Name: זיהום הניסיון עם חיידקי ליסטריה כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למדו לזהות עכברי C57BL/6J בחיידק Listeria monocytogenes למדידת תגובות אינטרפרון-γ ושרידות. פרוטוקול זה מאפשר סינון של סוכנים וגנים המשפיעים על תגובות החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פיתוח פרוטוקול זה נתמך על ידי מענק תפעולי מ-CIHR (MOP97807) ל-SED.

<ol><li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).</li>
<li>Ranson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+V+alpha+14%2B+NKT+cells+participate+in+the+early+response+to+enteric+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).</li>
<li>Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+immunity%3A+a+T-cell-independent+pathway+of+macrophage+activation%2C+defined+in+the+scid+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse.</a> Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).</li>
<li>Soudja, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory-T-cell-derived+interferon-gamma+instructs+potent+innate+cell+activation+for+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity.</a> Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).</li>
<li>Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interferon-gamma+during+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses.</a> Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+IL-12%2F23-+and+IFN-gamma-mediated+immunity%3A+molecular%2C+cellular%2C+and+clinical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features.</a> Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).</li>
<li>Flynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Cooper, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+tuberculosis+in+interferon+gamma+gene-disrupted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice.</a> J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).</li>
<li>Dalton, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+of+immune+cell+function+in+mice+with+disrupted+interferon-gamma+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes.</a> Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).</li>
<li>Harty, J. T., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immunity+to+Listeria+monocytogenes+in+the+absence+of+IFN+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma.</a> Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+in+mice+that+lack+the+interferon-gamma+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor.</a> Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).</li>
<li>Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+effector+cells+default+to+the+Th2+pathway+in+interferon+gamma-deficient+mice+infected+with+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major.</a> J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).</li>
<li>Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+aroA-+infection+in+gene-targeted+immunodeficient+mice%3A+major+role+of+CD4%2B+TCR-alpha+beta+cells+and+IFN-gamma+in+bacterial+clearance+independent+of+intracellular+location%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location.</a> J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).</li>
<li>Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+IFN+gamma+in+protection+against+tumor+development+and+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).</li>
<li>Hodge, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+AU-rich+element+removal+promotes+chronic+IFN-gamma+expression+and+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice.</a> J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).</li>
<li>Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+autoantibodies+and+lupus+nephritis+in+transgenic+mice+expressing+interferon+gamma+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis.</a> J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).</li>
<li>Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+interferon-gamma+and+interleukin-4+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus.</a> J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).</li>
<li>Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+affects+homing+of+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells.</a> J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).</li>
<li>Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Use+of+Interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical Use of Interferon-gamma.</a> Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).</li>
<li>Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gammadelta+T+cells+in+alpha-galactosylceramide-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity.</a> J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).</li>
<li>Leonard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+single-dose+interleukin-12+exposure+on+interleukin-12-associated+toxicity+and+interferon-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production.</a> Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).</li>
<li>Zenewicz, L. A., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%3A+a+short+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview.</a> Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).</li>
<li>Viegas, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+production+by+CD27%28%2B%29+NK+cells+exacerbates+Listeria+monocytogenes+infection+in+mice+by+inhibiting+granulocyte+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization.</a> Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).</li>
<li>Selvanantham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod1+and+Nod2+enhance+TLR-mediated+invariant+NKT+cell+activation+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection.</a> J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+9B.2+Listeria+monocytogenes%3A+cultivation+and+laboratory+maintenance%2C+Chapter+31B%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2013).</li>
<li>Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+animals+for+research--issues+to+consider+for+rodents+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits.</a> ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Obernier, J. A., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+an+appropriate+period+of+acclimatization+following+transportation+of+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals.</a> ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).</li>
<li>BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf">http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf</a> (2007).</li>
<li>Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com/tutorials">http://www.flowjo.com/tutorials</a> (2016).</li>
<li>Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonizing+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+activity+enhances+Th1+immunity+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice.</a> J. Immunol. , (2015).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Amer+Stat+Assoc%22%5BJournal%5D)">Nonparametric estimation from incomplete observations.</a> J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Brown, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+CD28-mediated+signals+in+T+helper+subset+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation.</a> J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+difference+in+anti-Listeria+resistance+of+C57BL%2F6+and+A%2FJ+mice+is+not+eliminated+by+active+immunization+or+by+transfer+of+Listeria-immune+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells.</a> Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%2C++Chapter+19%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li>
<li>Mekada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+among+C57BL%2F6+substrains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Genetic differences among C57BL/6 substrains.</a> Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).</li>
<li>Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+transmission+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+via+ingestion+of+contaminated+food%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food.</a> J Vis Exp. (75), e50381(2013).</li>
<li>Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+in+E-cadherin+responsible+for+host+specificity+towards+the+human+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes.</a> Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).</li>
<li>Wollert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129 (5), 891-902 (2007).</li>
<li>Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+Listeria+monocytogenes+to+CD8%2B+T+cells+requires+secretion+of+hemolysin+and+intracellular+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth.</a> J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).</li>
<li>Muraille, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dendritic+cell+activation+by+live+versus+killed+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes.</a> Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).</li>
<li>Datta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+Listeria+induces+protective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity.</a> Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).</li>
<li>Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+of+direct+ex+vivo+epitope+mapping+identifies+dominant+and+subdominant+CD4+and+CD8+T+cell+epitopes+from+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Listeria+monocytogenes+as+a+live+vaccine+vehicle+for+the+induction+of+protective+anti-viral+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).</li>
<li>Foulds, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+CD4+and+CD8+T+cells+are+intrinsically+different+in+their+proliferative+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses.</a> J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

