In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבדוק ישירות את ההשפעה של היפוקסיה של הגידול על גרורות באמצעות מודל של בעלי חיים. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי המנגנון העומד בבסיס ההשפעות הפרומטגרטיות של היפוקסיה ומטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות למניעת התפשטות הגידול. שני יתרונות של טכניקה זו הם היכולת לבחון את ההשפעות של היפוקסיה של גידול in vivo, ולסכם את שלבי הגרורות והאינטראקציות בין התאים המתרחשים בחולי סרטן.

במודל שלנו, היפוקסיה של הגידול נוצרת על ידי קשירה של עורק הירך המספק דם להילום נושא הגידול של העכבר. קטיעת הגפה האחורית לאחר מכן מונעת את הניידות הקשורה לצמיחה חוזרת של הגידול הראשוני, ומאפשרת היווצרות גרורות. ידגימו את ההליך ג'ייסון טילן, סונג-קיוק הונג וד"ר אולגה רודריגז, מנהלת שותפה של מעבדת המחקר להדמיה פרה-קלינית כאן בג'ורג'טאון.

כדי להזריק את תאי הסרקומה של יואינג, רסנו בעדינות עכבר SCID בז' בן ארבעה עד שישה שבועות, וייצבו את רגל שמאל בין האצבע הרביעית לחמישית כדי לחשוף את הצד המדיאלי של הגפה האחורית התחתונה. הכנס מחט בגודל 28 אינץ' בגודל 1/2 אינץ' בזווית של כ-30-45 מעלות מלפנים לתוך שריר הגסטרוקנמיוס לכיוון פסגת השוקה. כאשר קצה המחט נוגע בפסגה, משוך מעט את המחט והזריק לאט לאט 0.1 מיליליטר מתאי סרקומה יואינג תוך המשך משיכת המחט.

לאחר מכן השתמש בקליפרים דיגיטליים כדי למדוד את גודל העגל מדי יום באמצעות האורך המדיאלי/רוחבי והקדמי/אחורי עד שגודל הגידול יגיע לנפח הרצוי. לפני תחילת הקשירה, יש להזריק תת עורית חומר משכך כאבים ואחריו מתן Hypoxyprobe-1 לאישור היפוקסיה. לאחר מכן, הניחו את העכבר המורדם על משטח חימום על משטח ההפעלה ומרחו משחה על עיני החיה.

לאחר מכן, האריכו ואבטחו את הגפה האחורית בעזרת פיסת סרט כ-45 מעלות מקו האמצע. יש להסיר את אזור הניתוח עם קרם להסרת שיער, להסיר את הקרם בעזרת כרית הכנה לאתנול לאחר 10 שניות ולחטא את העור החשוף בשלושה מגבונים רצופים של 10% פובידון-יוד ואתנול. העבירו את העכבר מתחת למיקרוסקופ סטריאו ובצעו חתך של סנטימטר אחד בעור מאמצע הירך לכיוון אזור המפשעה.

בעזרת צמר גפן עדין רטוב במי מלח, הברישו בעדינות את רקמת השומן התת עורית המקיפה את שריר הירך. לאחר מכן נתח בזהירות את רקמת השומן התת עורית כדי לחשוף את עורק הירך הבסיסי. ייצב את הפצע ואת שדה הניתוח כדי לחשוף את כלי הדם של שריר המקרב האמצעי-עליון והשתמש במלקחיים עדינים כדי לחדור בעדינות דרך מעטפת הירך הקרומית כדי לחשוף את הצרור הנוירו-וסקולרי.

בעזרת סט נקי של מלקחיים עדינים, נתחו והפרידו את עורק הירך מווריד הירך והעצב במיקום הפרוקסימלי ליד המפשעה, דיסטלי לרצועה המפשעתית. לאחר מכן, העבירו תפר משי 6-0 מתחת לעורק הירך הדיסטלי לברך של עורק הירך הצדדי, וחסמו את עורק הירך בקשרים כפולים. סגור את החתך עם 6-0 תפרי פוליפרופילן והזריק תת עורי 0.5 מיליליטר מי מלח חמים לטיפול במאזן נוזלים.

לאחר מכן הניחו את החיה על גבי כרית חמה עטופה בכלוב ההתאוששות עם ניטור עד להתאוששות מלאה. בנקודת הזמן המתאימה לניסוי, רסנו בעדינות את החיה והשתמשו בקוצץ כדי לגלח את השיער מהגפה הנושאת את הגידול מהשוקה הדיסטלית לאזור האגן. הזרקו את החומר המשכך כאבים והניחו את החיה המורדמת בתנוחת שכיבה רוחבית ימנית על וילון סטרילי המונח על כרית חימום.

מרחו משחה על העיניים וחטאו את מקום הניתוח כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, הניחו וילון סטרילי על החיה ובצעו חתך עור היקפי באמצע עצם הירך ואחריו דיסקציה קהה ונסיגה פרוקסימלית של העור. חשוף את הפדיקל הנוירווסקולרי המדיאלי של עצם הירך בצד החציוני של הרגל.

לאחר מכן השתמש בתפר נספג מצופה 4-0 פוליגלקטין 910 כדי לקשור ליד הרצועה המפשעתית. בעזרת מספריים, בצע חתך אמצע הירך של השריר ואחריו דיסקציה קהה של הרקמה הרכה למפרק הקוקסופמורלי. בעזרת חותך עצמות, בצע אוסטאוטומיה באמצע עצם הירך ואחריה לחץ עדין באתר האוסטאוטומיה עם ספוג ג'לטין נספג כדי למזער את הדימום.

