יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי
4 באוגוסט 2017
נגזר שומן בתאי גזע (השיקופיים) בקלות מבודדים, שנקטפו השומן של חולדות רגילה. גליונות ASC יכולים להיווצר באמצעות הנדסה תא גיליונות, יכול להיות מושתלים לתוך צוקר סוכרתית חולדות שומני מפגין מלא-עובי העור פגמים עם עצם חשופה והן מכוסות bilayer של עור מלאכותי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאמת את ההשפעה של יריעות תאי גזע שמקורן בשומן בשילוב עם עור מלאכותי על ריפוי פצעים עבור פגם עור גדול בעובי מלא בחולדה סוכרתית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ריפוי פצע כרוני, כגון פצע גדול סוכרתי עם עצם חשופה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאים מושתלים לפצע ביריעות מוצקות בטכנולוגיית יריעות תאים, והתוצאה היא השתלה בת קיימא ויציבה.
עבור תורם כרית שומן, תכנן להשתמש בחולדות לואיס בנות שמונה עד 33 שבועות. באתר הניתוח, הכינו מספר אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה, גזות, אזמל, מחזיק מחט, מספריים לניתוח, זוג מלקחיים ותפר ניילון 5-0. להנחת רקמות זמנית, טען צלחת פטרי של 100 מיליליטר עם 10 מיליליטר PBS.
שקלו את הצלחת העמוסה ב-PBS כדי למצוא מאוחר יותר את מסת הרקמה שנקטפה. לאחר הרדמת החולדה, הניחו אותה על וילון סטרילי. לאחר מכן, יש לגלח את אזור הניתוח ולשפשף את העור החשוף באמצעות מספר קרצוף לסירוגין של 70% אתנול.
כעת, בצע חתך עור של שלושה סנטימטרים בבטן התחתונה לרוחב. לאחר מכן, חשוף ונתח את השריר האלכסוני החיצוני. לאחר מכן, חשוף את רקמת השומן האפידידימלית המקיפה את האפידידימיס.
לאחר מכן, כרתו בזהירות את רקמת השומן האפידידימלית. הימנע מפגיעה באפידידימיס, באשכים ובכלי הדם האפידידימליים. העבירו את הרקמה לצלחת של PBS.
לאחר מכן, סגור את החולדה התורמת ופעל לפי נוהלי הטיפול הסטנדרטיים לאחר הניתוח. בודד את ה-ASCs משניים עד שלושה גרם של רקמת שומן שנקטפה. עכל את הרקמה במשך שעה בקולגנאז מסוג A של 0.1% כדי לקבל את מקטע כלי הדם הסטרומלי, או SVF.
לאחר טיהור ה-SVF, השהה את ה-SVF ב-20 מיליליטר של מדיה. מחלקים את המתלה לשתי כלי תרבות בגודל 60 סמ"ר, ומגדלים אותם למשך 24 שעות בתנאים סטנדרטיים. למחרת, שטפו את הצלחות עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר תאים ופסולת לא מחוברים.
לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים בחזרה מדיום שלם טרי. לאחר מכן, המשיכו לעבור את התאים עד שהם כמעט תת-מתכנסים ביום השלישי של התרבית. לאחר מכן, שימוש במיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA בדגירה קצרה.
הסר את התאים מהצלחת. אל תתנו לתאים להיחשף לטריפסין פעיל יותר מ-10 דקות. לאחר התבוננות וספירת התאים, תת-תרבית אותם בצפיפות של 1,700 לסנטימטר מרובע.
לאחר מכן, עברו את התאים כל שלושה ימים, והשלימו שלושה קטעים לפני שתמשיכו. לאחר העברת ה-ASC של החולדה בפעם השלישית, צלחו 150,000 תאים על צלחת תרבית מגיבה לטמפרטורה בקוטר 35 מילימטר, ושני מיליליטר של מדיום תרבית. תרבית את המנה במשך שלושה ימים בחממה להכנת יריעת תאים אחידה.
שלושה ימים לאחר מכן, החלף את המדיום והוסף 16.4 מיקרוגרם למיליליטר AA. לאחר מכן תרבית את התאים, והחלפת מדיום AA כל יומיים. לאחר ארבעה או חמישה ימים על המדיום המכיל AA, בדוק את התפשטות ה-ASC. חפש רווחים בין התאים ליריעת התאים הרציפה.
