Name: משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם, זבוב הפירות הים תיכוני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למדו שיטת מיקרו-הזרקה להעברת חומצות גרעין לעוברי זבוב הפירות הים תיכוני (Ceratitis capitata). שיטה זו מאפשרת יצירת זנים טרנסגניים ופיתוח אסטרטגיות בקרה חקלאיות מתקדמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לכל חברי המעבדה "גנטיקה וגנומיקה של חרקים", במיוחד ללורנצו גירינגלי שעבד על פיתוח, התאמה ותחזוקה של גידול הזבוב בשלושים השנים האחרונות. חלק מהתוצאות המייצגות של מאמר זה הודפסו מחדש מ- N. Biotechnology, 25(1) על ידי Scolari F. et al., סימון זרע פלואורסצנטי לשיפור המאבק נגד החרק המזיק Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, באישור Elsevier (מספר רישיון 3796240759880). עבודה זו קיבלה תמיכה מ-Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. ניסיוני Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרישות insectary <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על כל ג חי capitata טיולים של 25 מעלות צלזיוס, לחות 65% ו 12/12 שעות אור / photoperiod הכהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על 1,500-2,000 גלמים medfly בכלוב L 6. השתמש כלוב עם פליז רשת בצד אחד עם חורים קטנים מספיק כדי לעורר הטלה 42. הכנס רצועה ספוגה דרך פתח קטן בבסיס של הכלוב כדי לספק זבובים עם מים באמצעות כוח הנימיות. השתמש תערובת של שמרים וסוכר (1:10) כמקור מזון עבור המבוגרים (איור 1 א). להגדיל את כמות שמרים (עד 1: 3, שמרים: סוכר) צריכות הנקבות מצליחות להטיל ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת מלאה במים מתחת לכלוב לאסוף את הביצים שהופקדו מבעד לרשת. כמו נקבות בתולה יכולות oviposit, לחכות עד הזבובים לפחות בן 6-7 ימים לפני איסוף ביצים עבור ניסויי microinjection. פעולה זו תבטיח כי הנקבות הזדווגווכי הביצים תהיינה כבר מופרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הביצים על ידי סינון המים עם מסננת נטו בסדר. מעבירים את הביצים מן מסננת בקופסת פלסטיק המכיל מזון הזחל סטנדרטי (1.5 LH 2 O, 100 מ&quot;ל HCl 1%, 5 גרם סוכן מומס מיקרוביאלית-קשת רחבה ב 50 מ&quot;ל אתנול, 400 גרם סוכר, 175 גרם שמרי בירה demineralized, 1 קילו סובין חיטה רך) בעזרת פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל תיבת במיכל שקוף סגור עם מכסה נטו לאפשר זרימת אוויר המכיל שכבת סובין להעדיף התגלמות (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ -10 ימים, לבדוק 3 rd instar זחלים העולות ממזון הזחל ולקפוץ למטה לתוך שכבת הסובין עבור התגלמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות מאוחר יותר, לאסוף את הגלמים בכוס קטנה בעזרת מברשת רכה ולהעבירם לכלוב בוגרים חדש. מבוגרים בדרך כלל מופיעים 10 ימים לאחר ההתגלמות. הזבוב מתעורר משתמש ptilinum, כיס מתנפח ממוקם על הראש מעל הבסיס הדואר של האנטנות, לכפות את סוף puparium. לאחר הופעתה, את ptilinum לצמיתות צונח לאחור בתוך הראש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 1 L מזון לזחלי microinjected <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אגר 2.5 גרם ב 300 מ&quot;ל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ&quot;ל חם 500 H 2 O על פלטה חשמלית ערבוב להמיס 4 גרם נתרן בנזואט, 4.5 מ&quot;ל 37% HCl, תמצית שמרים 42 גרם ו -115 גרם אבקת גזר מיובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לתערובת פתרון של 2.86 גרם סוכן מיקרוביאלית הספקטרום הרחב מומס ב 10 מ&quot;ל אתנול אבסולוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ את בינוניים 15 