Name: הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למדו למדוד מהירות פאגוזומים במקרופאגים אנושיים נגועים ב-HIV-1 באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת פאגוזומים לעבר מרכז התא בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ג'מיל ג'וברייל על קריאת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 כולל מלגת דוקטורט ל-GLB) וה-Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, כולל מלגת פוסט-דוקטורט לתקליטור) ל-FN. A. Dumas נתמך על ידי מלגות דוקטורט מאוניברסיטת פריז דקארט ו-Sidaction.

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microtubule+dynamics+in+phagosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for microtubule dynamics in phagosome movement.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).</li>
<li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+bi-directional+movement+of+phagosomes+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules.</a> J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+non-typhoidal+salmonella+disease%3A+an+emerging+and+neglected+tropical+disease+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa.</a> Lancet. 379, 2489-2499 (2012).</li>
<li>Mazzolini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagocytosis+in+HIV-1-infected+macrophages+relies+on+Nef-dependent+alteration+of+focal+delivery+of+recycling+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments.</a> Blood. 115, 4226-4236 (2010).</li>
<li>Dumas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+protein+Vpr+impairs+phagosome+maturation+by+controlling+microtubule-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking.</a> J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).</li>
<li>Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+technique+to+distinguish+attached+from+ingested+erythrocytes+and+zymosan+particles+in+phagocytosing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages.</a> J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).</li>
<li>Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internal+HIV-1+is+protected+from+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies.</a> J Virol. 86, 2826-2836 (2012).</li>
<li>Gartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+HIV%3A+basic+concepts+and+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies.</a> Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+fuse+with+late+endosomes+and%2For+lysosomes+by+extension+of+membrane+protrusions+along+microtubules%3A+role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP.</a> Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Toyohara, A., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יש טכניקה זו יש כמה שלבים קריטיים. ראשית, הכנת hMDMs והזיהום שלהם על ידי HIV-1 הוא קריטי מאחר ואחוז הזיהום הוא תורם תלוי. ראוי לציין, החלטנו להשתמש מקרופאגים שאינם מקוטבים במבחנה לפני ההדבקה, כי מעמדה של מקרופאגים נתקלו באופן פוטנציאלי על ידי הנגיף in vivo לא התאפיינה טוב עד כה. בדקנו את הביטוי של סמנים משטח מספר, המציין כי מקרופאגים אינם M1 ולא M2, ואישר את הביטוי של CD4 ו CCR5. שיעורי הזיהום הנם משתנה נעים בין 10 ל -40%, ולפעמים נמוכים יותר. שיעור ההדבקה משתנה ...

מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי במערכת החיסון המולדת ובהומאוסטזיס. הם פגוציטים מקצועיים המפנימים ומחסלים פתוגנים ופסולת בתהליך הנקרא פגוציטוזיס 1,2. הפאגוזום, התא הסגור שנוצר לאחר בליעת חומר חלקיקי, עובר סדרה של אירועי היתוך וביקוע עם תאים אנדוציטיים, מה שמוביל לתא מתפרק הנקרא פגוליזוזום. לתא זה יש pH חומצי, עקב רכישת v-ATPases השואבים פרוטונים, מכיל אנזימים הידרוליטיים ומועשר בחלבוני ממברנה הקשורים לליזוזומלית (LAMPs). התבגרותם של פגוזומים מלווה בנדידתם על מיקרו-צינורות 3,4 לכיוון מרכז התא כדי להגיע למיקום פרי-גרעיני בו מצטברים ליזוזומים.
פתוגנים רבים דווחו כחוטפים את התבגרות הפגוזום, כולל חיידקים בעלי אורח חיים תוך-תאי המשנים את סביבת הוואקאולר שבה הם שוכנים 5. נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1 מכוון למקרופאגים בנוסף לתאי T. מכיוון שמקרופאגים עמידים להשפעות הציטופתיות של הנגיף, בניגוד לתאי T, הם יכולים להיחשב כמאגר לנגיף. בנוסף, מקרופאגים הנגועים ב-HIV-1 מראים תפקודים פגוציטים פגומים ותורמים להופעתן של מחלות אופורטוניסטיות. בפרט, מחלת סלמונלה פולשנית חמורה שאינה טיפואידית הנגרמת על ידי סלמונלה טיפימוריום ST313 נפוצה בשלושת העשורים האחרונים בקרב ילדים או מבוגרים מאפריקה שמדרום לסהרה שנדבקו ב-HIV 6. ההערכה היא שהסיכון לפתח שחפת גדול פי 20 בקרב אנשים החיים עם HIV מאשר בקרב אלה ללא זיהום ב-HIV. 
מכל הסיבות הללו, חשוב להגדיר טוב יותר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפגמים הפגוציטים במקרופאגים נגועים ב-HIV. הראינו כי ספיגת חומר חלקיקי, חלקיקים אופסוניים, חיידקים או פטריות, עוכבה במקרופאגים נגועים ב-HIV 7. בהתחשב בכך שעיכוב זה הוא חלקי, יצאנו לנתח את גורלם של הפאגוזומים המופנמים במקרופאגים אנושיים נגועים ב- HIV 8. מכיוון שהבשלת הפגוזומים קשורה קשר הדוק להגירה למרכז התא והיתוך עם ליזוזומים, פגם בהתבגרות הפגוזומלית יכול לנבוע משינויים באופני הסחר בתא הנגוע. השיטה המתוארת כאן משתמשת בתאי דם אדומים של כבשים (IgG-SRBCs) כמודל להתמקדות בפגוציטוזיס בתיווך קולטנים ובפרט קולטנים לחלק ה-Fc של אימונוגלובולינים (FcR). חלקיקים אלה קלים יותר לצילום בשדה בהיר (BF) מאשר חרוזי לטקס מכיוון ש-SRBCs חוץ-תאיים ותוך-תאיים מראים תכונות שבירה שונות 9. כדי למדוד את מהירות הפגוזומים שנעים לעבר הגרעין במקרופאגים נגועים ב-HIV, השתמשנו בווירוס פלואורסצנטי 10 והגדרנו שיטת מעקב ידנית פשוטה המתוארת כאן. השיטה אינה דורשת תכנות מתקדם ופשוט משתמשת ב-ImageJ. הוא ניתן לתאים דבקים ולכל סוג של חלקיק או פתוגן שניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או עם הדמיה פלואורסצנטית.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 מ"מ TC-Treated Cell Culture</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>לייצור ויראלי</td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית 35 מ"מ לא מצופה 1.5</td><td>תאגיד MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C מארז</td><td>לרכישה</td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות פלקון 6 בארות</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>למקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>פוליסכריד הידרופילי ניטרלי, מסועף מאוד, בעל מסה גבוהה, בתמיסה לצנטריפוגה בצפיפות</td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RT Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, נוזלי (גלוקוז גבוה)</td><td>GIBCO, בדיקות מולקולריות</td><td>31966-021</td><td>נשמר ב-4 מעלות; C ; לתרבית תאי HEK</td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני GLUTAMAX&nbsp; </td><td>תוסף טכנולוגיות חיים</td><td>61870-010</td><td>נשמר ב-4 מעלות; C; עבור תרבית hMDMs</td></tr><tr><td>F&oelig; סרום עגל טל (FCS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>נשמר ב-20 מעלות; C ; </td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין ללא השלמה (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>נשמר ב-20 מעלות; C ; לתרבית hMDMs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני, ללא פנול אדום (10x 500 מ"ל)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש; לבדיקת פגוציטוזיס</td></tr><tr><td>FuGENE6 מגיב טרנספקציה</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>נשמר ב -4 מעלות; C ; לייצור ויראלי</td></tr><tr><td>תאי דם אדומים של כבשים (SRBCs)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>נשמר במאגר אלסבר ב-4 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>תאי דם אדומים נגד כבשים IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>נשמר ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>C סרום בקר אלבומין מקטע הלם חום, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td>נשמר ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr> יחידת <tr><td>דיסק מסתובב קונפוקלי&nbsp; CSU-X1M1</td><td>לייזר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 ננומטר 50 mW לייזר</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>עדשת אובייקטיבי; הגדלה 100X ; צמצם מספרי 1.40 ; שמן טבילה</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) מצלמה</td><td>פוטומטרית</td><td></td><td>גודל פיקסל 6.45 ומיקרו; M x 6.45 ומיקרו; m ; הגדרה 1,392 x 1,040 ; קידוד התמונה בתוכנת 14 Bit</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7.5</td> התקנים <td></td><td>מולקולריים</td><td>לשליטה במיקרוסקופ</td></tr><tr>תוכנת <td></td><td></td><td>GraphPad Prism</td><td>לניתוח סטטיסטי</td></tr></tbody></table>

