Name: אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: למדו פרוטוקול אקוסטי אוטומטי לדילול סדרתי של פפטידים כדי למזער ספיגה לפלסטיק ולשפר את דיוק קביעת האון בתהליכי גילוי תרופות. שיטה זו מסייעת למחקר ביוכימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. דילול סדרתי פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ assay: הנקס שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) השלימו עם 25 HEPES מ&quot;מ, BSA 0.1% ו -0.5 מ&quot;מ 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף באופן שיטתי 5 μl של חיץ assay היטב בכל חמש 384 גם צלחות assay בנפח נמוכות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה פנימית ליצירת תכנית מחלק לתוספת נפח 5 μl לכל גם צלחת 384-גם לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול מחלק צינורות קלטת חיץ assay נוזל הממשלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת assay בנפח נמוך 384 גם על נושאת צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ התחל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל כל דגימות פפטיד, ללא קשר לרכב אחסון, למאגר assay לייצר מלאי פפטיד 100x. הערה: פפטידים מחייב הקרנה ניתן לספק מלוח פוספט שנאגר (PBS) או sulfoxide דימתיל (DMSO) כפי שייראה לו (למשל, DMSO wחולה יש השפעה מזיקה על פפטידים עם שינויים משניים כגון PEGylation). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 25 μl מניות פפטיד 100x לעמודות 1-5 של microplate פוליפרופילן מוסמך אקוסטית 384 גם. צלחת זו מיועדת ל&#39;מקור צלחת &#39;. ודא צלחות מקור, אך לא צלחות יעד, הם תחתיים שטוחים להתאים לסיבולות אקוסטי ספציפית כפי שהוגדר על ידי היצרן של כלים אקוסטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 25 μl 100x מלא התייחסות אל בארות A23 ו A24 של א צלחת המקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר חיץ assay 10 μl לעמודות 11-15 ו -30 חיץ assay μl לעמודות 21-22 א צלחת מקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר חיץ assay 10 μl לעמודות 6-10 ועמודות 16-20 של microplate פוליפרופילן השני מוסמך אקוסטית 384 גם. צלחת זו מיועדת ל&#39;מקור צלחת ב &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A ו- B צלחות מקור צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1. כלול צלחת איזון ראויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש flui אקוסטימכשירי ד משולב לתוך מערכת רובוטית אוטומטית להכין שלושה רציפים 1: דילולים ביניים 100 (חיץ assay) של מניות פפטיד 100x מעמודה 1 במקור א הערה: תכנות דורש לעצב מחדש צלחת ותוכנת מנת תגובה (כפי שנמסר על ידי היצרן של מנפק נוזל אקוסטי) כדי לאפשר שלוש העברות אקוסטי בין מקור ומקור B (ראה איור 1 עבור פריסות צלחת). שלב 1.9 פרטים במיוחד השימוש של מכשירי נוזל המשמשים במעבדה זו בשליטת רובוטיות אוטומטית (ראה לוח חומרים): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מקור טען וצלחות assay לתוך קטע רובוטיקה מלון צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב אוטומטי לעצב מחדש צלחת תוכנת עומס רובוטית ופרוטוקולי הרחבת תכנית מנת תגובה. לחץ על &#39;הפעלה&#39;. הערה: אוטומציה מורה מנפק נוזל אקוסטי להעביר 250 NL מעמודות 1-5 של מקור צלחת לעמודות 6-10 של מקור צלחת B, וכן acousti השניג מנפק נוזל מסוגל להתמודד עם כמויות נוזלים גדולות להשלים רווחים עם 15 μl חיץ assay לערבב. אוטומציה ואז מעבירה מקור צלחת ב &#39;צנטריפוגות משולבת צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1 (צלחת איזון ראויה כלולה עבור כל צעדי צנטריפוגה). B צלחת מקור מוחזר מנפק נוזל אקוסטי להעברת 250 NL מעמודות 6-10 המקור צלחת B לעמודות 11-15 של צלחת המקור למילוי עם חיץ assay 15 μl לערבב. אוטומצית מקור העברות צלחת א &#39;עד צנטריפוגות צנטריפוגות משולבות XG ב 300 דקות 1. צלחת מקור ואז מוחזר מנפק נוזל אקוסטי להעברת 250 NL מעמודות 11-15 של צלחת המקור לתוך עמודות 16-20 של B צלחת המקור למילוי עם חיץ assay 15 μl לערבב. אוטומציה ואז מעבירה מקור צלחת ב &#39;צנטריפוגות משולבת צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1. הערה: לבסוף פרוטוקול מנת התגובה מפנה מחלק אקוסטי להעבירהנפח הנדרש מכל אחד 4 בארות צלחת המקור בדילול סדרתי (בשני צלחת המקור ומקור צלחת B) לבנות עקום 11 נקודות מלאות בשני עותקי צלחות assay (טרום מלא חיץ assay 5 μl בשלב 1.2 לעיל ). העברות אוטומציה צלחת assay כדי צנטריפוגות משולב צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1. </li></ol></li></ol> 2. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחלה של אוגר סיני cryopreserved ההפשרה (CHO) התאים המבטאים את הקולטן ל- GLP-1 העכבר היעד במהירות באמבט 37 ºC מים resuspend במאגר assay 20 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר (RT). כלול איזון ראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר assay 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תא מניות 1: 1 בכחול Trypan ולקבוע צפיפות תאי קיימא באמצעות דלפק תא אוטומטי. תאים Resuspend במאגר assay ב 1.6 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל (שווה ערך ל 8,000 תאים לכל well של צלחות assay). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף 5 μl של ההשעיה תא היטב כל צלחות assay (המכיל פפטידים בדילול סדרתי חיץ assay 5 μl) ו לדגור על RT למשך 30 דקות. </li></ol> 3. Assay איתור HTRF cAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו ערכת assay HTRF cAMP ל RT למשך 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כל מגיב HTRF (cryptate ו- D2) בנפרד בשעה 1:20 דילול במאגר תמוגה (ניסוח קניינית, המסופקים על ידי היצרן של assay זיהוי cAMP). הערה: זהירות: תמוגה חיץ מכיל פלואוריד אשלגן (KF) שהוא רעיל וכן teratogen 13. למידע אודות השלכה, צלחות assay המכילות KF צריכות להיות אטומות לאפר, וכל פסולת נוזלית חייבת להיות מדוללת ל &lt;1 מילימול / ליטר עם מים לפני הסילוק לתוך הכיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף מגיב cryptate 5 μl לכל הבארות של צלחות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף מגיב D2 5 μl כדי קולוםns 1-22 של צלחות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד ידני פיפטה חיץ תמוגה 5 μl לתוך בארות A23-D24 של צלחות assay לתת ספציפיים שאינם מחייבים (NSB) בארות שליטה, ו -5 μl של מגיב D2 לתוך בארות E23-p24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות assay דקות 1 ב 200 XG ב RT לערבב את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחות assay למזער התאדות צילום הלבנה לדגור על RT במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד תהודת העברת אנרגית פלואורסצנטי (סריג) אות באמצעות עירור ב 320 ננומטר פליטה ב 620 ננומטר ו 665 ננומטר באמצעות קורא צלחת. </li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מתכוון NSB לחסר רקע מכל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב% דלתא F מיחס 665 ננומטר / 620 ננומטר כדלקמן: יחס = (A 665nm / A 620nm) x 10 4 דלתא F = ((יחס לדוגמה - יחס NSB) / יחס NSB)) x 100 שם יחס NSB = בארות ללא מגיב D2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב activat%יון בין תאים ותאי unstimulated מגורה עם ליגנד GLP-1 המרבי כדלקמן: הפעלת% = (% דלתא Fsample -% תאים DeltaFunstimulated) / (% מגורה DeltaFGLP-1 תאים -% תאים unstimulated DeltaF) x 100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עקומות ריכוז תגובה באמצעות ניתוח לוגיסטי 4-פרמטר, וגרף כפי הפעלת% כפי שהוגדר על ידי התייחסות מלאה 1. </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917(2008).</li>
<li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
<li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li>
<li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li>
<li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac.J.Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li>
<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את היישום המוצלח של מחלק אקוסטי האוטומטי לדלל דגימות פפטיד סדרתי על פני טווח ריכוז של 3 x 10 6 הדורשים פחות מ -1 μl של מדגם. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לשפר את איכות נתונים באמצעות מזעור ספיחת פפטיד plasticware באמצעות לחשיפה מצומצמת של דגימות למכלי ניסיוני plasticware (כגון טיפי פיפטה) כי נדרשים בדרך כלל להעברת מגיב ערבוב. בעוד מחלק אקוסטית לא לגמרי פוסל את השימוש plasticware, זה להפחית באופן משמעותי. יתר על כן, את הסרת pipetting מבוסס קצה גם מבטלת ש...