ס&quot;מ עגולים צלחות פטרי להתקרר. במידת הצורך, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רצועת 2 סנטימטר של סרט דו צדדי על שקופיות מיקרוסקופ (75 x 26 מ&quot;מ 2) ולסמן את הקצוות עם סמן בסין, כדי למנוע את התפשטות נפט ההתייבשות הסוגרת של העוברים המוזרקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><stרונג&gt; הכנה חומצות גרעין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד פלסמיד דנ&quot;א באמצעות 34 ערכות זמינות מסחרי. לזרז את הפלסמיד באמצעות אתנול מחדש להשעות במאגר הזרקה (חיץ פוספט 0.1 מ&quot;מ pH 7.4, 5 KCl מ&quot;מ) בריכוז הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר במבחנה synthetized ארוך dsRNA באמצעות כלורופורם פנול, לזרז באמצעות isopropanol מחדש להשעות במאגר הזרקת 43. </li></ol></li></ol> 2. עובר כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגש מלא במים תחת כלוב ובו מבוגרים ישנים 6-7 יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הנקבות כדי oviposit למשך 30 דקות ולאחר מכן לאסוף את העוברים על ידי סינון המים באמצעות מסננת דקה. שמור תמיד את המסננת במים כדי למנוע התייבשות של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate את העוברים על ידי immerging מסננת למשך 5 שניות בתמיסת אקונומיקה מסחרית 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העוברים בקפידה על ידי immerging מסננת שוב ושוב במי ultrapure נקיים (לפחות4-5 פעמים). לבסוף, הניח את המסננת במי ultrapure נקיים. השתמש עובר בתוך 2 שעות מקסימום. הערה: התזמון של microinjection קשור בצורך להזריק לעוברי טרום blastoderm, במהלך שלב של חטיבות גרעיניות לפני cellularization. זה מאפשר ה- DNA מוזרק להילקח למעלה לתוך גרעינים, במיוחד לתוך גרעין התא נבט הקדמוני אשר מקורן הגמטות. ב תסיסנית, cellularization על תאי המוט מתחיל בערך 90 דקות לאחר ההפריה (25 מעלות צלזיוס), עם היווצרות blastoderm המתרחשת כ -30 דקות מאוחר יותר 44, ואילו cellularization medfly מתרחש בין 9 ל 12 שעות 45,46. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוריינטציה העובר בשורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכחול בסדר, לאסוף כ -50 עוברים ומניחים אותם על דיסק של נייר פילטר שחור ספוגה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו לנתח, לארגן את העוברים ברציפות על פני השטח העליונים של הסרט דו צדדי עלשקופיות מיקרוסקופ באמצעות מכחול בסדר (000) (תרשים 1C). הערה: ישר את העוברים כולם באותו הכיוון, כמו ההזרקה מתבצעת בקוטב האחורי, שם ניבט אונליין ייוצר; בקוטב האחורי הוא הפוך באזור micropyle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את העוברים עם שכבה של שמן chlorotrifluoroethylene ולוודא כי השמן לא יגלוש סין גבולות סמן (ראה 1.3). הערה: לפני המכסים את העוברים עם שמן, צעד נוסף יכול להתבצע: העוברים ניתן מיובשים במשך כמה דקות כדי להפחית את תכולת הנוזל ובכך להקל על כניסתם של הפתרון ה- DNA המוזרק. זה עשוי לעזור למנוע התפוצצות עוברת במהלך הזרקה או דליפה מוגזמת של הפתרון המוזרק, כפועל יוצא של הלחץ הנזיל הגבוה. </li></ol></li></ol> העובר 3. Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מחט (1-2 μl) עם DNA פלסמיד או פתרון dsRNA (1-2 מיקרוגרם / μl) באמצעות micropipette. </li><li&gt; חבר את המחט למנגנון microinjection, השולטת זמן הזרקה (0.5 שניות), הלחץ (800 hPa) ואת backpressure (150 hPa). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microinjection תחת סטראו, באמצעות micromanipulator לשלוט בתנועות של המחט (איור 1D). השתמש הבמה מיקרוסקופ כדי להעביר את השקף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על הבמה של היקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה המחט לתוך בקוטב האחורי של העובר (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון על ידי הפעלת מערכת microinjection עם הדוושה. הנוזל המוזרק גורם לעלייה בלחץ פנימי, וכתוצאה מכך תנועה קלה של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את הדוושה ומייד, אבל בעדינות, להוציא את המחט מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים דליפה cytoplasmic קטנה במקום ההזרקה. הערה: כדי להפלות בין השפעות קטלניות הפוטנציאל של DNA / dsRNA / siRNA ותמותה בשל פרו microinjectioncedure עצמו, ניסויי שליטה חייבות להתבצע. אלה מהווים את הזריקה של חיץ בלבד, או, במקרה של ניסויים גנטיקה הפוכה, של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -derived RNA פעמיים תקועים (dsRNA-GFP), או siRNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה בעקבות הדגירה עוברת על 25 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הליכים שלאחר הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר ההזרקה, לבדוק את השקופיות עבור הזחלים בקעו (איור 1F) תחת סטראו. הזחלים יכולים לנוע שמן אבל צריך להיות מועבר המזון הזחל בהקדם האפשרי. מסיבה זו, לבדוק את השקופיות כמה פעמים ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכחול בסדר (000), להעביר את הזחלים בקעו בעדינות לאוכל זחל מבוסס הגזר. העבר עד למקסימום של 200 זחלים לכל צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הזחלים בלחות 65% (25 מעלות צלזיוס). ודא כי המכסה אינו מקל על הצלחת, וכתוצאה מכך נפגע חילופי אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צלחות פטרי עם מכסהבעיקר סגור כך שעדיין יש זרימת אוויר אל הזחלים. כדי למנוע ייבוש יתר, תבדוק את הכלים יומי, במידת הצורך, מוסיפים מים כדי לפצות על התאדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צלחות פטרי במכל ברור העצום בקרום-נטו המכיל שכבת הסובין להעדיף התגלמות. באשר לגידול insectary שגרתית, 3 rd instar הזחלים לקפוץ החוצה של מזון הזחל pupate ב סובין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף הגלמים ומניחים אותם בכלוב קטן עבור גידול מבוגר ומיון (זה הדור 0, G0). אחורי הצאצאים על מזון זחל סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של ניסויי טרנספורמציה ניבט אונליין, לבדוק ליחידים טרנספורמציה אפשריים בדור הבא (G1), כיחידים מוזרקים בדרך כלל הן מפלצות. אירועי טרנספוזיציה, אכן, אולי התרחשו בכל הגרעינים של syncytium העוברי, אשר יהוו גם את שורת הניבט או סומה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לאחר הופעתה, להרדים אנשים G1 באמצעות CO 2 ולבדוק transfאירועי ormation תחת סטראו epifluorescence. למסך עבור נוכחות של הקרינה אדום, להשתמש במסנן DsRedwide (שלוחה 546/12;.. Emm 605/75), זמן מסך פלואורסצנטי ירוק להשתמש במסנן EYFP (שלוחה 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אנשים שינו בכלוב קטן עם מבוגרים wild-type של המין השני מקורן זן חדש, בתחילה הטרוזיגוטיים,. </li></ol></li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Microinjection של חומצות גרעין בעוברי חרקים הוא טכניקה אוניברסלית המאפשרת הוא הניתוח של תפקוד גן ויישומים ביוטכנולוגיים. הפרסום האחרון של רצפי גנום ממספר גדל והולך של מיני חרקים מוביל צורך דחוף כלים לאפיון הפונקציונלי של גנים של פונקציה עדיין לא ידועה. RNA ההתערבות הוכיחה להיות באחת מהשיטות היקרות ביותר להסיק פונקציות מולקולריות 49 ו microinjection עובר הופך לפשוט מחקרים אלה. <p class="jove_content...

זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata הוא מין קוסמופוליטי כי פירות נזקים בהרחבה וגידולים מעובדים. זה שייך למשפחת Tephritidae, הכוללת מינים מזיקים שונים, כגון השייכים לסוגים Bactrocera ו Anastrepha. Medfly הוא המין הנחקר ביותר של המשפחה הזו, והיא הפכה להיות דוגמא ומופת לא רק לחקר פלישות חרקי 1, אלא גם עבור אופטימיזציה של אסטרטגיות במזיקי 2. Medfly הוא מין multivoltine שיכול לתקוף יותר מ -300 מינים של בר צמחי תרבות 3,4. הנזק נגרם על ידי שני מבוגרים בשלבים הזחל: הנקבות הזדווגו לחדור את פני השטח של הפרי עבור ההטלה, המאפשר מיקרואורגניזמים כדי להשפיע על איכות המסחרי שלהם, ואילו את ההזנה הזחלים על עיסת הפירות. לאחר שלושה שלבי זחל, זחלים יוצאים מן המארח pupate לתוך האדמה. Ceratitiscapitata מציג חלוקה כמעט כלל עולמי, כולל אפריקה, המזרח התיכון, מערב אוסטרליה, מרכז ודרום אמריקה, אירופה, ותחומי בארצות הברית 5. האסטרטגיות הנפוצות ביותר להגביל מכת medfly כרוכה בשימוש חומר הדברה (למשל, malathion, Spinosad) ואת טכניקת סטרילית החרקים הידידותית לסביבה (SIT) 6. הגישה האחרונה כרוכה שחרור לטבע של מאות אלפי גברים שניתנו סטרילי על ידי חשיפה קרינה מייננת. ההזדווגות של זכרים מעוקרים כגון לנקבות בטבע התוצאה לא צאצאים, גרימת ירידה בגודל אוכלוסייה, המובילה בסופו של דבר לחיסול. למרות SIT הוכיח יעילות קמפיינים רבים מרחבי העולם, החסרונות העיקריים שלה כוללים את העלויות הגבוהות של גידול וטיהור מיליוני חרקים להשתחרר. סימון של אנשים שוחררו יש להבחין סטרילי מפני חרקים בטבע שנתפסו בשטח במהלךניטור פעילויות וזה מושג כיום באמצעות אבקות ניאון. נהלים אלה הם יקרים ויש לי 7 תופעות לוואי בלתי רצוי. על מנת לייעל ו / או לפתח גישות יעילות יותר של השליטה על המזיק הזה, ביולוגיה והגנטיקה medfly נחקרו באופן נרחב על ידי חוקרים רבים ברחבי העולם. הזמינות של רצף הגנום medfly 8,9, תקל חקירות רומן על פונקציות גן. התערבות RNA הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים כאלה וזה יכול להיות מושגת באמצעות microinjection של dsRNA (RNA פעמיים תקועים) או siRNA (RNA התערבות קטנה). טכניקה זו נעשתה שימוש, למשל, על מנת להוכיח כי המפל המולקולרי קביעת הזוויג ב C. capitata נשמרת באופן חלקי בלבד ביחס לזה של תסיסנית 10. הפיתוח של פרוטוקולי microinject עובר medfly מותר ג capitata להיות בלתי הראשוןמיני זבוב -Drosophilid להיות מהונדסים גנטי. כפי ביציו דומות לאלו של תסיסנית, הן מבחינת מורפולוגיה ועמידות בפני התייבשות 11, פרוטוקול להעביר דנ&quot;א פלסמיד לעוברי טרום blastoderm הראשון שפותח עבור ד melanogaster 12,13 בתחילה הותאם לשימוש ב C. capitata. הניסויים הראשונים אפשרו טרנספורמציה נבט אונליין medfly מבוסס על טרנספוזון מינוס 11. בהמשך לכך, המערכת המקורית שונתה 14 תוך שימוש בגישות transposon מבוסס אחרים. זהו המקרה של piggyBac מן פרפראים Trichoplusia ni 15. הפרוטוקול מאז מותאם יותר וזה התיר