כאן אנו מתארים פרוטוקול כיצד לבצע זיהום ניסיוני בסיסי בזן EGD של L. monocytogenes25 בעכברי C57BL/6J זכרים או נקבות. פרוטוקול זה הוקם במטרה לחקור את ההשפעה של מולקולה קטנה חדשה IS001 על ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים מולדים ואדפטיביים in vivo31. על ידי ניטור פינוי חיידקים והישרדות לאחר הדבקה, הושגו תובנות לגבי האופן שבו שינויים אלה ב-IFN-γ השפיעו על יכולתו של המארח לשלוט בזיהום.
שיקולים קריטיים בפרוטוקול
שיקול חשוב בתכנון מחקר מסו...

IFN-γ הוא ציטוקין כי הוא חיוני בתיווך חסינות מפני פתוגנים תאיים לבקרת צמיחת גידול 5. חשיבותה של ציטוקינים זה עמיד החיידקים באה לידי ביטוי העובדה שבני האדם עם מוטציות מסלול איתות IFN-γ הן רגישות מאוד לזיהום עם mycobacteria ו salmonellae 6. בדומה לכך, עכברים שחסרים לו או IFN-γ או פגמי IFN-γ קולטן התערוכה העמיד mycobacteria 7-9 ופתוגנים תאיים אחרים לרבות ל חיידקי 10,11, שושנת יריחו מרכזי 12, סלמונלה typhimurium 13, וכן וירוסים מסוימים 11. בנוסף פתוגנים ללחום, IFN-γ ממלא תפקיד מכריע מארח הגנה מפני גידולים 14. למרות ייצור גבוה יותר של-γ IFN מועיל בהקשר של זיהום או סרטן, ייצור ממושך של ציטוקינים זה נקשר to להתפתחות אוטואימיוניות מערכתית 15-17 והאצת סוכרת מהסוג במודל העכבר הסוכר ללא השמנת היתר 18. המקורות העיקריים של-γ IFN כוללים תאי NK, תאי NKT, γδ בתאי T, 1 T מסייעים (Th1) תאים, לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTL) 5,19,20. IFN-γ משפר הוא חסינות מולד אדפטיבית ידי: (1) עד ויסות histocompatibility הגדולה מורכב (MHC) אני בכיתה ו- II ביטוי, (2) להגדיל את הביטוי של מולקולות שיתוף גירוי על תאי מציגי אנטיגן, (3) מקרופאג שיפור phagocytosis ואת הייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים הגורמים microbicidal (למשל, תחמוצת החנקן מינים חמצן תגובתי), (4) לקדם את התמיינות של תאים מסוג CD4 + T נאיבי לתוך תאים מפעיל Th1, (5) קידום מיתוג בכיתה נוגדנים אימונוגלובולינים ( איג) 2a ו IgG3 (עכבר), (6) גרימת לייצור כמוקינים לגייס תאים חיסוניים לאתרים של infection, ו (7) שיפור תא NK ותגובות CTL 5,19. לאור החשיבות החיונית של γ IFN בתגובת מארח לפתוגנים וגידולים, IFN-γ רקומביננטי נבדק כטיפול זיהומים ומחלות ממאירות שונות (הנסקרת ב 19). עם זאת, כי ממשל מערכתי של IFN-γ או ציטוקינים קידום