של GLP-1R מהווה יעד תרופה קיימת לטיפול בסוכרת מסוג 2 2. אגוניסט פפטיד המקורי עבור קולטן זה, GLP-1, יש in vivo זמן מחצית חיים של 2-3 דק &#39;3. הכריכה של GLP-1 לתוצאות קולטן היעד מצמידים חלבון G שלה בייצור במורד הזרם של cAMP השליח השני באמצעות צימוד חלבון יליד ז &#39;ההפעלה של cyclase adenylyl. מדידה במחנה שנצבר מספקת assay חזק כדי לפקח הפעלת קולטן ו למסך אנלוגים GLP-1 פעילים עם מאפייני physicochemical מועדפים. כזה assay מחייב דילול סדרה של דגימות בדיקה לבנות תגובה עקומה ריכוז, וזה מסובך במיוחד בעת מסירת דגימות פפטיד. שגיאות פוטנציאליות מהכנת דילול סדרה מבוסס קצה תוארו בעבר 1,4,5. פפטידים יהיה לספוג plasticware, וכתוצאה מכך הערכות עצמה אמינות. ניתן למזער אובדן פפטיד באמצעות tהוא הכללת אלבומין בסרום שור (BSA) מאגרים ושימוש plasticware siliconized, עדיין חלבון מחייב נשאר בלתי צפויות. בפרט, וריאציה עקדת GLP-1 למיכלי ניסיוני תוארה 6. יש סיבוך נוסף סוכני ייצוב לזה המשמש plasticware מעבדה יכול לסנן מן טיפי צלחות microtiter לתוך מאגרי assay מימית ולהפריע חלבון פונקציה 7, 8. לכן, שיטות להקטין את חשיפת plasticware נחוצה כדי לשפר את מידת הדיוק של מדידות. מכשירי נוזלי אקוסטיות להתמקד צליל האקוסטי בתדירות גבוהה על פני השטח של מדגם נוזל, וכתוצאה מכך הוא הוצאתן של טיפות nanoliter מדויקות לתוך צלחת assay סמוכה 9. השימוש של פליטה אקוסטית הוא סטנדרטי בתעשיית התרופות לעריכת הקרנת ספריות תרכובת סינטטיות גדולות, ואת הטכנולוגיה תאומת טוב molecul הקטןes 10. למיטב ידיעתנו, אנחנו הקבוצה הראשונה לתאר מחלק אקוסטי לעריכת פפטידים רקומביננטי וסינטטיים ואנחנו בעבר דיווחנו על הדיוק המשופר בהשוואה לשיטות קצה מבוסס קונבנציונליות 1. מאמר זה מתאר את האינטגרציה של הכנת דילולים סדרתי וישיר פפטיד בהעברה אקוסטי ללא מגע על גבי מערכת רובוטיקה טיפול צלחת אוטומטי לחלוטין. מספר השיטות המקיפות העברת אקוסטי של דגימות תוארו בעבר 11. אנו מנצלים שיטת שני שלבים להכין ריכוזי מניות ביניים לדלל אנלוגים פפטיד סדר עבור הדור של עקומת מנה-תגובה המלאה. פפטידים מוכן מודגרת עם תאים המבטאים את עכבר היעד GLP-1R, ואנו משתמשים קרינת זמן נפתר הומוגנית זמין מסחרי (HTRF) assay למדוד הצטברות cAMP בתוך התאים האלה כמו הודעה של activ אגוניסט פפטידity. Assay הוא חזק מקובל בפורמט תפוקה גבוהה 384 גם ויישמנו באופן שיגרתי הוא בפיתוח assay הקרנת סמי פרויקטים 12.