טרנספורמציה של מיני tephritid אחרים 16-21 וגם של רבים אחרים Diptera 22-31. כל המערכות הללו מסתמכות על השימוש של מערכת טרנספורמציה פלסמיד וקטור / עוזר בינארי אופיינית: מלאכותי, transpo הפגוםבנים שיישאו את הגנים הרצויים הם התאספו לתוך ה- DNA פלסמיד והשתלבו הגנום של החרק על ידי אספקת האנזים transposase 32. מספר קווי medfly המהונדסים נוצר, עם תכונות רבות, כוללים זני נושאת גן קטלני דומיננטי מותנה שגרם קטלני, זנים בייצור צאצאים לגברים בלבד ובכך לא מחייב אסטרטגיות זיהוי מין באמצעים נוספות, זנים עם זרע פלורסנט, אשר עשוי לשפר את הדיוק שלב ניטור SIT 33-37. למרות שחרורו בטבע של האורגניזם מהונדס שחל בדיקות טייס נגד יתושים רק 38,39, לפחות חברה אחת בוחנת מספר זני medfly המהונדסים לשימושם בתחום 40. microinjection העובר יכול גם לטובת פיתוח כלים הגנום עריכה חדשים, כגון nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs), חזרות palindromic קצר interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / CRISPR הקשורים nuclease חלבון 9 (Cas9) וגנים endonucleases ביות (HEGs), אשר יאפשר מחקרים האבולוציוניים וההתפתחותיים הרומן, כמו גם הרחבת ארגז הכלים ביוטכנולוגיים זמין. גישות הגנום עריכה כבר מותרות דור מערכות כונן גני יתושים 41, והעבירו אל medfly הוא קרוב. כאן אנו מתארים פרוטוקול אוניברסלי עבור microinjecting חומצות גרעין בעוברים medfly שיכול להיות שימושי עבור כל היישומים הנ&quot;ל.

<table><tbody><tr><td>1 x מאגר</td><td></td><td></td><td>הזרקה 0.1 מ"מ מאגר פוספט pH 7.4, 5&nbsp; mM KCl</td></tr><tr><td>Construct פלסמיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עוזר פלסמיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>פנול-כלורופורם מטוהר</td></tr><tr>מזון <td></td><td></td><td>זחלים סטנדרטי</td><td>1.5 ליטר H2O, 100 מ"ל HCl 1%, 5 גרם חומר אנטי מיקרוביאלי רחב ספקטרום המשמש במוצרים פרמצבטיים מומסים ב 50&nbsp; מ"ל אתנול, 400 גרם סוכר, 175 גרם שמרי בירה דה-מינרליים, 1 ק"ג סובין חיטה רכה</td></tr><tr>מזון <td></td><td></td><td>זחלי גזר</td><td>2.5 גרם אגר, 4 גרם סודיום בנזואט, 4.5 מ"ל 37% HCl, 42 גרם תמצית שמרים, 115 גרם אבקת גזר, 2.86&nbsp; g חומר אנטי מיקרוביאלי רחב ספקטרום, מים עד 1 ליטר</td></tr><tr>תמצית שמרים מזון<td>למבוגרים</td><td></td><td></td><td>וסוכר (1:10)</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>מחטי הזרקה&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>סרט</td><td></td><td></td><td></td>כפול שקופית</tr><tr><td>Whatman נייר עיגול שחור</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 לפני השימוש</td></tr><tr><td>מברשת צבע (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>כלובים</td><td></td><td></td><td></td>למבוגרים</tr><tr><td>שמן כלורוטריפלואורואתילן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Ceratitis capitata</td><td></td><td></td><td>הזן המשמש הוא ISPRA</td></tr></tbody></table>