Th1 interleukin-12 (IL-12) קשור תופעות לוואי ומנה הקשורות רעיל 19,21, יש עניין בפיתוח אסטרטגיות חלופיות כדי להגביר את ייצור IFN-γ על ידי תאי מערכת החיסון. פיתוח התרופות ביולוגי חדשות ומולקולות קטנות דורש כלי הקרנת vivo כדי לבדוק אם סוכנים כאלה להגדיל את ייצור IFN-γ במהלך תגובה חיסונית והאם זה מיתרגם השפעות ביולוגיות משמעותיות, כגון העלאות הישרדות בעלי חיים. זיהום ניסיוני של עכברים עם חיידקי L. חיידק גראם חיובי כבר מודל אינסטרומנטליפענוח את התפקיד של γ IFN ב-חסינות מארח נגד פתוגנים תאיים 1,22. זיהום של עכברים עם הפתוגן לוריד או intraperitoneally (IP) מוביל בהפצה המהירה של החיידקים אל הטחול והכבד, שם הם הופכים הפנימו ידי מאקרופאגים hepatocytes תושב עם המון חיידקי שיא בטחול המתרחשים בין 3 ל -4 ימים שלאחר זיהום 1,3,22. ייצור-γ IFN ידי תאי NK חשוב ההפעלה מקרופאג והתנגדות מוקדם כנגד הפתוגן 3; עם זאת במינונים גבוהים זיהומיות, הפקה-γ IFN יכולה גם להזיק אישור הפתוגן 23. תאים NKT הם גם מקור-γ IFN בטחול ובכבד במהלך מלאה מוקדם של פתוגנים 2,24 וייצור זו הוכח להגביר ייצור IFN-γ על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי NK 2. מצד שני, לאחר מכן הפועל לימפוציטים מסוג T אדפטיבית, תאי CD8 + T ב Particular, חשוב לתיווך סליקת הפתוגן ומתן הגנה מפני 1,4,22 זיהום מחדש. מודל זיהום זה כבר אטרקטיבי החוקר במשך מספר סיבות (הנסקרת ב 1). ראשית, זיהום עם הפתוגן הוא מאוד לשחזור ומשרת תגובה חיסונית חזקה Th1 וסלולר. שנית, במהלך ההדבקה sublethal, עומס חיידקי מרוכזת הכבד והטחול בו ניתן למדוד בקלות. שלישית, הפתוגן ניתן לטפל בבטחה תחת 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) תנאים. רביעית, האורגניזם ואת התגובה החיסונית כי היא יוצרת, מתאפיינת בהרחבה. לבסוף, מגוון של זנים מוטנטים ו-מהונדסים גנטית פותחו זמינים לשימוש. המתואר כאן הוא פרוטוקול בסיסי עבור חיסון של C57BL / 6J עם זן EGD של ל חיידקי 25 ו למדידת IFN - γ מחדשsponses ידי NK, NKT, ו לימפוציטים אדפטיבית שלאחר זיהום. כמו כן הוא תאר כיצד למדוד עומס חיידקים בטחול ובכבד לאחר הדבקת sublethal ולבצע מחקרי הישרדות לאחר הדבקה עם מנת LD 50 שונה של הפתוגן. לבסוף, נציגי נתונים מוצגים כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקרין את ההשפעה של טיפולים חדשים על תגובות IFN-γ והישרדות עכבר ל חיידקי זיהום.

