השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

המטרה הכוללת של ניתוח מגזר סומטי מושרה היא לספק טכניקת תפוקה בינונית עד גבוהה לאפיון פונקציונלי של מבני גנים ומקדם ברקמת גזע משנית של עץ במסגרות זמן קצרות יחסית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי היכן ומתי באה לידי ביטוי סכנה, כמו גם תפקידם בתהליכים חשובים מבחינה ביולוגית כגון היווצרות עץ והתפתחות גזע משני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא יעילה, קלה ומהירה יחסית המתאימה למגוון רחב של מיני עצים.

כדי להתחיל, הכינו צינור מכסה בורג נקי של 50 מיליליטר עם 19 מיליליטר של מדיום LB טרי של 28 מעלות צלזיוס עם האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת חיידקים. הוסף מיליליטר אחד של תרבית A.tumefaciens ובדוק את הצפיפות האופטית, או OD, ב-600 ננומטר. אם ה-OD הוא מעל 0.1, יש לדלל עוד יותר עם LB חם. הנח את תרבית A.tumefaciens בחממה רועדת עד שה-OD 600 יהיה בין 0.4 ל-0.6.

לאחר השגת זה, צנטריפוגה של התאים למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ו-1,000 x גרם. העבירו את המתלה למיקרו-צינור נקי של שני מיליליטר ואחסנו על קרח עד הצורך.

התחל את הניסוי במהלך האביב או תחילת הקיץ ובחר צמחים עם קמביום פעיל וגדל במהירות. זה מאושר אם ניתן לקלף את הפלום בקלות מהקסילם. זהה קטע ישר של גבעול ליד בסיס הצמח והסר את כל העלים או הענפים.

בעזרת אזמל חד, חותכים חלון קמביאלי של סנטימטר מרובע אחד על ידי יצירת שני חתכים מקבילים של 20 מילימטר דרך הפלום במרחק של חמישה מילימטרים זה מזה ואז חתך אופקי יחיד החוצה את שני החתכים האנכיים בקצה הבסיסי. לרפא את רצועת הפלום כלפי מעלה ולחשוף את רקמת הקסילם המתפתחת. ואז, בעזרת פיפטה, הוסף אמצעי חיסון מספיק כדי להרטיב לחלוטין את פני הקסילם החשוף.

מיד, הכנס מחדש את רצועת הפלום לגבעול וקשר אותה למקומה בחוזקה בעזרת פרפילם. חזור על שלבי החיסון הללו עבור כל הגנים או המקדמים המעניינים וצור חלונות קמביאלים חדשים לפחות סנטימטר אחד מעל או מתחת לחלונות קיימים ובהיסט של 90 מעלות. בנוסף, חסנו חלונות עם וקטורי הבקרה החיוביים והשליליים על אותו גבעול או גבעולים, כפי שמחסנים הניסוי.

עקוב אחר צמיחת הגזע מעת לעת ולאחר שנצפתה צמיחה רדיאלית של לפחות חמישה מילימטרים, קצור את הרקמה עבור בטא-גלוקורונידאז, או בדיקת GU. כדי לקצור את חומר הבדיקה, ראשית כרתו את חלון הקמביאלי מהגבעול והסירו כל רקמה שאינה חלק מגידול חדש. למחקרים הקשורים למורפולוגיה של קסילם ותאי פלום בוגרים או רקמות, קלף את הפלום מהקסילם.

לחלופין, עבור חקירות הדורשות שהאזור הקמביאלי יישאר שלם, או שיש להעריך את דפוסי הביטוי של המקדם, חתכו את חלון הקמביאלי לרוחב באמצעות סכין גילוח כדי ליצור דיסקים בעובי של בין 0.5 למילימטר אחד. הנח את רקמות החלון הקמביאליות שנקטפו בצינורות תחתונים עגולים בודדים של 14 מיליליטר ושטוף פעמיים במאגר פוספט מולרי של 0.1 ב-pH 7 למשך חמש דקות בכל פעם כדי להבטיח שהרקמה שקועה לחלוטין. בתום השטיפה השנייה, הקפידו להסיר את כל התמיסה העודפת.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מגיב GUS לכל צינור. אם זה לא מכסה לחלוטין את דגימת הרקמה, הוסף מגיב נוסף. דגרו על הצינורות במשך עשר דקות בחום של 55 מעלות צלזיוס בחושך.