משלוח חומצות גרעין דרך microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) הוא מין הדברה עם הרלוונטיות חקלאיות גבוהות מאוד. זאת בשל התנהגות הרבייה שלה: נקבות לפגום במשטח החיצוני של פרות וירקות כאשר הם מטילים ביצים ואת הזנת הזחלים בקעו על העיסה שלהם. Wild ג אוכלוסיות capitata נשלטות באופן מסורתי באמצעות דברת ריסוס ו / או גישות ידידותיות לסביבה, המצליחות ביותר להיות טכניקת חרקי סטרילי (SIT). לשבת מסתמך על-גידול המוני, עיקור מבוסס קרינה בתחום שחרור הזכרים שומרים ליכולתם להזדווג, אבל הם לא מסוגלים להפיק צאצאים פוריים. ההופעה ואת ההתפתחות המהירה הבאה של כלים ביוטכנולוגיים, יחד עם הזמינות של רצף הגנום medfly, שהגביר מאוד את הבנתנו את הביולוגיה של מין זה. זה העדיף ההתפשטות של אסטרטגיות חדשות עבור מניפולציה הגנום, אשר can להיות מיושם על שליטה באוכלוסייה. בהקשר זה, microinjection העובר ממלא תפקיד כפול בהרחבת ארגז הכלים לבקרת medfly. היכולת להפריע לתפקוד של גנים המווסתים תהליכים ביולוגיים מפתח, אכן, מרחיב את הבנתנו את המנגנון המולקולרי שבבסיס הפולשנות medfly. יתר על כן, היכולת להשיג שינוי הניבט אונליין הופכת לפשוט את הייצור של זנים מהונדסים רבים שיכולים להיבדק עבור יישומים בתחום בעתיד במסגרות SIT רומן. אכן, ניתן להשתמש מניפולציה גנטית להעניק תכונות רצויות שיכולות, למשל, לשמש כדי לפקח על הביצועים זכר סטרילי בתחום, או שיכול לגרום הקטלניות החיים בשלב מוקדם. כאן אנו מתארים שיטה microinject חומצות גרעין לעוברי medfly להשיג שתי מטרות עיקריות אלה.

כאן אנו מדווחים שני יישומים של microinjection עובר מכוון האפיון הפונקציונלי של גן של עניין (מקרה 1), ועל הדור של זנים מהונדסים (מקרה 2), בהתאמה. משלוח dsRNA לעוברי לפענח תפקוד הגן. הגן innexin-5 מקודד צומת-הפער, חרקים, מתבטא במיוחד אצל הזכ...

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להחדיר חומצות גרעיניות לעוברים של Ceratitis capitata, מזיק חקלאי משמעותי, כדי להרחיב בסופו של דבר את ארגז הכלים לשליטה בו. שיטה זו מסייעת באפיון תפקודי של גנים באורגניזם שאינו נייד, כמו גם ביצירת זנים טרנסגניים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שכמות נמוכה מאוד של חומצות גרעיניות מוזרקת כדי להשיג את ההשפעות הרצויות.יש לשמור את כל שלבי החיים של מושבת זבוב הפירות מהריבס בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, בלחות של 65% ובמחזור תאורה של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, כאשר שלב האור מתחיל בשעה 8 בבקר. הכניסו רצועת ספוג דרך פתח קטן בבסיס הכלוב כדי לספק לזבובים מים באמצעות פעולת נימיות. הכינו כלוב בנפח של ששה ליטרים, והעמיסו בו בין 1,500 ל-2,000 pupae.עבור המזון, טענו את הכלוב עם כ-45 גרם של תערובת של שמרים וסוכר ביחס של 1 ל-10. כדי לאסוף ביצים, הניחו צלחת מלאה במים מתחת לכלוב. הנקבות יטילו את הביצים דרך הרשת, ואז אלו ייאספו בתוך המים.