<table><tbody><tr><td>מרק עירוי לב למוח, שונה</td><td>BD</td><td>299070</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד (NH3Cl)</td><td></td><td></td> <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22400089</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12483</td><td>לפני השימוש, יש להשבית את החום ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>מעכב הובלת חלבון GolgiStop (המכיל מוננסין)</td> <td>BD</td><td>554724</td><td>שימוש 4 &mu; l בתרבית תאים של 6 מ"ל</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehye</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>לדלל ל-4% PFA ב-ddH2O או 1x PBS</td></tr><tr><td>10x Perm/Wash buffer</td><td>BD</td><td>554723</td><td>לדלל 1x בבלוק FC ddH2O</td></tr><tr><td>Fc, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>לדלל 1:50</td></tr><tr><td>צבע כדאיות לתיקון eFluor 506</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>לדלל 1:1,000 (השתמשנו גם בצבעי כדאיות מבדיקות מולקולריות)</td></tr> <tr><td>נגד עכבר CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td> <td>eBioscience</td><td>15-0041</td><td>היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת יש לטטר זאת לפני השימוש.</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD8-FITC (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081</td><td>היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; אולם יש לטטר אותו לפני השימוש.</td></tr><tr><td>PBS57/mCD1d טטרמר-APC</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td>N/A</td><td>התקבל במתנה מהמתקן</td></tr><tr><td>נגד עכבר TCR&beta;-PE-Cy7 (H56-597)</td><td>eBioscience</td><td>25-5961</td><td>היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת יש לטטר אותו לפני השימוש.</td></tr><tr><td>נגד עכבר NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td><td>eBioscience</td><td>47-3351</td><td>היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת יש לטטר אותו לפני השימוש.</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0451</td><td>היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת, יש לטטר אותו לפני השימוש.</td></tr><tr><td>נגד עכבר IFN gamma-PE (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>12-7311</td><td>היצרן ממליץ על גודל בדיקה מסוים; עם זאת, יש לטטר אותו לפני השימוש.</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td>השתמש בטיפה אחת לכל כתם</td></tr><tr><td>עכבר IFN gamma ELISA kit</td><td>eBioscience</td><td>88-7314</td><td>משמש למדידת גמא האינטרפרון בתרבית supernatant</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות מאווררים לתרבית</td><td></td><td></td><td>משמש לתרבית החיידקים, כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr>צלחות <td></td><td></td><td>פטרי חיידקיות</td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>2 מ"ל Cyrovials</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>ספקטרומטר</td><td></td><td></td> UV <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>מחטים</td><td></td><td></td> מהונדסות בטיחות <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>מלאי #000664</td><td>הזמנה עבור הגעה לאחר 7 שבועות</td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td></td><td></td><td>לטיהור</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td>לטיהור</td></tr><tr><td>חרוזי</td><td></td><td></td> זכוכית <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr>רוטור<td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>, דליים, כיסויי דלי.</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td></td><td></td> סטרילי <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>טיפים</td><td></td><td></td> לפיפטה <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>מכשירים</td><td></td><td></td> כירורגיים <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>70 מיקרון מסננות</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>מזרק</td><td></td><td></td> 3 מ"ל <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>אקדח</td><td></td><td></td> פיפטה <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>יחידות</td><td></td><td></td> סינון <td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td></td><td></td><td>דילול 1 עד 9 ב-ddH2O, כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>צלחות עם תחתית עגולה</td><td></td><td></td><td>כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>צינורות FAC</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>כל ציטומטר זרימה יכול לשמש לרכישה שיש לה תצורת לייזר מתאימה וסט מסננים כדי להבחין בין הפלואורוקורמים</td></tr><tr><td>Flowjo תוכנה</td><td>Treestar</td><td></td><td>משמש לניתוח נתונים. סוגים אחרים של תוכנות ניתוח נתונים יתאימו גם</td></tr><tr><td>פיפטור רב ערוצי (0 - 300 ומיקרו; l)</td> <td>Eppendorf</td><td></td><td>משמש לשטיפת תאים והוספת נוגדנים במהלך צביעת ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td></td><td></td><td>המשמשת לשטיפת חרוזי זכוכית, כל מותג צריך להיות מתאים</td></tr><tr><td>מערכת שימור חיידקים Microbank</td><td>Pro-lab Diagnostics</td><td></td><td>משמש כחלופה למלאי גליצרול לאחסון ארוך טווח של חיידקים</td></tr></tbody></table>