הגירה ו מהירות phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם hiv-1

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

מקרופאגים הם תאים פגוציטים הממלאים תפקיד מרכזי בצומת הדרכים בין חסינות מולדת לחסינות ספציפית. הם יכולים להידבק בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1 ובגלל עמידותם להשפעותיו הציטופתיות הם יכולים להיחשב כמאגרים נגיפיים מתמידים. בנוסף, מקרופאגים נגועים ב- HIV מציגים תפקודים פגומים התורמים להתפתחות מחלות אופורטוניסטיות.
המנגנון המדויק שבאמצעותו HIV-1 פוגע בתגובה הפגוציטית של מקרופאגים לא היה ידוע. הראינו בעבר כי ספיגת חלקיקים שונים על ידי מקרופאגים עוכבה כאשר הם נדבקו ב-HIV-1. עיכוב זה היה חלקי בלבד ופאגוזומים אכן נוצרו בתוך מקרופאגים נגועים ב-HIV. לכן, התמקדנו בניתוח גורלם של הפאגוזומים האלה. התבגרות הפגוזומים מלווה בנדידה של תאים אלה לכיוון מרכז התא, שם הם מתמזגים עם ליזוזומים, ויוצרים פגוליזוזומים, האחראים על השפלה של החומר הנבלע. השתמשנו בתאי דם אדומים של כבשים שעברו IgG כמטרה לפגוציטוזה. כדי למדוד את מהירות התנועה הצנטריפטלית של פגוזומים במקרופאגים בודדים הנגועים ב-HIV, השתמשנו בשילוב של שדה בהיר ומיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. יצרנו שיטה לחישוב המרחק של פגוזומים לעבר הגרעין, ולאחר מכן לחישוב מהירות הפאגוזומים. תאים נגועים ב-HIV זוהו הודות לנגיף המבטא GFP, אך השיטה ישימה לתאים לא נגועים או לכל סוג של זיהום או טיפול.

FCR בתיווך phagocytosis על ידי HIV-1-נגוע hMDMs הלא נגועים מתואר כאן על ידי שימוש SRBCs IgG-opsonized כמטרות מודל (איור 1). השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הכנת hMDMs ואת ההדבקה ב- HIV-1. ואכן, התפוקה והאיכות של מקרופאגים בדיל משתנים בין תורמים, כמו גם את שיעור ההדבקה עם יעילות בטווח של 10-40%. בנוסף, הכנת IgG-opsonized-SRBCs חשוב גם כדי למנוע נזק אריתרוציטים, כי זה יכול לגרום הכרתם ספיגת כמו פסולת במקום על ידי phagocytosis בתיוו...

אנו מתארים שיטה למדידת מהירות הפגוזומים הנעים לעבר מרכז התא בתאים חיים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) מסוג 1 או בלעדיו, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של דיסק מסתובב לזיהוי תאים נגועים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופ שדה בהיר לזיהוי פגוזומים.

הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

המטרה הכוללת של ניתוח זה היא לכמת את מהירות הפגוזום במקרופגים המודבקים ב-HIV-1 באמצעות שיטת מעקב ידנית פשוטה. היתרון של פרוטוקול זה הוא אספקת שיטה קלה לחישוב התנועות היחסיות של קבוצות עצמים בתוך תא, אשר יכולים להיות בתנועה או לעבור דהפורמציה. שיטה זו מספקת תובנות לגבי תנועת פגוזומים במקרופגים מודבקים חיוביים ל-GFP, אך ניתן להשתמש בה עבור מדורים תוך-תאיים אחרים בתאים המסומנים פלואורסצנטית.לאחר הדבקת מקרופאגים המופקים ממונוציטים אנושיים ואופסוניזציה של תאי דם מכבש, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הגדירו בדיקת פגוציטוזה באמצעות מערכת דימוי קונפוקאלית, כגון מיקרוסקופ spinning disc, המצוידת בתא חימום בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, עם carbon dioxide. לפני הניסוי, הפעילו את תא החימום כדי לחמם את במה המיקרוסקופ ל-37 degrees Celsius. לאחר מכן, הפעילו את המיקרוסקופ ואת המחשב, וטענו את תוכנת הדימוי.בצעו אופטימיזציה להגדרות ההדמיה, כגון מהירות הסריקה, הגדלה, רזולוציה וכדומה, כך שיהיה לפחות תא אחד בכל שדה ראייה, וכדי להדמות פריים אחד בכל דקה במשך 60 עד 120 דקות. הניחו את צלחת ההדמיה על במה של המיקרוסקופ. כווןנו את המיקוד והמיקום כדי למצוא תא מאקרופאג אחד שלם שנדבק ל-HIV-1 בשדה הראייה.השתמשו בהגדרות עירור ופליטה מתאימות בהתאם למערכת ההדמיה ולגשש שבשימוש. כללו ערוץ שדה בהיר (bright field). הגבילו את המראה שלו על ידי התאמת זמן החשיפה.לאחר מכן, הוציאו את צלח ההדמיה והוסיפו לצלח מיליליטר אחד של תרחיף תאי דם של כבשים, או SRBC suspension, בריכוז של שבעה עשירותיות של עשירית מה-SRBCs השישיים למילליליטר. סובבו את הצלח בצנטריפוגה ב-500 $\times$g למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לסנכרן את הפגוציטוזה, לאחר מכן רשמו את הזמן בסיום הסבוב והחזירו את הצלח לבמה. בצעו אופטימיזציה של הפוקוס וקבעו את הגבול העליון והתחתון של הערימה עם מרחק של 0.3 $\mu$m בין השכבות.התחל ברכישת סדרות של Z stacks של תמונות GFP ו-BF לאורך עובי התא, ושמור את סרטון ה-time-lapse בפורמט הקובץ המקורי של מערכת הדימות. לצורך עריכת הווידאו, בתוכנת עריכת הווידאו, לחץ על התפריט הנפתח Apps ועל הלשונית Review Multidimensional Data. כדי לפתוח את הקובץ, לחץ על Select Base File, ולאחר מכן על Select Directory.בתיבת ה-Data Sets, בחרו את הרכישה לניתוח ולחצו על View. כדי לייצג את הזיהום בהשלכה מסוג Z projection, בחרו בתיבת ה-Wavelengths באורך גל של 491 nanometer ולחצו על לשונית ה-Z projection עם כל המישורים. לאחר מכן, כדי לנתח רצף זמנים, בחרו בתיבת ה-Wavelengths באורך גל BF ובחרו את המישור האופטימלי בציר ה-Z כדי להבחין בין SRBCs חיצוניים, SRBCs פנימיים והגרעין.שמרו את מונטז'י הווידאו על ידי לחיצה על לשונית Selection Xs ולאחר מכן על Load Images. לבסוף, שמרו את התמונות שנטענו בפורמט tif. לאחר הורדת תוסף המעקב הידני (manual tracking plugin) של Image J, פתחו את התוסף ב-Image J, ולאחר מכן פתחו את רצף התמונות למשלוח לניתוח.הזינו את ההגדרות, כגון מרווח הזמן, המייצג את פרק הזמן בין פריימים סמיכים, ואת כיול ה-XY, המייצג את המרחק לכל פיקסל. כדי להתחיל את המעקב, לחצו על Add Track, ולחצו על מרכז ה-SRBC ברגע הראשון שבו הוא עובר הפנמה. הפריים הבא יופיע באופן אוטומטי.