מכיוון שנקבות בתולות עלולות להטיל ביצים שאינן מופרות, יש לוודא כי כל הביצים מופרות על ידי המתנה עד שהזבובים יהיו בני שבוע לפחות לפני איסוף הביצים. כדי לאסוף את הביצים, סננו את המים באמצעות מסננת דקה. לאחר מכן, בעזרת פיפטת פסטור, העבירו את הביצים לקופסת פלסטיק המכילה כ-0.5 liters של מזון זחלים סטנדרטי.אם לא הונחו מספיק ביצים, יש להעלות את תכולת השמרים במזון של הבוגרים עד ל-25%. מקמו כל קופסה בתוך מיכל שקוף, המכיל שכבת סובין כדי לעודד בובנאות. כסו את המיכל במכסה רשת כדי לאפשר זרימת אוויר. לאחר כ-10 ימים, בדקו אם קיימות לרוב בדרגה השלישית שקפצו למטה אל שכבת הסובין לצורך בובנאות.לאחר מציאתם, התכוננו לבדוק את נוכחות הגלגולים בימים הבאים. כדי לאסוף את הגלגול, השתמשו במברשת רכה כדי לסחוף אותם מהמיכל. בתחילה, אספו את הגלגולים לכוס קטנה.לאחר השלמת האיסופים, העבירו את הגלגולים האחרונים (pupae) לכלוב בוגרים חדש. הבוגרים אמורים לבקוע תוך כ-10 ימים. עבור המיקרו-הזרקה, הכינו את השקופיות מראש.הדביקו פס של שני סנטימטרים של סרט דביק דו-צדדי למשקוף וסמנו את הקצוות בעזרת טוש סימון (china marker) כדי ליצור דופן לשכבת השמן השומרת על העוברים הידרטציה. לאיסוף עוברים שהונחו זה עתה, אפשרו לנקבות מופריית צעירות להטיל ביצים במשך 30 דקות במגש חדש ולאחר מכן אספו את העוברים. כדי להסיר את הכוריון מהעוברים, טבלו את המסננת ואת הביצים בתמיסת אקונומיקה מסחרית בריכוז 50% למשך חמש שניות.קריטי להימנע מהלבנה מרובה מדי של העוברים. שטפו מיד את העוברים המולבנים על ידי טבילה זהירה של המסננת במים אולטרה-טהורים נקיים. בצעו זאת לפחות ארבע פעמים.לאחר מכן, השאירו את המסננת במים אולטרה-טהורים צלולים והזריקו את העוברים תוך שעתיים. לאחר מכן, בעזרת מכחול עדין, אספו כ-50 עוברים והניחו אותם על דיסקית של נייר סינון שחור הספוג במים. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי למשחקים, סדרו את העוברים על סרט דביק דו-צדדי על גבי זכוכית מיקרוסקופ שהוכנה מראש.כוון את כל העוברים לאותו כיוון. חשוב לטפל בעוברים בזהירות, כיוון שנקב בממברנת העובר באמצעות מכחול הצבע עלול לגרום לנזק שיפחית את סיכויי ההישרדות של העובר. כעת כסה את העוברים בשכבה של שמן chloro-trifloro etholene.השמן צריך להיות מוגבל על ידי גבולות סימון הטוש הסיני. יש להימנע מחריגה מהגבולות. בעזרת מיקרופיפטה, טען את מחט ההזרקה עם מספר מיקרוליטרים של תמיסת חומצות גרעין בריכוז של 1-2 µg ל-µL.לאחר מכן, חברו את המחט למכשיר המיקרו-הזרקה והגדירו אותו לביצוע הזרקה של חצי שנייה בלחץ של 800 hecto-pascals עם לחץ נגדי של 150 hecto-pascals. לצורך ההזרקה, השתמשו בדוושת הפעלה ובמיקרו-מניפולטור לשליטה במחט, תוך שימוש בבקרת הבמה להזזת העגלה. ודאו כי בולוס ההזרקה נפלט כראוי, ולאחר מכן יישרו את המחט עם הקוטב האחורי של העובר הראשון בשורה.