים טרנסגניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שכמות נמוכה מאוד של חומצות גרעין מוזרקות כדי להשיג את ההשפעות הרצויות.

שמור על כל שלבי החיים של מושבת הזבוב הים-תיכוני ב-25 מעלות צלזיוס עם 65% לחות ו-12 שעות של אור/חושך עם פוטו-פאזה החל מ-8 בבוקר. הכנס פס ספוג דרך פתח קטן בבסיס הכלוב כדי לספק לזבובים מים באמצעות פעולה נימית. אתה מקים כלוב של שישה ליטר, מעמיס אחד עם בין 1,500 ל-2,000 גלמים.

למזון, העמיסו את הכלוב בכ-45 גרם של תערובת של 1 עד 10 של שמרים וסוכר. כדי לאסוף ביצים, הניחו צלחת מלאה במים מתחת לכלוב. הנקבות יפקידו ביצים דרך הרשת, אשר לאחר מכן יתאספו במים.

בגלל הנקבות הבתולות יכולות להניח ביציות, ודא שכל הביצים מופרות על ידי המתנה עד שהזבובים יהיו בני שבוע לפחות, לפני איסוף הביצים. כדי לאסוף ביצים, מסננים את המים בעזרת מסננת דקה. לאחר מכן בעזרת פיפטה פסטורלית, העבירו את הביצים לקופסת פלסטיק עמוסה בכ- 0.5 ליטר מזון זחלים סטנדרטי.

אם לא הוטלו מספיק ביצים, הגדל את תכולת השמרים במזון הבוגר עד 25%הניחו כל קופסה בכלי שקוף, המכיל שכבת סובין לטובת התגלמות. מכסים את המיכל במכסה רשת כדי לאפשר זרימת אוויר. לאחר כ-10 ימים, בדוק אם יש זחלי כוכב שלישי שקפצו מטה לשכבת הסובין להתגלמות.

לאחר שנמצאו, התכוננו לבדוק אם יש גלמים בימים הבאים. כדי לאסוף את הגולם, השתמשו במברשת רכה כדי לטאטא אותם מהמיכל. בתחילה, אספו את הגלמים בכוס קטנה.

לאחר השלמת האיסוף, העבירו את הגלמים לכלוב בוגרים חדש. הבוגרים אמורים להופיע בעוד כ-10 ימים. עבור המיקרו-הזרקה, הכינו שקופיות מראש.

חבר רצועה של שני סנטימטרים של סרט מצופה כפול לשקופית וסמן את הקצוות בטוש חרסינה כדי ליצור קיר לשכבת שמן השומרת על לחות העוברים. כדי לאסוף עוברים שזה עתה הוטלו, אפשר לנקבות מופרות צעירות להציב ביציות במשך 30 דקות על מגש חדש ולאחר מכן לאסוף את העוברים. כדי להסיר את הכוריון מהעוברים, טבלו את המסננת והביצים בתמיסת אקונומיקה מסחרית של 50% למשך חמש שניות.

זה קריטי לא להלבין יתר על המידה את העוברים. שטפו מיד את העוברים המולבנים על ידי טבילה בזהירות של המסננת במים נקיים וטהורים במיוחד. עשה זאת לפחות ארבע פעמים.

לאחר מכן, שמור את המסננת במים צלולים במיוחד טהורים והזריק את העוברים תוך שעתיים. לאחר מכן, בעזרת מכחול עדין, אספו כ -50 עוברים והניחו אותם על דיסק נייר פילטר שחור ספוג במים. תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, חתרו את העוברים על סרט הציפוי הכפול של שקופית מיקרוסקופ מוכנה.

כוון את כל העוברים לאותו כיוון. חשוב לתפעל את העוברים בזהירות מכיוון שניקוב קרום העובר עם מברשת הצבע עלול לגרום לנזק המפחית את הישרדות העובר. כעת מכסים את העוברים בשכבה של שמן כלורו-טריפלורו אתולן.

הנפט צריך להיות מוכל על ידי גבולות סימון סין. אל תציף את הגבולות. בעזרת מיקרופיפטה, טען את מחט ההזרקה בכמה מיקרוליטרים של תמיסת חומצת גרעין במיקרוגרם אחד עד שניים למיקרוליטר.