לאחר הקמת גיליון תאים רציף, ניתן להשתמש בתאים עבור המודל. במידת הצורך, אסוף את גיליון התא על ידי הנחת הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות. מכיוון שהצלחת רגישה לטמפרטורה, התאים יתנתקו באופן ספונטני כיריעה רציפה, וניתן להסיר את היריעה בעזרת מלקחיים.
עבור מודל ריפוי פצעי השמנת יתר, השתמש בחולדות ZDF זכרים בוגרים, בני 16 עד 18 שבועות במשקל שבין 500 ל -600 גרם. מקם והרדם חולדה בשדה הניתוח, ולפני גילוח הראש, נקה אותו באמצעות אתנול 70%. לאחר מכן, יש לגלח את אזור הניתוח ולנקות את העור החשוף בעזרת קרצוף לסירוגין של 70% אתנול.
בערך בזמן זה, העבירו את הצלחת הרגישה לטמפרטורה של תאי גזע שומנים לספסל. לפני שגיליון התא מתנתק מהצלחת, הסר את המדיום ושטוף את גיליון התא עם PBS שלוש פעמים. לאחר איסוף יריעת התא, יש להשרות אותו ב- PBS עד הצורך.
לאחר שהתאים מוכנים, צרו פגם עור בעובי מלא של 15 על 10 מילימטר על ראש החולדה. ראשית, הסר את הרקמה העורית עד לפריוסטאום. לאחר מכן, כרתו את העור רקמה עורית בעזרת אזמל ומספריים כירורגיים.
להשלמת הפגם, הסר את הפריאוסטאום עם הרספטורי הפריאוסטאלי. לאחר מכן הניחו את גיליון התא מעל הפגם. יריעת תאי הגזע רכה וגמישה.
השתמש במלקחיים כדי להאריך אותו לכל פינה של הפגם. כעת, כסו את יריעת התא והפגם במדבקה של 10 על 15 מילימטר של עור מלאכותי ספוג במי מלח ממש לפני השימוש, וסגרו את הפצע בכ-10 תפרים באמצעות תפר ניילון 5-0. כדי להגן על הפצע, השתמש בתפר ניילון 5-0 כדי להדק טלאי בגודל 15 על 20 מילימטר של תחבושת לא דביקה על העור המלאכותי.
תכננו להתבונן בחבישה כל יומיים, מכיוון שהחולדה תמיד תסיר אותה, ובמידת הצורך תחליף את התחבושת מייד. בשתי קבוצות של שש חולדות שמנות סוכרתיות צוקר, הפרוטוקול המתואר שימש ליצירת פגם בגולגולת. חולדות ניסוי טופלו ביריעת תאי גזע של חולדות, וקבוצת הביקורת לא.
לאחר 14 יום, הפצעים של קבוצת הטיפול היו קטנים משמעותית מאלה של קבוצת הביקורת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פצע גדול עם עצם חשופה בחולדות, ולאחר מכן לטפל בפצע זה בתאי גזע שמקורם בשומן. בעת ניסיון הליך זה, הקפד להשתמש בניהול טמפרטורה קפדני במהלך כל תהליך השימוש בכלי תרבית מגיבים לטמפרטורה.
אחרת, תאים עלולים להתנתק באופן ספונטני מהכלים, ולעכב את הניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את השימוש ביריעות של תאי גזע מהרקמה השומנית (ASC) בשילוב עם עור מלאכותי לריפוי פצעים בחולדות סוכרתיות. שיטה זו נועדה להתמודד עם אתגרים בריפוי פצעים כרוניים, במיוחד במקרים של פגמים בעור בעובי מלא ושל עצם חשופה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- טיפול בתאי גזע
- ריפוי פצעים
- מחקר על סוכרת
רקע
- תאי גזע מהרקמה השומנית נאספים בקלות מחולדות רגילות.
- הנדסת דפי תאים מאפשרת יצירת דפים של ASC.
- חולדות סוכרתיות סובלות לעיתים קרובות מפצעים כרוניים שקשה לרפא.
- שילוב של דפי ASC עם עור מלאכותי עשוי לשפר את תוצאות הריפוי.
מטרת המחקר
- להערכת היעילות של גיליונות ASC בקידום ריפוי פצעים.
- לבחינת הפוטנציאל של שיטה זו לטיפול בפגעי עור נרחבים.
- לספק תובנות לגבי מנגנוני ריפוי פצעים כרוניים במצבים של סוכרת.