זיהום הניסיון עם<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

ל חיידקים הוא חיידק גראם חיובי כי הוא הגורם למחלה שמקורן במזון בבני אדם. זיהום ניסיוני של עכברים עם הפתוגן זה כבר אינפורמטיבי מאוד על עצם את התפקיד של תאי מערכת חיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות וציטוקינים ספציפי חסינות מארח נגד פתוגנים תאיים. הייצור-γ IFN ידי תאי מולד במהלך הדבקת sublethal עם חיידקי L. חשוב להפעלת מקרופאגים ובקר מוקדמים של הפתוגן 1-3. בנוסף, ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים זיכרון אדפטיבית חשוב תחול ההפעלה של תאי מולד על הדבקה חוזר 4. ל חיידקי מודל זיהום ובכך משמש כלי נהדר עבור חוקרת האם טיפולים חדשים אשר נועדו להגביר את ייצור IFN-γ להשפיע על תגובות IFN-γ in vivo ויש להם תופעות ביולוגיות פרודוקטיבי כגון הגדלת אישור חיידקים או שיפור הישרדות עכבר מהַדבָּקָה. המתואר כאן הוא פרוטוקול בסיסי איך לנהל זיהומים intraperitoneal של C57BL / 6J עם זן EGD של חיידקי L. וכדי למדוד ייצור IFN-γ על ידי תאי NK, תאי NKT, ו לימפוציטים אדפטיבית ידי cytometry הזרימה. בנוסף, הליכים מתוארים ל: (1) לגדול ולהכין את החיידקים עבור חיסון, (2) למדוד עומס חיידקים בטחול ובכבד, ו (3) הישרדות בעלי חי מידה לנקודות קצה. נציג נתונים ניתנים גם כדי להמחיש כיצד מודל זיהום זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים ספציפיים על התגובות IFN-γ כדי חיידקי L. והישרדות של עכברים מזיהום זה.

איור 3 מציג צביעה טיפוסית של IFN-γ באמצעות ציטומטריה של זרימה בתאי NK ו-NKT של הטחול 24 שעות לאחר הדבקה עם 105 CFU של הפתוגן. איור זה ממחיש גם את אסטרטגיית ה-gating עבור פאנל הצביעה המתואר ב-טבלה 2. איור 4 מראה נתונים מייצגים שהתקבלו בניסוי אחד שבו עכברים זכרים טופלו באנטגוניסט ל-PPARα, IS001, או בבקרה (vehicle), הודבקו עם 105 CFU של L. monocytogenes, ולאחר מכן נבחנו עבור IFN-γ בתאי NK ו-NKT לאחר 24 שעות. אי...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחסן עכברי C57BL/6J בזן EGD של ליסטריה מונוציטוגנס (L. monocytogenes) ולמדוד תגובות אינטרפרון-γ (IFN-γ) על ידי תאי הרג טבעי (NK), תאי T הורגים טבעיים (NKT) ולימפוציטים מסוג T אדפטיביים לאחר הדבקה. פרוטוקול זה מתאר גם כיצד לבצע מחקרי הישרדות בעכברים לאחר הדבקה במינון LD50 שונה של הפתוגן.