הזז את השולחן כדי להחדיר את המחט לעובר והזרק את מנת חומצות הגרעין. הנוזל המוזרק יגרום לעלייה בלחץ הפנימי, מה שיוביל לתנועה קלה של העובר. שחרר את הדוושה, והוצא מיד אך בעדינות את המחט מהעובר.מעט ציטופלזמה תדלוף באתר ההזרקה. הדבר הוא תקין. אם העוברים מתפוצצים בעקבות ההזרקה, יש להמתין מספר דקות לייבוש העוברים לפני כיסוים בשמן.לאחר ההזרקה, העבירו את הזריגה לצלוחית פטרי. הניחו דיסקית של נייר סינון במכסה של הצלוחית. הרטיחו את המסנן במים וסגרו את צלוחית הפטרי באמצעות סרט פאראפין.דגרו את התא בטמפרטורה של 25 °C. יומיים לאחר ההזרקה, בדקו את הלשוניות מספר פעמים במהלך היום כדי לאתר לרוות שבקעו. חפשו לרוות בשמן, ובעזרת מכחול עדין, העבירו אותן לצלוחית פטרי עם מזון לרוות המבוסס על גזר.העמיסו בכל צלחת עד 200 זחלים. הזחלים אינם יכולים לשרוד זמן רב בשמן, לכן חפשו אותם לעיתים קרובות. דגרו את הזחלים כאשר המכסה סגור ברובו, כדי שיישמר זרימת אוויר אל הזחלים.יש לבדוק את הצלחות הגדלה מדי יום, ולאחר שבוע להכין את הזחלים לאיסוף על ידי הנחת הצלחות בתוך מיכל עם סובין. אספו את הגלגולים, ובשלב הבא צפו להבחתם. לאחר מכן, הרדימו את הבוגרים שובחו באמצעות פחמן דו-חמצני ובחנו אותם לאיתור טרנספורמציה.בעת מיון, שיטת הנייד של הדגימות עשויה להיות קריטית. ניתן להרדימ זבובי פירות בוגרים (Medfly) באמצעות קרח או CO2, אך חשיפה ממושכת עלולה להפחית את סיכויי ההישרדות של חלקם. בדקו את נוכחות הפלואורסצנציה האדומה באמצעות מסנן רחב של DS red.או בדוק את נוכחות הפלואורסצנציה הירוקה באמצעות מסנן EYFP. העבר את הפרטים שהוכתבו לכלוב קטן עם בוגרים מסוג wild-type מהמין השני כדי להקים זן הטרוזיגוטי. בניסוי אחד, נעשה שימוש ב-RNA בעל זן כפול כדי להשתיק את ביטוי הגן inx5.קו הנבט הבוגר של בקרה לא מוזרקת נראה תקין כמצופה, בעוד שפרטים שעברו טיפול הראו אשכים ושחלאים תת-מפותחים. כימות של שפע התמלול של inx5 בבטנו של פרטים משני המינים אישר ביטוי נמוך משמעותית של הגן בהשוואה לבקרה. בניסוי שני, נוצרו שני זנים עם זרע מסומן, תוך שימוש בקידום של beta-2 tubulin להנעת סממנים פלואורסצנטיים שונים.זכרים טרנסגניים הראו דפוס פלואורסצנציה מובחן בגוף ובאשכים. באמצעות סרטון זה, אנו מספקים את הפרוטוקולים האופטימליים שלנו לגידול ולהזרקה מיקרוסקופית של חומצות גרעין לעוברים של זבוב הפירות הביתי. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להזריק עד 1,000 עוברים במהלך יום עבודה של שמונה שעות.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שימוש במתכות אחרות כגון thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine כדי לפתח דור חדש של זני זבובים פירותיים (medfly).

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג'יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

למדו שיטת מיקרו-הזרקה להעברת חומצות גרעין לעוברי זבוב הפירות הים תיכוני (Ceratitis capitata). שיטה זו מאפשרת יצירת זנים טרנסגניים ופיתוח אסטרטגיות בקרה חקלאיות מתקדמות.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,

גלה סרטונים נוספים