דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

המטרה הכללית של טכניקה זו היא לסרוק במהירות נוגדנים עצמיים באופן מולטיפלקס. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי שאלות מפתח בתחום האוטו-אימוניות, כגון אילו נוגדנים עצמיים נמצאים במתאם עם מצבים מחלתיים שונים. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם כי ניתן לסרוק נוגדנים עצמיים באופן מקבילי, דרושים מיקרוליטרים בודדים של סרום, ודרושים מיקרוגרמים בודדים של אנטיגן.

כדי להפיק מיקרו-מערכים של אנטיגנים, התחילו בדילול האנטיגנים ב-PBS עד לריכוז סופי של 2 mg/mL. הגדירו תצורת micro arrayer עם תשעה פינים להדפסת עד 162 אנטיגנים ייחודיים בכפולות. כללו אנטיגנים של IgG ו-IgM בספריית האנטיגנים כביקורות חיוביות.

הוסיפו PBS בלבד כביקורת שלילית. הוסיפו 20 µL מכל אנטיגן ללוחית המקור בעלת 384 בארות, בקבוצות המשקפות את סידור ראש ההדפסה. כסו את לוחית המקור בנייר אלומיניום, והקפיאו את הלוחית בטמפרטורה של 80- °C, עד למועד הדפסת המערכים.

נקה את פיני מערך המיקרו (microarray) המוצקים על ידי דגירה בבן אבט פולסוני (sonicating bath) עם מים דה-יוניים שלוש פעמים למשך דקה אחת בכל פעם. הנח את הפינים במעמד לייבוש. לאחר מכן, סדר את הפינים בראש ההדפסה של מערך המיקרו.

עבור תשעה פינים, השתמשו בתצורה של שלוש על שלוש. לאחר מכן, תכנתו את מכשיר המיקרו-מערך (microarrayer) להרצת ההדפסה על ידי הגדרת מספר הפינים בראש ההדפסה, מספר השקופיות להדפסה, מספר הפדים בכל שקופית ומספר נקודות השכפול עבור כל אנטיגן. בנוסף, תכנתו את המיקרו-מערך לבצע סוניקציה לפינים במים בין קבוצות שונות של אנטיגנים.

לאחר מכן, לאחר הפשרת פלטת המקור, סובבו אותה בצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 100 ×g. מקמו את פלטת המקור בנקודה המיועדת במכשיר המיקרו-מערך (microarrayer), ולאחר מכן הסירו את חלק הרדיף המכסה את קבוצת האנטיגנים הראשונה להדפסה. סדרו את השקופיות שלא נדפסו על פני השטח של מכשיר המערך והפעילו את תוכנית ההדפסה. הדפיסו את השקופיות בטמפרטורת החדר, כאשר הלחות במכשיר המערך מוגדרת ל-55% עד 60%. לאחר הדפסת כל קבוצת אנטיגנים על כל השקופיות, הפסיקו זמנית את פעולת מכשיר המיקרו-מערך.

כסו את האנטיגנים שזה עתה הודפסו בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי, וחשפו את קבוצת האנטיגנים הבאה להדפסה. לאחר מכן, המשיכו בתוכנית ההדפסה. לאחר שכל האנטיגנים הודפסו, כסו את פלטת המקור ביריעת נייר אלומיניום חדשה, והקפיאו אותה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

הניחו את השקופיות המודפסות בקופסת שקופיות, ואטמו אותה בוואקום. ניתן להשתמש בשקופיות למחרת, או עד חודש לאחר מכן. כדי לבחון מערכי מיקרו-מערכים (microarrays) עם סרומים מהוללים באמצעות תאי דגירה, הניחו את השקופיות לתוך מסגרות.

לאחר מכן, הוסיפו 700 microliters של תמיפת חסימה (blocking buffer) לכל משטח מערך. הניחו את סרט ההדבקה מעל המסגרת והעבירו אותה למכל אטום עם פיסת טישיו רטובה. לאחר מכן, הדגירו את השקופיות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius על רוקר (rocker) למשך לילה.

ביום למחרת, דללו את דגימות הסרום ביחס של 1:100 בתמיסת חסימה (blocking buffer). לאחר מכן, שאבו את תמיסת החסימה מהמערכים, והוסיפו 500 µL של דגימה מדוללת למשטח של כל מערך. לאחר מכן, כסו את המערכים בסרט דביק, והדגירו בטמפרטורה של 4 °C, תוך써 ניעור (rocking) למשך שעה אחת.

לאחר מכן, שאבו את דגימות הסרום מהמערכים, והשתמשו בתמיסת שטיפה כדי לשטוף את פני השטח של המערך ארבע פעמים על ידי שפיכת התמיסה על השקופיות והסרה מהירה שלה בנקישה. השתמשו ב-700 µL של תמיסת חסימה כדי לשטוף כל פני שטח של מערך, והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך써 נעירה. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של נוגדן משני מדולל לפני השטח של כל שקופית, וכסו אותה באמצעות סרט דבק.

דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C עם ניעור (rocking) למשך 45 דקות. לאחר הדגירה, שאבו את תערובת הנוגדן המשני מהשקופיות ושטפו ארבע פעמים, כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם 700 µL של תמיסת חסימה (blocking dilution buffer), שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם.

הוציאו את השקופיות מהמסגרות, לאחר מכן הניחו אותן במעמד מתכתי לשקופיות והטביעו אותן ב-PBS. דגרו בטמפרטורת החדר עם ניעור מסלולי למשך 20 דקות. הניחו מעמד לשקופיות בתוך מיכל עם מים דה-יונזים למשך 15 שניות.

לאחר מכן, העבירו את המתקן למכל מים חדש והדגירו למשך 15 שניות נוספות. לייבוש השקופיות, הניחו את מתקן השקופיות על מתאם ללוח ELISA בתוך הצנטריפוגה, וסובבו במהירות של 220 ×g ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הניחו את השקופיות בקופסה אטומה לאור עד למועד הסריקה.

לסריקת השקופיות, השתמשו בסורק מיקרו-מערך (microarray scanner) המסוגל לזהות אותות פלואורסצנטיים של SI three ו-SI five. קבעו את מכפיל הצינור האופטימלי, או את הגדרות ה-PMT, על ידי סריקה מקדימה של שקופית ספריית אנטיגנים מלאה שסומנה באמצעות נוגדנים משניים בלבד. הגדירו את ערכי ה-PMT על ידי לחיצה על כפתור החומרה, כך שמאפייני ה-IgG האנושי בערוץ SI three, ומאפייני ה-IGM האנושי בערוץ SI five, יציגו עוצמת פלואורסצנציה חציונית פחות רקע (MFIB) דומה, שהיא בדרך כלל 40,000.

בשלב הבא, סרקו את השקופיות הניסיוניות בשני הערוצים על ידי לחיצה על כפתור הסריקה. שמרו את תמונות השקופיות בשני הערוצים לאחר כל סריקה. באמצעות כפתור הקובץ, טענו לתוכנת המערך הזעיר (microarray) את השקופית המיועדת לניתוח.

לאחר מכן, השתמשו בכפתור הקובץ כדי לטעון את רשימת מערך הגנים, או קובץ GAL, המכיל את פריסת המערך ואת זהויות המאפיינים שלו. הניחו את תבנית המערך על גבי התמונה שנסרקה, כך שמאפייני המערך יתאימו לתבנית בצורה המדויקת ביותר. לחצו על כפתור היישור כדי ליישם את המאפיינים בכל הבלוקים בהתאם לתבנית.

התוכנה תחשב לאחר מכן MFI פחות רקע עבור כל אחד מהאנטיגנים. לבסוף, השתמשו בכפתור הקובץ כדי לייצא את התוצאות כקובץ טקסט, והנתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. בדמות זו, המציגה שקופיות של בקרות חיוביות ושליליות, השקופייה השלילית עובדה עם נוגדנים משניים בלבד, ושקופיית הבקרה החיובית עובדה עם סרום מחולה עם לופוס אריתמטוזי סיסטמי.

כפי שצוין כאן, סרום הבקרה החיובית, בעל תגובתיות ידועה ל-riboP, מראה נוגדני IgM נגד DNA גביש-לינארי (single-stranded DNA) ונוגדני IgG נגד riboP. תגובות ליניאריות נצפו עם IgM בכל דילול הסרום, ועם IgG עד ל-MFI פחות רקע של כ-30,000. בניסוי זה, המערך נבדק באמצעות סרום אנושי ממטופל עם וסקוליטיס קריוגלובולינמית, עם גורם שגשוגית (rheumatoid factor) מתועד, שהוא נוגדן IgM נגד IgG.

מאפיין ה-IgG הוא בצבע צהוב-ירוק עקב קישור של IgM בסרום של המטופל ל-IgG המקובע על המערך. בשימוש בנוגדנים משניים בלבד, לא נצפית תגובתיות של IgM כנגד IgG המנקוד על המערך. כפי שמוצג כאן, IgM ו-IgG של עכבר המנקודים על המערך, מזוהים רק באמצעות נוגדנים משניים נגד עכבר ל-IgM ו-IgG, בהתאמה.

איור זה מראה את היישור של רשת תבנית על תמונה סרוקה של מערך, באמצעות תוכנה לניתוח מערכי מיקרו (microarray). לאחר היישור, ניתן לנתח את מאפייני המערך כדי לקבל את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית פחות הרקע עבור כל מאפיין. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את בדיקת מערכי מיקרו של אנטיגנים תוך ארבע שעות, במידה והדבר נעשה כה properly.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון ELISA על מנת לתקף את התוצאות שהתקבלו ממערכי המיקרו-מערכים של האנטיגנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההדפסה של מיקרו-מערכי אנטיגנים, אופן סריקת מיקרו-מערכי אנטיגנים באמצעות סרום, ואופן הסריקה של מיקרו-מערכי אנטיגנים באמצעות סורק. זכרו כי עבודה עם סרום אנושי עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט אמצעי זהירות אוניברסליים בעת ביצוע פרוצדורה זו.