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

המטרות הכלליות של פרוטוקול זה הן לגדל ולהדביק עכברי C57 blacksix בזן EGG של listeria monocytogenes, ולמדוד את העומס החיידקי, את התגובות של interferon gamma, ואת השרידות והתגובה לזיהום על ידי פתוגן זה. פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים לסנן חומרים או גנים המשפיעים על התגובות של interferon gamma ועל שרידות בעלי החיים לאחר זיהום חיידקי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית להקמה במעבדה.אפילו עבור אלו בעלי ניסיון מועט בגידול חיידקים. את הפרוצדורה תדגים גם ג'ניפר אן, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. התחילו בטבילת קצה פיפטה סטרילי במאגר גליצרין של זן L monocytogenes EGG שהופשר בטמפרטורת החדר.מיד לאחר מכן, השתמשו בקצה הפ pipette כדי לבצע מריחה הלוך ושוב על פני חלק מצע בביליון של מצע BHI או Brain Heart Infusion. זוהי מריחת הראשונה. סובבו את הפיתה ב-90 מעלות וגררו קצה pipette חדש דרך המריחה הראשונה, כדי לפרוס את המלאי לרבע הבא של הפיתה.זהו הריסוס המשני. לאחר מכן, סובב ופרוס את הריסוס המשני לרבע שלישי של המצע כדי ליצור את הריסוס השלישוני. כעת, הפוך את המצע וכלל אותו בטמפרטורה של 37 °C, לדגירה למשך לילה.מושבות בודדות ואחידות אמורות להיות גלויות במערכת הריסוס האחרונה לאחר 16 עד 24 שעות. עם הופעת המושבות, העבירו 10 milliliters של מצע BHI broth סטרילי לשפופרת סטרילית עם פתח אוורור בנפח 50 milliliter, והשתמשו בקצה פפיתה סטרילי כדי להעביר מושבה אחת של L monocytogenes מהצלחת למצע. דגרו את המצע המוחדר באינקובטור עם ניעור אורביטלי למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees celsius ובמהירות של 225 rotations per minute, עד שערך ה-OD600 יהיה שווה ל-1.להכנת האינוקולום עבור זיהום ניסויי ב-L monocytogenes, בתוך קבלה בביטחון ביולוגי, חסן מבחנה של מצע BHI עם 100 µL של תרבית מהלילה הקודם. לאחר דגירה נוספת ב-37 °C, עם ניעור עד להגעה ל-OD600 הרצוי, העבר את תכולת התרבית למבחנה צנטריפוגית סטרילית לצורך צנטריפוגציה. השתמש בשואב ואקום המחובר לבקבוק מלכוד המכיל אקונומיקה כדי לשאוב את העלייה.שטפו את המשקע פעמיים עם PBS תחת אותם תנאי סבב. לאחר השטיפה השנייה, השעו מחדש את החיידקים ב-PBS ודללו לריכוז המתאים, כדי להעביר את ה-CFU הרצוי לכל עכבר בנפח של 200 microliter.בשלב הבא, ערבבו היטב את התרחיף בעזרת טיפ פיפטה סטרילי כדי להבטיח שהחיידקים מפוזרים באופן הומוגני. לאחר מכן, שאבו 200 µL מהאינוקולום למזרק בטיחותי של 1 mL המצויד במחט בכילוי 25 gauge. כעת, אחזו בעורף העכבר בעזרת היד הפחות דומיננטית על ידי תפיסת העור הרפוי סביב הכתפיים.הזריקו את כל 200 מיקרוליטר של האינוקולום לרבע התחתון של הבטן, לצד קו האמצע כדי להימנע מהשלפוחית, תוך שימוש במחט ומזרק חדשים עבור כל חיה. כדי למדוד את עומס החיידקים בשיא הזיהום, ביום השלישי לאחר הזיהום, קבעו את גפי החיה הניסויית במצב שכיבה על גבם על לוח ניתוחים. חטא את העור עם ethanol 70%.בעזרת מספרי חיתוך קשיחים סטריליים, בצעו חתך מהחזה אל המפשעה. לאחר מכן, בצעו חתך ממצע המפשעה לכיוון כל אחד מהברכיים וממרכז החזה לכיוון כל אחד מהמרפקים. בצעו דיסקציה קהה והדיפו את העור לאחור, וקבעו אותו במצב פתוח באמצעות מחטים במידה 25 gauge.חטא את שכבת השריר בעזרת אתנול 70% נוסף. לאחר מכן, באמצעות מספריים עדינים סטריליים, בצע חתך בקו האמצע של דופן הפריטונאום. השתמש בפינצטה כדי לתפוס את תהליך החרב (xiphoid process).בצעו חתכים בדופן הפריטונאום החל מתהליך החרב (xiphoid process) ותנועה לצדדים בכל צד, תוך מעקב אחר כלוב הצלעות עד לנקודה שמתחת לסרעפת. פעולה זו תחשוף את הכבד.