לאחר מכן, דגרו את הצינורות למשך 12 עד 16 שעות נוספות על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך באמצעות תסיסה עדינה. עם הוצאתו מהאינקובטור, קח תת-קבוצה אקראית של הצינורות ובדוק את ה-pH של מגיב ה-GUS באמצעות נייר לקמוס עם טווח pH של אפס עד שבע. אם לאחד מהם יש pH נמוך משש, סמן אותם ובדוק את שאר הצינורות.

סמן ולא לכלול צינורות עם pH נמוך מ-6. הסירו את מגיב ה-GUS מהצינורות והחליפו אותו בכמות מספקת של 70 אחוז אתנול כדי לכסות את הרקמה. אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך.

בעזרת זוג מלקחיים נקיים, הסר את כל רקמת החלון הקמביאלית מצינור הדגימה והנח אותה על מגש קטן או צלחת פטרי להדמיה מיקרוסקופית. הנח את הדגימה מתחת לעדשה של מיקרוסקופ מנתח בין הגדלה של 1X ל-4X וזהה וספר את מספר התאים או הרקמות המציגים כתמים כחולים בהירים. בדוגמאות שבהן הוסר הפלום, ספרו את מספר הסקטורים ברקמת הקמביאלית שנמצאו על פני הקסילם המתפתח.

עבור דגימות שנחתכו לדיסקים, ספרו את מספר הסקטורים שנמצאים בסוגי התאים או הרקמות השונים. ודא ששני צידי הדיסק מוצגים ושסקטורים המתרחשים בשני דיסקים מותאמים כדי להבטיח שהמספרים אינם מוערכים יתר על המידה. הכניסו רק את הסקטורים המכילים רקמות לתוך הצינור המכיל 70 אחוז אתנול ואחסנו עד לצורך.

חזור על הניתוח עבור כל חלונות קמביאלים נוספים שנקטפו, כולל הבקרות החיוביות והשליליות. כדי לסייע בזיהוי מדויק בסיווג המגזרים, אנו מציעים לך להכיר את האנטומיה וההתפתחות המשנית של הגזע כולל תגובות גזע לפציעה. האיור הזה מראה כמה טרנספורמציות מוצלחות שנראות כאן כאזורים של צביעה כחולה.

חלון קליפת פלום לדוגמה מציג מספר מגזרים ודיסקים שעברו טרנספורמציה שנקטפו משני מיני עצים מציגים מגזרי טרנספורמציה וצמיחה רדיאלית לאחר מכן. ניתן להבחין גם בטרנספורמציה במגוון סוגי רקמות. כאן ניתן לראות קטעי גזע בפרידרם, בפלום, בפרנכימת הפצע ובכמה אזורי רקמה אחרים של צפצפה לבנה.

תמונה זו מציגה את התוצאות של ביטוי מקדם גנים בנגזרות קמביאליות. בדוגמה זו, אנו רואים את שיעור הצביעה בכל סוג רקמה בניסוי הכולל מגוון של מקדמי CesA מאקליפטוס גרנדיס שהפכו לגבעולים של כלאיים אקליפטוס. ביטוי בפלום, קסילמים מתפתחים ומפותחים מיוצג באחוזים.

ניתן לחשב גם את המספר הממוצע של אירועי טרנספורמציה לסנטימטר של קמביום מחוסן עבור כל מקדם או גן מעניין. טבלה זו מציגה את הנתונים עבור מגזרים טיפוסיים שזוהו בנבדקי אקליפטוס וצפצפה שעברו טרנספורמציה עם בקרה חיובית או מקדם עניין שנותח בשיטת קצירת הדיסק. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לספק שיטה מהירה, יעילה וישימה לניתוח האופי המורכב של התמיינות קמביאלית עם היווצרות בהתפתחות גזע משנית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין צמחים וחיידקים, כיצד לשנות, לגדל ולקצור גבעולים וכן כיצד לזהות ולסווג רקמה טרנסגנית להערכה פנוטיפית.