לאחר מכן, חבר את המחט למנגנון המיקרו-הזרקה והגדר אותה לספק הזרקה של חצי שנייה ב-800 הקטו-פסקל עם לחץ אחורי של 150 הקטו-פסקל. כדי להזריק, השתמש בהדק דוושת רגל והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי לשלוט במחט תוך שימוש בפקדי הבמה כדי להזיז את המגלשה. ודא כי בולוס ההזרקה נפלט כראוי ולאחר מכן יישר את המחט עם הקוטב האחורי של העובר הראשון בשורה.

על ידי הזזת השלב, הכנס את המחט לעובר והזריק את בולוס חומצות הגרעין. הנוזל המוזרק יגרום לעלייה בלחץ הפנימי וכתוצאה מכך לתנועה קלה של העובר. שחרר את הדוושה, ומיד אך בעדינות, הסר את המחט מהעובר.

מעט ציטופלזמה תדלוף באתר ההזרקה. זה נורמלי. אם העוברים מתפוצצים מהזריקה, הניחו לעוברים להתייבש מספר דקות לפני שכיסו אותם בשמן.

לאחר ההזרקה, העבירו את השקופית לצלחת פטרי. הניחו דיסק נייר פילטר במכסה הכלי. משרים את המסנן במים וסוגרים את צלחת הפטרי בניילון פרפין.

דגרו את החדר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. יומיים לאחר ההזרקה, בדוק את השקופיות מספר פעמים במהלך היום לאיתור זחלים שבקעו. חפשו זחלים בשמן ובעזרת מכחול עדין העבירו אותם לצלחת פטרי עם מזון זחלים על בסיס גזר.

טען כל מנה עד 200 זחלים. הזחל אינו יכול לשרוד בשמן זמן רב, לכן חפש לעתים קרובות. דגרו על הזחלים כשהמכסה סגור ברובו, כך שעדיין יש זרימת אוויר לזחלים.

בדקו את הכלים מדי יום ולאחר שבוע התכוננו לאסוף זחלים על ידי הנחת הכלים בכלי עם סובין. אספו את הגלמים וזמן קצר לאחר מכן צפו שהם יצאו. מאוחר יותר מרדימים בוגרים שבקעו באמצעות פחמן דו חמצני ובודקים אותם לטרנספורמציה.

בעת סינון, שיטת הגיוס הזו יכולה להיות קריטית. ניתן להרדים בוגרים באמצעות קרח או CO2, אך חשיפה ממושכת עלולה להפחית את ההישרדות של אחרים. בדוק אם יש פלואורסצנטיות אדומה באמצעות מסנן רחב אדום DS.

או בדוק אם יש פלואורסצנטיות ירוקה באמצעות מסנן EYFP. העבירו את הפרטים שעברו טרנספורמציה לכלוב קטן עם בוגרים פראיים מהמין השני כדי ליצור זן הטרוזיגוט. בניסוי אחד, נעשה שימוש ב-RNA כפול כדי להשתיק את ביטוי הגן inx5.

קו הנבט הבוגר של בקרות שלא הוזרקו נראה תקין כצפוי, בעוד שאנשים שטופלו הראו אשכים ושחלות לא מפותחים. כימות שפע תעתיק inx5 בבטן של אנשים משני המינים אישר את הביטוי הנמוך משמעותית של הגן בהשוואה לביקורת. בניסוי שני, שני זנים עם זרע מסומן נוצרו באמצעות מקדם בטא-2 טובולין כדי להניע סמנים פלואורסצנטיים שונים.

זכרים טרנסגניים הראו דפוס פלואורסצנטי מובהק בגוף ובאשכים. בעזרת סרטון זה, אנו מספקים את הפרוטוקולים המותאמים שלנו לגידול והזרקה מיקרו של חומצות גרעין לעוברי זבוב ים. לאחר השליטה, ניתן להזריק עד 1,000 עוברים במהלך יום עבודה של שמונה שעות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מתכות אחרות כמו thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine כדי לפתח דור חדש של זני medfly.