בשלב הבא, השתמשו במספריים סטריליים כדי לגזור חתיכה של כ-100 milligram מאחת האונות. העבירו את הרקמה לפרוטוקול של מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter שנשקלה מראש ומכילה 0.2 עד 0.3 grams של כדוריות זכוכית סטריליים שנשטפו בחומצה ובקוטר של 1.5 עד 2 millimeter. השתמשו בפינצטה כדי לדחוק בעדינות הצידה את האיברים בצדו השמאלי של חלל הפריטונאום כדי לחשוף את הטחול.השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בעדינות את הטחול, וחתכו את רקמת החיבור שמסביב כדי לשחרר את האישון מחלל הפריטונאום. מקמו את הטחול במבחנה נפרדת מזו של הכבד, והעבירו את הרקמות למעבדה במיכל אטום למניעת דליפות המכיל קרח. נערו את המבחנות תוך שימוש בהומוגנייזר מסוג bead mill למשך שלוש דקות בתדר של 30 hertz.לאחר מכן, הכינו סדרת דילול של פי עשרה של ההומוגנאטים ב-0.1% Triton X 100 ב-PBS. לאחר מכן, השתמשו בפוסטר סטרילי כדי לפרוס 100 µl מכל הומוגנאט מדולל על צלחת אגר BHI. העבירו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C לדגירה למשך לילה.שמרו את הפלטות המכילות עד 300 מושבות לפלטה. ספרו את המושבות בכל פלטה. כדי למדוד CD4 בתגובות interferon gamma של תאי CT8 t, קצרו את הטחולים מעכברים שהודבקו ב-two tenths into the fourths CFU של הפתוגן, כפי שהודגם זה עתה.עבדו את הטחול לסuspended תמיסה אחת של תאי דם אדומים. ושסעו מחדש את המשקע בריכוז של ארבעה כפול עשרה בחזקת שש תאים למילליטר במצע RPMI מלא המכיל FCS. לאחר מכן, זרעו מילליטר אחד של תאים לכל באר בלוח של 24 בארות, עם כמות שווה בנפח של L monocytogenes שהופשר והורג בחום, והעבירו את התרביות הקרות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C.לאחר 20 שעות, הוסיפו לבארים 0.66 µL למילילטר של מעכב הובלת חלבונים, והחזירו את הפלטה לאינקובטור. ארבע שעות לאחר מכן, בתוך קבלית בטיחות ביולוגית, אספו 500 µL של על-נוזל התרבית והקפיאו את הדגימות בטמפרטורה של 80- °C לצורך מדידה מאוחרת של interferon gamma באמצעות ELISA.לאחר מכן, העבירו את התאים לשפופרה סטרילית אחת בנפח 15 milliliters, שטפו את הבארים ב-PBS ואספו את מי השטיפה יחד עם התאים שנאספו לצורך צביעה ואנליזה בציטומטריה זרימה. שיא העומס החיידקי מתרחש בטחול יומיים עד שלושה לאחר ההדבקה, והוא פוחת באופן דרמטי על ידי הוספת anTAGonist ל-PPAR Alpha לפני ההדבקה.שבעה ימים לאחר ההדבקה, גירוי חוזר ex vivo של תאי T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-CD8 מהטחול באמצעות פתוגן שהורג בחום מעורר תגובת interferon gamma חיובית מתאי CD4 חיוביים ו-CD8 חיוביים, כפי שזוהה באמצעות פלוו-ציטומטריה. טיפול עם אנטגוניסט ל-PPAR alpha לפני ההדבקה מגביר את תגובות ה-interferon gamma של תאי CD4 ו-CD8. יתרה מכך, טיפול באנטגוניסט ל-PPAR alpha מגביר את שיעור ההישרדות לאחר הדבקה במינון LD50 של הפתוגן, מה שמדגים את יעילותו של מודל זה לחקר ההשפעה של תרופות חדשות המודולות תגובות interferon gamma על הישרדות בעלי חיים מהדבקה.לאחר השליטה בהם, כל ההליכים בפרוטוקול זה יכולים להפיק את הנתונים הרצויים תוך מספר שבועות, במידה ובוצעו כהלכה. ניתן להתאים את הטכניקה עוד יותר על ידי הדבקת עכברים עם זנים של listeria monocytogenes המבטאים אנטיגנים מודליים, ושימוש בסוכני טטראמרים של MAC class one ו-two הספציפיים לאנטיגנים אלו. דבר זה יאפשר למדוד את התרחבות תאי ה-T לאחר ההדבקה.לאחר פיתוחה, הפכה טכניקה זו למודל מכריע לפענוח תפקידו של interferon gamma בחסינות המארח מפני פתוגנים תוך-תאיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הגידול והדבקת עכברי C57 blacksix ב-listeria monocytogenes, וכן כיצד למדוד את עומס החיידקים ואת תגובות ה-interferon gamma לזיהום.יש לזכור כי עבודה עם listeria monocytogenes עלולה להיות מסוכנת עבור אנשים עם מערכת חיסון מוחלשת, כגון נשים בהריון, ילדים צעירים מאוד או קשישים. לפיכך, יש לטפל בפתוגן אך ורק על ידי אנשים בעלי מערכת חיסון תקינה ותחת תנאי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2).

