השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

המטרה הכוללת של ניתוח סקטורים סומטיים מושריים (Induced Somatic Sector Analysis) היא לספק טכניקה בעלת תפוקה בינונית עד גבוהה לאפיון פונקציונלי של מבני גנים ופרומוטורים ברקמת הגבעול המשנית של עצים בפרקי זמן קצרים יחסית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע למקום ולזמן שבהם הגנים באים לידי ביטוי, וכן לתפקידם בתהליכים בעלי חשיבות ביולוגית כגון יצירת עץ והתפתחות גבעול משנית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמדובר בהליך יעיל, פשוט ומהיר יחסית, שניתן להחילוו על מגוון רחב של מיני עצים.

כדי להתחיל, הכינו מבחנה נקייה עם פקק הברגה בנפח 50 milliliter עם 19 milliliters של מצע LB טרי בטמפרטורה של 28 degree Celsius עם האנטיביוטיקות המתאימות לברירה בקטריאלית. הוסיפו מיליליטר אחד של תרבית A.tumefaciens ובדקו את הצפיפות האופטית, או OD, באורך גל של 600 nanometres. אם ה-OD גבוה מ-0.1, דללו עוד יותר באמצעות LB חם. הניחו את תרבית ה-A.tumefaciens באינקובטור עם ניעור עד שה-OD 600 יהיה בין 0.4 ל-0.6.

ברגע שהדבר הושג, סבב את התאים בצנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס וב-1,000 x g. שפוך את הנוזל מהמבחנה והשהה מיד את משקע התאים במיליליטר אחד של מצע MS מקורר. העבר את התו suspension למיקרוטוב נקי של שני מיליליטרים ושמור על קרח עד לשימוש.

התחילו את הניסוי במהלך האביב או תחילת הקיץ ובחרו צמחים עם קמביום פעיל הגדל במהירות. ניתן לוודא זאת אם ניתן לקלף בקלות את הפלואם מהקסילמה. זהו מקטע ישר של הגבעול סמוך לבסיס הצמח והסירו עלים או ענפים כלשהם.

באמצעות סכין מנתחים חדה, צרו חלון קמביום בגודל סנטימטר רבוע אחד על ידי ביצוע שני חתכים מקבילים באורך 20 מילימטר דרך הפלואם במרחק של חמישה מילימטרים זה מזה, ולאחר מכן חתך אופקי יחיד שחוצה את שני החתכים האנכיים בקצה הבסיסי. קלפו את רצועת הפלואם כלפי מעלה כדי לחשוף את רקמת הקסילם המתרחשת. לאחר מכן, באמצעות פיפטה, הוסיפו כמות מספקת של תוצר ההחדרה כדי להרטיב לחלוטין את פני השטח של הקסילם החשוף.

החזירו מיד את רצועת הפלואם אל הגבעול וקשרו אותה במקומה היטב באמצעות parafilm. חזרו על שלבי ההחדרה אלו עבור כל הגנים או הפרומוטורים הרלוונטיים, תוך יצירת חלונות קמביום חדשים במרחק של סנטימטר אחד לפחות מעל או מתחת לחלונות קיימים ובסטייה של 90 מעלות. בנוסף, החדירו לחלונות את וקטורי הביקורת החיובית והשלילית באותו הגבעול או גבעולים, בדומה להחדרות הניסיוניות.

יש לנטר את צמיחת הגבעול באופן תקופתי, וברגע שנצפה גדילה רדיאלית של חמישה מילימטרים לפחות, יש לקצור את הרקמה לצורך בדיקת beta-glucuronidase, או GUS assay. כדי לקצור את חומר הבדיקה, יש להוציא תחילה את חלון הקמביום מהגבעול ולהסיר כל רקמה שאינה חלק מהצמיחה החדשה. למחקרים הנוגעים למורפולוגיה של תאי או רקמות xylem ו-phloem בוגרים, יש לקלף את ה-phloem מה-xylem.

לחלופין, עבור מחקרים הדורשים שמירה על שלמות אזור הקמביום, או הערכה של דפוסי ביטוי של פרומוטור, חתכו את חלון הקמביום באופן רוחבי באמצעות להב תער כדי ליצור דיסקיות בעובי של בין 0.5 ל-1 מילימטר. העבירו את רקמות חלון הקמביום שנאספו למבחנות נפרדות בעלות תחתית עגולה בנפח 14 מיליליטר, ושטפו פעמיים בבופר פוספט 0.1 מולרי ב-pH 7 למשך חמש דקות בכל פעם, תוך הבטחה שהרקמה שקועה לחלוטין. בסוף השטיפה השנייה, הקפידו להסיר את כל עודפי התמיסה.

