דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים
15 בספטמבר 2016
אנו מתארים כאן שיטה ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן הניתנים להתאמה אישית שניתן להשתמש בהם לזיהוי בו-זמני של נוגדנים עצמיים IgG ו-IgM בסרום מבני אדם ועכברים. מערכים אלה מאפשרים זיהוי תפוקה גבוהה וכמותית של נוגדנים כנגד אנטיגנים או אפיטופים מעניינים.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לסנן במהירות נוגדנים עצמיים בצורה מרובה. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי שאלות מפתח בתחום האוטואימוניות, כגון אילו נוגדנים עצמיים קשורים למצבי מחלה שונים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לסנן נוגדנים עצמיים בצורה מקבילה, יש צורך רק במיקרוליטרים של סרום, ויש צורך רק במיקרוגרם של אנטיגן.
כדי ליצור מיקרו-מערכי אנטיגן, התחל בדילול אנטיגנים ב-PBS לריכוז סופי של 2 מיליגרם למיליליטר. הגדר תצורת מיקרו-מערך עם תשעה פינים כדי להדפיס עד 162 אנטיגנים ייחודיים בשכפול. כלול אנטיגנים IgG ו-IgM בספריית האנטיגנים כבקרות חיוביות.
כלול PBS רק כבקרה שלילית. הוסף 20 מיקרוליטר מכל אנטיגן ללוחית מקור הבאר 384 בקבוצות המשקפות את הגדרת ראש ההדפסה. השתמש בנייר כסף כדי לכסות את לוחית המקור, והקפיא את הצלחת במינוס 80 מעלות צלזיוס, עד שתהיה מוכנה להדפסת מערכים.
נקה את סיכות המיקרו-מערך המוצקות על ידי דגירה באמבט סוניקציה עם מים נטולי יונים שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת. מניחים את הסיכות ברשת לייבוש. לאחר מכן סדר את הפינים בראש ההדפסה של מיקרו-מערך.
עבור תשעה פינים, השתמש בתצורה של שלושה על שלושה. לאחר מכן, תכנת את המיקרו-מערך להפעלת ההדפסה על ידי הגדרת מספר הפינים בראש ההדפסה, מספר השקופיות להדפסה, מספר הרפידות בכל שקופית ומספר נקודות השכפול עבור כל אנטיגן. בנוסף, תכנת את המיקרו-מערך לסוניקציה של הפינים במים בין קבוצות שונות של אנטיגנים.
לאחר מכן, לאחר הפשרת לוחית המקור, צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-100 פעמים G.הנח את לוחית המקור במקום המיועד במיקרו-מערך, ולאחר מכן הסר את קטע נייר הכסף המכסה את קבוצת האנטיגנים הראשונה שיש להדפיס. סדר את השקופיות הלא מודפסות על משטח המערך והפעל את תוכנית ההדפסה. הדפס שקופיות בטמפרטורת החדר כאשר הלחות מוגדרת על המערך בין 55 ל-60% לאחר שכל קבוצת אנטיגנים מודפסת על כל השקופיות, השהה את המיקרו-מערך.
כסו את האנטיגנים שזה עתה הודפסו בנייר כסף כדי למנוע אידוי, וחשפו את קבוצת האנטיגנים הבאה שתודפס. לאחר מכן, המשך בתוכנית ההדפסה. לאחר שכל האנטיגנים הודפסו, מכסים את לוחית המקור בחתיכת נייר כסף חדשה, ומקפיאים אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס.
הנח את השקופיות המודפסות בקופסת שקופיות ואטום אותה בוואקום. ניתן להשתמש בשקופיות למחרת, או עד חודש לאחר מכן. כדי לחקור מיקרו-מערכים עם סרום מדולל באמצעות תאי דגירה, הנח את השקופיות למסגרות.
לאחר מכן הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר חוסם לכל משטח מערך. הניחו את סרט הדבק מעל המסגרת והעבירו אותו לכלי אטום עם חתיכת רקמה רטובה. לאחר מכן, דגרו את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס על נדנדה למשך הלילה.
למחרת, יש לדלל את דגימות הסרום מ-1 עד 100 במאגר חוסם. לאחר מכן שאפו את תמיסת החסימה מהמערכים, והוסיפו 500 מיקרוליטר של דגימה מדוללת לכל משטח מערך. לאחר מכן, מכסים את המערכים בניילון דבק, ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס, עם נדנדה למשך שעה.
לאחר מכן, שאפו את דגימות הסרום מהמערכים, והשתמשו במאגר שטיפה כדי לשטוף את משטחי המערך ארבע פעמים על ידי שפיכת המאגר על המגלשות והסרתו במהירות. השתמש ב-700 מיקרוליטר של מאגר חוסם כדי לשטוף כל משטח מערך, ודגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל לכל משטח שקופית, והשתמש בסרט דבק כדי לכסות אותו.