<table><tbody><tr><td>הנקס תמיסת מלח מאוזנת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>מוכן כמלאי 0.5 M ב-DMSO</td></tr><tr><td>GLP-1 (7-36) amide</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>מוכן כמלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS, המכונה 'בקרת ייחוס 100x'בדיקת</td></tr> <tr><td>פפטידים</td><td>מיוצרים בבית ב-MedImmune</td><td></td><td>מסופקים בריכוזים שונים ב-DMSO או PBS לפי הצורך</td></tr><tr><td>מלאי פפטידים פי 100</td><td>מיוצר בבית ב-MedImmune</td><td></td><td>Test פפטיד מדולל למאגר בדיקה לריכוז הסופי הנדרש פי 100</td></tr><tr><td>תמיסת טריפאן כחולה, 0.4%</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS Cell Analyzer</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 לוחות באר, נפח נמוך</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>הד מוסמך 384 בארות פוליפרופילן Microplate</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Echo מאגר מוסמך</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 מטפל נוזלי</td><td>Labcyte בע"מ</td><td></td><td>נפחי העברת טיפות במרווחים של 2.5 nl</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>נפחי העברת טיפות במרווחים של 25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Lab תוכנת תזמון אוטומציה למדעי החיים רובוטיקה</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>המכונה 'מתקן ריאגנטים בתפזורת'HTRF</td></tr> <tr><td>cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioastests</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