לאחר מכן השתמש בקליפסים לפצעים כירורגיים כדי לסגור את העור שמעליו ולהזריק תת עורית 0.5 מיליליטר של מי מלח חמים לטיפול במאזן נוזלים. לפחות פעמיים בשבוע, יש למשש בזהירות את אזורי הראש, הצוואר ובית השחי והגפה האחורית הנגדית של בעלי החיים שהוזרקו לגידול. בדוק אם יש גרורות באיברים פנימיים באמצעות התנפחות בטנית ונוכחות של גרורות ריאה באמצעות לחץ תהליך xiphoid עדין עם האצבע המורה.

כדי להעריך את הגרורות של האיברים הפנימיים על ידי MRI בנקודות הזמן המתאימות, הפעל את המשאבה המחוברת למערכת זרימת מים חמים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית של העכבר. לאחר מכן, הנח את חיישן הנשימה במגע עם הבטן העליונה של החיה והפעל את ציוד ניטור הנשימה של BIOPAC Systems. הנח את העכבר המורדם על מחזיק סטריאוטקסי של עכבר מעוצב בהתאמה אישית ומרח משחה עיניים על עיני החיה.

כדי להפחית את חפצי התנועה והרעש, בחר באפשרות השער בפרוטוקול MRI כדי לסנכרן את איסוף הנתונים עם מחזור הנשימה. לאחר מכן, הפעל רצף הדמיה אנטומי דו-ממדי משוקלל T2 כדי לדמות את הגרורות. לתרבית תאי גידול ראשונית לאחר קטיעה, חתך או נקרופסיה, קצרו שניים עד שלושה מקטעים של 2-3 מילימטר של רקמת גידול בת קיימא בצבע ורוד-אדום מבריק, מכל דגימת רקמה מעניינת והניחו את המקטעים המבודדים בצלחות תרבית תאים בגודל 6 סנטימטר המכילות מדיום תרבית ראשוני טרי.

לאחר מכן, העבירו את הרקמות לאינקובטור תרבית תאים לתקופת הצמיחה התאית המתאימה. לאחר הזרקת תאי סרקומה יואינג לשריר הגסטרוקנמיוס, הגידולים הראשוניים מורשים לגדול לגודל עגל של 250 מילימטר מעוקב. גידולי בקרה בנפח זה מציגים רמה נמוכה יחסית של היפוקסיה אנדוגנית אך ורק בתאים המרוחקים מכלי הדם כפי שנקבע על ידי צביעת Hypoxyprobe-1.

לעומת זאת, קשירת עורק הירך גורמת להיפוקסיה עמוקה ברוב המכריע של תאי הגידול, אפילו אלה הקרובים לכלי הדם. היעילות של קשירת עורק הירך נתמכת על ידי עיכוב מוחלט של צמיחת הגידול הראשוני לאורך תקופה של שלושה ימים בין קשירת עורק הירך לקטיעה. ניתוח היסטופתולוגי חושף אזורים נרחבים של נמק בגידולים ראשוניים שטופלו בקשירת עורק הירך שנקטפו שלושה ימים לאחר הניתוח.

עם זאת, ישנן קבוצות של תאי גידול ברי קיימא הנמצאים בתוך רקמת הגידול הממוקמת בשולי הגידול קרוב לכלי הדם. תאי הגידול הנותרים הנותרים הם פולשניים ביותר כפי שמעיד האינטרוואזציה המסיבית שלהם. תאים רבים בתוך לומן הכלי חיוביים ל-Hypoxyprobe-1, מה שמצביע על כך שתאים היפוקסיים לאחר קשירת עורק הירך עשויים ליזום פלישה אנגיולוגית.

בניסויים אלה, היפוקסיה הגדילה משמעותית את התדירות והריבוי של הגרורות, שנצפו לעתים קרובות במקומות שאינם מושפעים בעכברים הנושאים גידולי בקרה. לאחר השליטה, ניתן להשלים כל הליך כירורגי, כולל הכנה, הרדמה והתאוששות תוך 30 דקות לכל בעל חיים. אורך הניסוי כולו תלוי בקו התאים בו נעשה שימוש ובקצב הגדילה והגרורות שלו.

לוחות הזמנים של MRI והמתת חסד משתנים בהתאם לחביון הגרורות, ויש לקבוע אותם עבור כל קו תאים בודד בניסוי פיילוט. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על ניהול הכאב המתאים וניטור בעלי חיים לאחר ההליך. אם ההליך מבוצע בצורה מושלמת, אין להבחין בתופעות לוואי חמורות או מוות הקשורים לניתוח.

לאחר הליך זה, רקמות ותאים מגידולי בקרה וגידולים ראשוניים היפוקסיים כמו גם מהגרורות המתאימות להם יכולים להיות נתונים לניתוח נוסף, כולל פרופיל ביטוי גנים גלובלי לזיהוי המנגנונים של גרורות הנגרמות על ידי היפוקסיה. טכניקה זו יכולה לשמש את החוקרים בתחום הגרורות הסרטניות לבדיקה ישירה של ההשפעות של היפוקסיה של הגידול על התפשטות המחלה. למרות שכאן התמקדנו בסרקומה של יואינג, ניתן ליישם גישה דומה לגידולים אחרים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מודל חייתי של היפוקסיה של גידול וכיצד לפקח על הגרורות המתקבלות הן in vivo והן ex vivo.