דגרו את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה למשך 45 דקות. לאחר הדגירה, יש לשאוב את תערובת הנוגדנים המשנית מהשקופיות ולשטוף ארבע פעמים, כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם 700 מיקרוליטר של מאגר דילול חוסם, שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת.
הסר את השקופיות מהמסגרות, ולאחר מכן הנח אותן במתלה שקופיות מתכת וטבל אותן ב-PBS. דגירה בטמפרטורת החדר עם טלטול מסלולי למשך 20 דקות. הניחו מתלה שקופיות במיכל מים נטולי יונים למשך 15 שניות.
לאחר מכן הניחו את המתלה במיכל מים חדש, ודגרו למשך 15 שניות נוספות. כדי לייבש את השקופיות, הנח את מתלה השקופיות על מתאם צלחת ELISA בצנטריפוגה, וסובב ב-220 פעמים G וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הנח את השקופיות בקופסה אטומה עד שהן מוכנות לסריקה.
כדי לסרוק את השקופיות, השתמש בסורק מיקרו-מערך שיכול לזהות אותות פלואורסצנטיים SI 3 ו-SI 5. קבע את צינור המכפיל האופטימלי, או הגדרות PMT, על ידי סריקה מוקדמת של שקופית ספריית אנטיגנים מלאה שנבדקה רק עם נוגדנים משניים. הגדר את ערכי ה-PMT המשמשים על ידי לחיצה על כפתור החומרה כך שתכונות ה-IgG האנושיות בערוץ SI שלוש, ותכונות ה-IGM האנושיות בערוץ SI חמש, יהיו בעלות עוצמת פלואורסצנטיות חציונית דומה פחות רקע, או MFIB, שהיא בדרך כלל 40,000.
לאחר מכן, סרוק את השקופיות הניסיוניות בשני הערוצים על ידי לחיצה על כפתור הסריקה. שמור את תמונות השקופיות בשני הערוצים לאחר כל סריקה. באמצעות כפתור הקובץ, טען את השקופית לניתוח לתוכנת המיקרו-מערך.
לאחר מכן, השתמש בכפתור הקובץ כדי לטעון את רשימת מערך הגנים, או קובץ GAL, בעל הפריסה של המערך, עם הזהויות של תכונות המערך. מקם את תבנית המערך מעל התמונה הסרוקה, כך שתכונות המערכים יתאימו לתבנית ככל האפשר. יש ללחוץ על כפתור היישור כדי ליישר את התכונות בכל הבלוקים עם התבנית.
התוכנה עם חישוב MFI מינוס רקע עבור כל אחד מהאנטיגנים. לבסוף, השתמש בלחצן קובץ כדי לייצא את התוצאות כקובץ טקסט, ולנתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. באיור זה, המציג שקופיות בקרה חיוביות ושליליות, השקופית השלילית נבדקת רק עם נוגדנים משניים, ושקופית הבקרה החיובית נבדקת בסרום מחולה עם זאבת אדמנתית מערכתית.
כפי שצוין כאן, סרום הבקרה החיובי, עם תגובתיות ידועה ל-riboP, הוכח כבעל נוגדני IgM כנגד DNA חד-גדילי, ונוגדני IgG כנגד riboP. תגובות ליניאריות נצפו עם IgM על פני כל דילולי הסרום, ועם IgG עד לרקע MFI מינוס של כ-30,000. בניסוי זה, המערך נבדק עם סרום אנושי מחולה עם וסקוליטיס קריוגלובולינמית, עם גורם שגרוני מתועד, שהוא נוגדן IgM נגד IgG.
תכונת ה-IgG היא צהובה-ירוקה עקב קשירת ה-IgM בסרום של המטופל ל-IgG המשותק במערך. באמצעות נוגדנים משניים בלבד, לא נראית תגובתיות IgM כנגד IgG שזוהה במערך. מוצג כאן, IgM ו-IgG של עכברים שנצפו על המערך, זוהו רק עם נוגדנים משניים נגד עכברים ל-IgM ו-IgG בהתאמה.
איור זה מציג את היישור של רשת תבנית בתמונת מערך סרוקה, באמצעות תוכנת ניתוח מיקרו-מערך. לאחר היישור, ניתן לנתח את תכונות המערך כדי לקבל עוצמת פלואורסצנטיות חציונית פחות רקע עבור כל תכונה. לאחר השליטה, ניתן לבצע בדיקה של מיקרו-מערכי אנטיגן תוך ארבע שעות אם היא נעשית כראוי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון ELISA על מנת לאמת את התוצאות המתקבלות ממיקרו-מערכי האנטיגן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להדפיס מיקרו-מערכי אנטיגן, כיצד לחקור מיקרו-מערכי אנטיגן עם סרום, וכיצד לסרוק מיקרו-מערכי אנטיגן באמצעות סורק. אל תשכח שעבודה עם סרום אנושי עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות אוניברסליים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לייצור מיקרו-מערכי אנטיגנים הניתנים להתאמה אישית המאפשרים זיהוי בו זמנית של נוגדני IgG סרום ו-IgM אוטואימוניים מאדם ועכבר. הטכניקה מאפשרת זיהוי נוגדנים בעל תפוקה גבוהה וכמותי כנגד אנטיגנים או אפיטופים שונים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אוטואימוניות
- אימונולוגיה
- סינון בעל תפוקה גבוהה
רקע
- נוגדנים אוטואימוניים ממלאים תפקיד מכריע במחלות אוטואימוניות.