כמו גילוי תרופות מולקולה קטנה, בדיקות סקר לאיתור אגוניסטים פפטיד מחייב דילול סדרתי של פפטידים לייצר תגובה עקומות ריכוז. הקרנת פפטידים מעניקה שכבה נוספת של מורכבות כמו שיטות טיפול מדגם קונבנציונליות מבוסס קצה לחשוף פפטידים על שטח פנים גדול של plasticware, מתן הזדמנות מוגברת אובדן פפטיד באמצעות ספיחה. מניעת חשיפה מוגזמת plasticware מפחית אובדן פפטיד באמצעות דבקות פלסטיק ובכך מצמצם אי דיוקים חיזוי עוצמה, ואנו בעבר תיאר את היתרונות של אקוסטית ללא מגע מחלק להקרנה במבחנה תפוקה גבוהה של אגוניסטים פפטיד 1. כאן אנו דנים פתרון אוטומציה משולבים במלואם להכנת אקוסטי ללא מגע של דילולים סדרתי פפטיד צלחות microtiter ניצול בדוגמה של ההקרנה עבור אגוניסטים פפטיד על קולטן גלוקגון דמוי עכבר פפטיד-1 (GLP-1R). השיטות שלנו לאפשר גבוה-throughput מבוסס תאי מבחני למסך עבור אגוניסטים והם להרחבה בקלות לתמוך תפוקת מדגם גדלה, או כדי לאפשר למספר גדול יותר של עותקי צלחת assay (למשל, עבור פנל של קווים נוספים תא המטרה).

<html> אנו משתמשים באופן שגרתי בשיטה דו-צעד כדי לדלל פפטידים באמצעות העברה אקוסטית. עבור השלב הראשון, מנפק אקוסטי מיושר עם אוטומציה משמש ליצירת ארבעה דילולים ביניים פפטיד המניות על פני שני לוחות מקור (איור 1 א, ב). עבור השלב השני, אנו משתמשים מנפק אקוסטית נוספת לדלל דילולים המניות מצלחות מקור A ו- B כדי ליצור טווח הריכוז 11 נקודות עבור כל הפפטיד הבדיקה (איור 1 ג &#39;). כל טווח ריכוז פפטיד הוא ירה ב...

ספיחה של פפטידים לכלי פלסטיק במהלך דילולים סדרתיים מסורתיים מבוססי קצה יכולה להשפיע באופן משמעותי על קביעת העוצמה ולבלבל את ההבנה של קשרי מבנה-פעילות המשמשים לזיהוי עופרת ושלבי אופטימיזציה של עופרת בגילוי תרופות. כאן מתוארות שיטות לדילול סדרתי אקוסטי אוטומטי ללא מגע של דגימות פפטיד.