בשלב הבא, הוסיפו חמישה milliliters של ריאגנט GUS לכל מבחנה. אם הדבר אינו מכסה לחלוטין את דגימת הרקמה, הוסיפו ריאגנט נוסף. דגרו את המבחנות למשך עשר דקות בטמפרטורה של 55 °C בחושך.

לאחר מכן, דגרו את המבחנות למשך 12 עד 16 שעות נוספות על שייקר בטמפרטורה של 37 °C בחשיכה תוך ערבוב עדין. עם הוצאתם מהאינקובטור, קחו תת-קבוצה אקראית של המבחנות ובדקו את ה-pH של ריאגנט ה-GUS באמצעות נייר לิตמוס בטווח pH של 0 עד 7. אם באחת מהן ה-pH נמוך מ-6, סמנו אותה ובדקו את שאר המבחנות.

סמנו והוציאו את כל המבחנות שבהן ה-pH נמוך משש. שפכו את ריאגנט ה-GUS מהמבחנות והחליפו אותו בכמות מספקת של ethanol 70% כדי לכסות את הרקמה. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C עד למועד השימוש.

בעזרת זוג פינצטות נקיות, הוצאו את כל רקמת חלון הקמביום ממשפור הדגימה והניחו אותה על מגש קטן או צלחת פטרי לצורך תצפית מיקרוסקופית. הניחו את הדגימה תחת העדשה של מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה שבין 1X ל-4X, זהו וספרו את מספר התאים או הרקמות המציגים צביעה כחולה בהירה. במקרים שבהם הפלואמה הוסרה, ספרו את מספר הסקטורים ברקמת הקמביום שנמצאים על פני השטח של הקסילום המתפתח.

עבור דגימות שנחתכו לדיסקיות, ספרו את מספר הסקטורים שנמצאו בסוגי התאים או הרקמות השונים. ודאו ששני צדדיו של הדיסק נבדקו, וכי סקטורים המופיעים על פני שתי דיסקיות תואמו כדי להבטיח שהמספרים לא יוערכו ביתר. החזירו למבחנה המכילה 70% אתנול רק את הרקמה המכילה סקטורים, ואחסנו אותה עד הצורך.

חזור על הניתוח עבור כל חלונות קמביום נוספים שנאספו, כולל הביקורות החיוביות והשליליות. כדי לסייע בזיהוי מדויק ובסיווג של המגזרים, אנו ממליצים להכיר את האנטומיה וההתפתחות של הגבעול המשני, כולל תגובות הגבעול לפציעה. איור זה מציג מספר טרנספורמציות מוצלחות, הנראות כאן כאזורים בעלי צביעה כחולה.

חלון דוגמה של קילוף פלואם מציג מספר מגזרים שעברו טרנספורמציה, ודיסקים שנאספו משני מיני עצים מראים מגזרי טרנספורמציה וצמיחה רדיאלית עוקבת. ניתן להבחין בטרנספורמציה במגוון סוגי רקמות. כאן ניתן לראות מגזרי גבעול בפרידרם, בפלואם, בפארנכימה של פצע ובמספר אזורי רקמה אחרים של ערבה לבנה.

תמונה זו מציגה את תוצאות הביטוי של מקדמי גנים בנגזרות הקמביום. בדוגמה זו, אנו רואים את פרופורציית הצביעה בכל סוג רקמה בניסוי שכלל מגוון של מקדמי CesA מ-eucalyptus grandis שהוכנסו לגבעולים של היברידים של אקליפטוס. הביטוי בפלואם, ובקסילום בהתפתחות ובקסילום מפותח, מוצג כאחוזים.

ניתן לחשב עבור כל פרומוטור או גן רצוי גם את מספר אירועי הטרנספורמציה הממוצע לכל סנטימטר של קמביום שהוחדר. טבלה זו מציגה נתונים עבור סקטורים טיפוסיים שזוהו בדגימות של איקליפט וערבה שטרנספורמו אותן עם ביקורת חיובית או פרומוטור רצוי, אשר נותחו באמצעות שיטת קצירת הדיסקיות. לאחר השליטה בטכניקה זו, היא יכולה לספק שיטה מהירה, יעילה ובעלת יישום רחב לניתוח טבעה המורכב של הדיפרנציאציה הקמביאלית עם היווצרות בפיתוח גבעול משני.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת הצמחים והחיידקים, כיצד לבצע טרנספורמציה, לגדל ולקצור גבעולים, וכן כיצד לזהות ולסווג רקמה טרנסגנית לצורך הערכה פנוטיפית.