- זיהוי נוגדנים אוטואימוניים ספציפיים יכול להתאים למצבי מחלה שונים.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות מוגבלות בתפוקה וברגישות.
- שיטה זו מאפשרת ניתוח של מספר נוגדנים אוטואימוניים בו זמנית.
מטרת המחקר
- לפתח טכניקה לסינון מהיר של נוגדנים אוטואימוניים.
- לזהות מתאמים בין נוגדנים אוטואימוניים ומצבי מחלה.
- לשפר את היעילות של זיהוי נוגדנים באמצעות מערכי מיקרו.
שיטות ששימשו
- דילול אנטיגנים ב-PBS לריכוז של 2 מ"ג/מ"ל.
- הגדרת מערך מיקרו עם תשעה פינים להדפסת אנטיגנים.
- הכללת אנטיגני IgG ו-IgM כבדיקות בקרה חיוביות.
- סינון של נוגדנים אוטואימוניים באמצעות מיקרוליטרים בודדים של סרום.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של מערכי מיקרו של אנטיגנים לזיהוי נוגדנים אוטואימוניים.
- הדגמה של יכולות סינון בעל תפוקה גבוהה.
- הערכה כמותית של נוגדנים כנגד אנטיגנים שונים.
- פוטנציאל לזהות נוגדנים אוטואימוניים מרכזיים המקושרים למחלות אוטואימוניות.
מסקנות
- השיטה שפותחה משפרת את היכולת לסינון נוגדנים אוטואימוניים.
- היא מספקת פלטפורמה למחקר נוסף בתחום האוטואימוניות.
- טכניקה זו עשויה להוביל לכלי אבחון משופרים למחלות אוטואימוניות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables multiplexed detection of IgG and IgM autoantibodies using minimal sample volumes, supporting early-stage target validation in autoimmune disease research. By providing quantitative, parallel readouts of autoantibody reactivity, it enhances predictive confidence in biomarker discovery and reduces reliance on low-throughput ELISA workflows. The two-color detection system improves assay efficiency and data consistency for immunoprofiling applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by profiling autoantibody reactivity against multiple antigens in parallel.
- Operational Value: Reduces sample consumption to microliters of serum, preserving limited clinical specimens for downstream analysis.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through simultaneous detection of IgG and IgM isotypes, clarifying immune complex formation mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible microarray slides with duplicate antigen spots for reliable signal quantification.
- Operational Value: Facilitates assay scalability through robotic printing of up to 162 antigens per slide, enabling high-content screening campaigns.
- Scientific Value: Produces quantitative MFI minus background readouts that allow comparison of autoantibody titers across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables cross-species applicability with validated detection of both human and murine autoantibodies, supporting translational model consistency.
- Operational Value: Allows long-term storage of printed slides (up to one month), facilitating batch-to-batch assay reproducibility in preclinical studies.
- Scientific Value: Provides a platform for identifying autoantibody signatures linked to disease states, informing patient stratification strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering a reusable platform for immunoprofiling prior to functional assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid screening of autoantibody reactivity patterns associated with disease phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation and dual-isotype detection, ensuring consistent reagent performance.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts (MFI minus background) that enable statistical comparison of antigen-specific responses.
- Translational Research: Connects discovery-phase autoantibody profiling to preclinical validation through cross-reactive detection in human and mouse systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a customizable microarray platform where antigen libraries can be rapidly reconfigured for new target panels without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through multiplexed, parallel detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized printing, blocking, and washing steps that minimize technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early immunological risk assessment in autoimmune target programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on autoantibody prevalence and isotype distribution across sample cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray printing, serum handling, and fluorescence scanning instrumentation.
- Dependent on access to a robotic microarrayer with sonication capability and a dual-channel fluorescent scanner.
- Necessitates standardization of serum dilution, blocking buffer composition, and incubation conditions across users.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different antigen sources or species-specific secondary antibodies.
- Limited by the need for optimized PMT settings to balance IgG (SI three) and IgM (SI five) channel signals for accurate quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Dilution Antigens and Generating Antigen Microarrays
3:21
Probe Antigen Microarrays with Diluted Sera
6:02
Scanning Antigen Microarrays and Exporting Data
7:40
Results: Detection of IgG and IgM Autoantibodies using Two-color Microarrays
9:29
Conclusion