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול אוטומטי זה לדילול סדרתי של דגימות פפטידים היא למזער את ספיגת הפפטידים לכלי פלסטיק, ובכך לאפשר קביעה מדויקת של העוצמה (potency) לצורך גילוי תרופות. שיטה זו יכולה לשפר את איכות הנתונים ואת השחזוריות שלהם, והסרת השאיבה המבוססת על טיפים מונעת העברה של שאריות דגימה (carryover), כך ששגיאות אינן מופצות לאורך כל תהליך הדילול הסדרתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא העלאת איכות הנתונים על ידי מזעור ספיגת הפפטידים לכלי פלסטיק.דבר זה חשוב במיוחד להובלת קמפיין של קשר מבנה-פעילות או זיהוי מוביל (lead identification) בתהליך גילוי תרופות. לאחר הכנת תמיסת הבאפר של הבדיקה ויצירת תוכנית חלוקה עבור מחלק נוזלים בכמות גדולה (bulk dispenser) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, טבול את צינורות קסטת החלוקה בתמיסת הבאפר של הבדיקה ובצע ה priming של המערכת עם הנוזל. הנח פלטת בדיקה בעלת נפח נמוך עם 384 בארות על נשא פלטות.לאחר מכן לחצו על start. העבירו 25 µL של מלאי פפטידים בריכוז 100-fold לעמודות 1 עד 5 של פלטת מיקרו פוליפרופילן בעלת תחתית שטוחה עם 384 בארות המותאמת לעבודה אקוסטית, אשר תוגדר כלוחית מקור A. העבירו 25 µL של בקרת ייחוס בריכוז 100-fold לבארות A23 ו-A24. לאחר מכן, העבירו 10 µL של באפר בדיקה לעמודות 11 עד 15 ו-30 µL של באפר בדיקה לעמודות 21 עד 22.בשלב הבא, יש להעביר 10 µL של בופר בדיקה (assay buffer) לעמודות 6 עד 10 ו-16 עד 20 של פלטת מיקרו פוליפרופילן שנייה בעלת 384 בארות, המותאמת אקוסטית ומוגדרת כפלטת מקור B. יש לצנטריפוג את פלטות המקור A ו-B במהירות של 300 ×g למשך דקה אחת. לאחר מכן, יש להטעין את פלטות המקור והבדיקה למדור פלטות המלון (plate hotel) של מערכת הרובוטיקה.לאחר מכן, בהפעלת תוכנת הרובוטיקה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו במערכות דיספנסר נוזליים אקוסטיים המשולבות במערכת כדי להכין שלושה דילולים רציפים של 1:100. התחילו בהעברה מעמודות אחת עד חמש בלוחית מקור A לעמודות שש עד 10 בלוחית מקור B. לאחר הכנת הדילול הראשון של 1:100, אפשרו למערכת האוטומציה להעביר את לוחית מקור B לצנטריפוגה משולבת ולסובב במהירות של 300 ×g למשך דקה אחת לפני החזרת הלוחית לדיספנסר הנוזליים האקוסטי. לאחר מכן, לאחר העברת התמיסה מלוחית מקור B ללוחית מקור A עבור הדילול השני של 1:100, תעביר האוטומציה את לוחית מקור A לצנטריפוגה לסבב לפני החזרת הלוחית לדיספנסר הנוזליים.לבסוף, לאחר שהאוטומציה מעבירה את התמיסה מלוח A ללוח B עבור הדילול השלישי ביחס של 100, לוח B עובר שוב צנטריפוגה. דילוציות פפטידים אלו בלוח מקור A ובלוח מקור B משמשות לאחר מכן להכנת עקומות תגובה בריכוז מלא במערך הבדיקה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. שלב זה הוא קריטי, שכן מתודולוגיה השוואתית המבוססת על קצות פפטידים (tips) גורמת לאובדן דרמטי בעוצמת הדגימה עקב ספיחת הפפטידים לכלי פלסטיק.הפשיר במהירות תאי CHO קריו-שמורים המבטאים את קולטן GLP1 של עכבר בתמיסת רדיש (water bath) בטמפרטורה של 37 °C, והשתמש ב-20 milliliters של באפר בדיקה (assay buffer) כדי להשעותם. סבב את תגלי התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 ×g ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. השלך את העלייה (supernatant) והשתמש ב-10 milliliters של באפר בדיקה כדי להשעות את משקע התאים.בעזרת Trypan Blue, דללו את מלאי התאים ביחס של אחד לאחד והשתמשו בסופר תאים אוטומטי כדי לקבוע את צפיפות התאים החיים. לאחר מכן, השתמשו בבופר של הבדיקה כדי להשעות מחדש את התאים בריכוז של 1.6 מיליון תאים למיליליטר. בעזרת מפזר ריאגנטים למסות גדולות, הוסיפו 5 µL של תרחיף תאים לכל באר בלוחית הבדיקה המכילה פפטידים המדוללים בסדרה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לביצוע בדיקת זיהוי ה-cyclic AMP, השתמשו בתמיסת הליזה כדי להכין דילול של 1:20 לכל רכיב פלואורסצנציה בעת רשומה הומוגנית (HTRF). השתמשו במפיץ רכיבים למסות גדולות כדי להוסיף 5 µL של רכיב cryptate לכל בארות לוחות הבדיקה. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של רכיב D2 לעמודות 1 עד 22 בלוח.לאחר מכן, הוסיפו 5 µL מרכיב D2 לבארים E23 עד P24. השתמשו מיד בפיפט ידני להוספת 5 µL של תמיסת ליסיס (lysis buffer) לבארים A23 עד D24, אשר ישמשו כבארות ביקורת לקשירה לא ספציפית. סובבו את לוחות הבדיקה בצנטריפוגה ב-200 ×g ובטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי לערבב את הבארים.לאחר מכן, כסו את הפלטות והדגירו במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, השתמשו בקורא פלטות כדי למדוד את אות ה-fret באורך גל עירור של 320 ננומטר ובאורך גל פליטה של 620 ו-665 ננומטר. נתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.השלב הראשון בהעברה אקוסטית עבור בדיקת זיהוי cyclic AMP הוא יצירת ארבעה דילוסות ביניים של פפטידים מלאי בשני לוחות מקור, כפי שמוצג כאן. בשלב השני, המפיץ האקוסטית מדלל יותר את תמיסות המלאי מלוחות מקור A ו-B כדי ליצור טווח ריכוזים של 11 נקודות עבור כל פפטיד נבדק, בשכפולים, עבור 16 פפטידים שונים. מילוי משלים של באפר הבדיקה מבוצע כדי להבטיח נפח קבוע לכל באר ברחבי לוח הבדיקה.כאן מוצגת מפת חום עבור פלטה לדוגמה המכילה 16 פפטידים בכפולות, שנבדקו במסך של צבירת cyclic AMP. ערכים נמוכים המוצגים בסגול מייצגים ריכוז גבוה של cyclic AMP. עקומות תגובת הריכוז הללו ממחישות את השחזור של נקודות הכפילות.דגימה אחת מהווה בקרה חיובית עבור הבדיקה. דגימות שתיים, שלוש וארבע היו לא פעילות והן מיוצגות על ידי הקווים השטוחים בגרף. דגימות חמש עד 16 מייצגות פפטידים פעילים שנבדקו.השיטה המוצגת כאן מאפשרת יצירת עקומות תגובה לריכוז מלאות על פני טווח רחב של עוצמה. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשלימה תוך שלוש שעות, אך הדבר תלוי במספר הדגימות הדורשות הכנה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שפפטידים הם דגימות ביולוגיות ויש להתייחס אליהם בהתאם.על מנת לשמור על שלמותם, יש להימנע ממספרי מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום גילוי תרופות פפטידיות ותאפשר תחזיות מדויקות של פוטנציה הנחוצות להבנת קשרי מבנה-פעילות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של חלוקה אקוסטית אוטומטית לצורך דילול סדרתי של פפטידים, דבר שימזער את אובדן הפפטידים עקב ספיחה ויגביר את דיוק המדידות שלכם.אין לשכוח כי עבודה עם פפטידים פעילים ביולוגית בעלי פוטנציאל בפיקו-מולרית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי.

automated-acoustic-dispensing-for-serial-dilution-peptide-agonists

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

פרוטוקול עבור כימות חלבון בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית חיסונית אוטומטית-MALDI (iMALDI) מוצג.

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

מאמר זה מציג שיטה המערבים את סינתזה ואפיון של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין, מבחני המתאימה כדי לבדוק את התאימות והיכולת של מיצלה כדי לאגד ומונוציטים.

סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים

פרוטוקול זה מדגים הקלטה בזמן אמת של יחסים מינון-תגובה מלאה עבור agonist-המושרה GPCR הפעלה משכבת תא אחת גדל על מיקרואלקטרודה אחת באמצעות תווית ללא מדידות עכבה. ערכת המינון החדשה מגדילה באופן משמעותי את התפוקה ללא הפסד ברזולוציית הזמן.

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

למדו פרוטוקול אקוסטי אוטומטי לדילול סדרתי של פפטידים כדי למזער ספיגה לפלסטיק ולשפר את דיוק קביעת האון בתהליכי גילוי תרופות. שיטה זו מסייעת למחקר ביוכימי.

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

גלה סרטונים נוספים