לנוחותכם, כדי לראות את ה-SRBCs בערוץ ה-BF, השתמשו בחלון הבהירות והניגודיות במהלך המעקב. המשיכו ללחוץ על מרכז ה-SRBC בכל הפריים כדי לקבל מיקומים שונים לאורך זמן. בין כל מעקב של SRBC, לחצו על End Track ולאחר מכן על Add Track כדי להתחיל מעקב חדש.מספר המעקב ישתנה בעמודה השנייה של טבלת התוצאות. התחילו לעקוב אחר הגרעין כדי לקבל את מיקומו בכל הפריימים על ידי לחיצה על מרכזו, כפי שבוצע קודם לכן. שמרו את הנתונים בגיליון אלקטרוני, פתחו אותו בתוכנת גיליונות אלקטרוניים, וצרו קובץ גיליון אלקטרוני חדש.העבירו לקובץ חדש זה את הזמן ואת קואורדינאות ה-X וה-Y של ה-SRBC והגרעין. לבסוף, השתמשו בתוכנת גיליונות אלקטרוניים כדי לחשב את המרחק שעברו פגוזומים המכילים SRBCs לכיוון הגרעין, ואת מהירות הפגוזומים במהלך חמש הדקות הראשונות לאחר הפנימה של ה-SRBCs בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כאן מוצג ניתוח של תנועת פגוזומים במקרופאגים חיים שנדבקו ב-HIV בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסקה מסתובבת (spinning disc confocal microscopy).הגדרות ערוץ השדה המואר (bright field) הן קריטיות לצפייה בגרעין ולבידול בין תאי כדוריות דם אדומות של חולדה (SRBCs) חיצוניים לאלו שהופנמו. גרף זה מציג את המרחק שעבר פגוזום ב-HMDMs שאינם מזוהמים בחמש הדקות הראשונות לאחר הפנמה של SRBC כנגד הזמן. מהירות הפגוזום היא השיפוע של עקומת הרגרסיה הליניארית המוצגת כאן.לבסוף, במחקר זה נצפה כי מהירות הפגוזום במהלך חמש הדקות הראשונות לאחר ההפנמה ב-HMDMs המודבקים ב-HIV נמוכה יותר בהשוואה ל-HMDMs שאינם מודבקים. שיטות אלו הדגימו כי תנועת הפגוזום לעבר מרכז התא, ולפיכך הבשלת הפגוזום לפגולیزוזומים, הייתה פגועה במקרופאגים המודבקים ב-HIV. לאחר רכישת הדגימה, ניתן להמשיך בעיבוד התא עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית קורלטיבית, או שניתן לקבע את כל אוכלוסיית התאים עבור מיקרוסקופיה קלאסית של אימונופלואורסנציה וניתוח סטטיסטי.בליעה תאית (פגוציטוזה) רגישה מאוד לטמפרטורה, ולכן יש לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 degrees Celsius בתוך תא החימום ובמדיום של צלח התרבית לאורך כל הפרוצדורה. זכרו כי עבודה עם פתוגנים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה בחדר בטיחות ביולוגית ולבישת ציוד מיגון אישי, בהתאם לחקיקה המקומית.

phagosome-migration-velocity-measured-live-primary-human-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפילים במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM). תאי המקרופאגים נגועים בשלבים הפולשניים התנועתיים והלא תנועתיים של לישמניה, פרומסטיגוטים מטאציקליים ואמסטיגוטים, בהתאמה. הטפילים פולשים למקרופאגים, מופנמים לחלל טפילי ומתרבים בפנים. צמיחת הטפיל התוך-תאי מכומתת באמצעות מיקרוסקופ על צביעה פלואורסצנטית של גרעיני המקרופאגים והטפילים.

בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי...

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

המנגנון הקשור לפאגוציטוזה בזיהום לישמניה נותר לא מובן. כאן אנו מתארים שיטות להערכת האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך אינטראקציה של לישמניה עם התאים המארחים.

חקירת הפאגוציטוזה של לישמניה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

למדו למדוד מהירות פאגוזומים במקרופאגים אנושיים נגועים ב-HIV-1 באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת פאגוזומים לעבר מרכז התא בזמן אמת.

הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1

גלה סרטונים נוספים