שיטות שהשתמשו בהן
- בידוד וקציר של ASCs מחולדות רגילות.
- יצירת דפי ASC באמצעות טכניקות להנדסת דפי תאים.
- השתלה של דפי ASC בחולדות Zucker diabetic fatty.
- יישום של שכבה כפולה של עור מלאכותי מעל ההשתלה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של דפי ASC להשתלה.
- שיפור בריפוי פצעים שנצפה בחולדות סוכרתיות בעקבות שימוש בדפי ASC.
- השגת השתלות יציבות וחיות באמצעות טכנולוגיית דפי תאים.
- פוטנציאל של שיטה זו לטיפול יעיל בפצעים כרוניים.
מסקנות
- גיליונות ASC בשילוב עם עור מלאכותי מראים פוטנציאל לריפוי פצעים.
- טכניקה זו עשויה לספק פתרון יעיל עבור פצעים כרוניים בחולי סוכרת.
- נדרש מחקר נוסף כדי לאפטמיזציה ולהבנה של המנגנונים המעורבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ריפוי פצעים כרוניים בהקשרים של סוכרת מהווה אתגר תרגומי משמעותי, עם צורך גבוה שאינו מסופק להתערבויות ניתנות להרחבה ובעלות רלוונטיות ביולוגית. יצירה והשתלה של גילי תאי גזע מהרקמה השומנית (ASC), בשילוב עם עור מלאכותי, מציעות פלטפורמה להערכת אסטרטגיות רגנרטיביות במודלים פרה-קליניים בעלי רלוונטיות למחלה. גישה זו תומכת בביטחון ניבוי בבדיקת השערות טיפוליות בשלבים מוקדמים, ומספקת בסיס לקבלת החלטות על קידום טיפולים מבוססי תאים המכוונים לתיקון רקמות פגוע, תוך התחשבות בסיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני התחדשות בהקשר של ריפוי פצעים בסוכרת.
- תומך בתיקוף תפקודי של תיקון רקמות המתווך על ידי ASC in vivo.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים עבור היפותזות טיפוליות מבוססות תאים.
- מספק פלטפורמה להערכה השוואית של מקורות תאי גזע ופורמטים של הולכה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכונן מודל פצע הדיר וניתן לכימות עבור מחקרי יעילות המשכיים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההכנה וההשתלה של גיליאי ASC.
- תומך ביצירת מדדי סגירה כמותיים של פצעים לצורך הערכת מועמדים.
- מסייע בהכנת הבדיקה לסריקה של תרכובים רגנרטיביים או שינויים תאיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות עבור ריפוי פצעים סוכרתיים והתחדשות רקמות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של התערבויות מבוססות תאים.
- מאפשר קבלת החלטות של go/no-go מותאמות סיכון, המבוססות על תוצאות של תיקון רקמה פונקציונלי.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית לצורך תיעדוף תיקי פיתוח ברפואה רגנרטיבית.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו משתלבת ברצף מהשלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין בדיקת השערות רגנרטיביות מוקדמות לבין תיקוף של מודלים תרגומיים לריפוי פצעים בסוכרת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהערכה מונחית-השערה של תיקון המתווך על ידי ASC בסביבות ריפוי פגומות.
- סריקה: מספקת מודלים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של פצעים ומדדי סגירה כמותיים להערכת מועמדים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של הפחתת שטח הפצע וניתוח השוואתי בין קבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: תואם למודלים פרה-קליניים של מחלות הרלוונטיים להתוויות של פצעים סוכרתיים וכרוניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקת מקורות תאים מגוונים, שיטות הובלה או טיפולים נלווים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתוכניות לרפואה רגנרטיבית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של ייצור והשתלה של גילי ASC להשגת תוצאות הדירות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך ביצוע (go/no-go) והקצאת הון לטיפולים מבוססי תאים לריפוי פצעים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים רגנרטיביים המיועדים לטיפול בפצעים כרוניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד תאי גזע, הנדסת שכבות תאים והשתלה כירורגית.
- דורש גישה לכלים לתרבית תאים בעלי תגובה לטמפרטורה ותשתיות כירורגיות לבעלי חיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת שכבות התאים והערכת הפצעים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מודלים שונים של בעלי חיים או סוגי פצעים שונים.
- שכבות ASC רגישות להתייבשות, דבר המחייב שמירה על סביבה לחה באמצעות כיסוי של עור מלאכותי.