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

חיידקי ליסטריה הוא אורגניזם מודל ללימוד המערכת החיסונית ורגישות גנטית תאיים לחיידקים בעכברים. שיטה זו מאפשרת למדוד עומס חיידקים ליצור תא בודד השעיות של הכבד והטחול מעכברים לניתוח FACS לקבוע שינויים בתאי המערכת החיסונית עקב זיהום ליסטריה.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

מקור: Seman, B. G. ואחרים. מודל הדמיה של יילודים של ספסיס חיידקי גראם שלילי. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים מודל עכבר יילוד לחקר זיהום מערכתית באמצעות חיידקים ביולומינצנטיים מקופלים. גורים יילודים מוזרקים בתרופות חיידקיות במינון גבוה או נמוך ומוחזרים לאמם לטיפול לאחר הלידה. החיידקים המכוסים בכיסוי נמנעים מזיהוי חיסוני מוקדם, מתפשטים באופן מערכתית, ומוצגים לאורך זמן באמצעות הדמיית זוהר. מודל זה מאפשר מעקב לא פולשני אחר התקדמות הזיהום בעכברים יילודים.

מידול זיהום בעכברים יילודים באמצעות חיידקים ביולומינסנטיים עטופים

מקור: רדולוביץ', ק., ואחרים. הזרקות של ליפופוליסכריד לעכברים כדי לחקות כניסת מוצרים שמקורם במיקרוביאליזם לאחר פריצת מחסום מעיים. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים הליך שלב אחר שלב להזרקת ליפופוליסכריד (LPS) לעכברים תוך-פריטונית כדי לגרום לדלקת מערכתית.

הזרקה תוך-פריטונית של ליפופוליסכריד חיידקי בעכברים לחקר תגובות חיסוניות מערכתיות

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

סרטון זה מדגים שיטת הדמיה להמחשת אינטרפרון-גמא באתרו (IFN-γ) בטחול העכבר. בעקבות זיהום חיידקי והשראת הצטברות IFN-γ בתוך תאי T ותאי הרג טבעיים, הטחול נקצר מהעכבר. עם קבלת קטעי רקמות, immunostaining מבוצע כדי לדמיין IFN-γ בתוך התאים.

בדיקה לזיהוי הפרשת אינטרפרון-גמא באיברי הלימפה של מורין

סרטון זה מדגים את כימות העומס החיידקי הזיהומי ממוח העכבר המחורר הנגוע בליסטריה מונוציטוגנים.

הערכת התיישבות חיידקים במוח עכבר בעקבות זיהום ליסטריה מונוציטוגנים

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לזיהום אוראלי של עכברים...

הילוכים אוראלי של<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בעכברים באמצעות בליעה של מזון מזוהם

חיידקי ליסטריה הוא פתוגן חיידקים גראם חיובי משמש לעתים קרובות כמודל עיקרי לחקר טפילות תאית. הדמיה מאוחר L. חיידקי לשלבי זיהום בהקשר של מסכי RNA התערבות קטנים מאפשר למחקר העולמי של מסלולים הסלולר נדרשים לזיהום חיידקים של תאי מארח יעד.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

כאן, אנו מתארים מיקוד פשוט שיטה הדמיה כדי להמחיש את הלוקליזציה באתרו של תאים הפרשה את ציטוקינים אינטרפרון גמא באיברי הלימפה משני מוראין. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור ויזואליזציה של ציטוקינים אחרים ברקמות שונות.

הדמיה של אינטרפרון באתרו הפקת גמא בטחול העכבר בעקבות זיהום יסטריה חיידקי

למדו לזהות עכברי C57BL/6J בחיידק Listeria monocytogenes למדידת תגובות אינטרפרון-γ ושרידות. פרוטוקול זה מאפשר סינון של סוכנים וגנים המשפיעים על תגובות החיסון.

זיהום הניסיון עם

גלה סרטונים נוספים