Name: הכנת CD4 + T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למד הכנת תאי CD4+ T לצביעת GD3 ו-GD2 ganglioside בממברנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גליקוליפידים בכמות קטנה של תאים, עם יישומים במחקר לוקמיה של תאי T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לד"ר חוסה לואיס דניוטי על הערותיו. אנו מודים לסיוע לד"ר J. Arturo Pimentel ולמעבדה הלאומית למיקרוסקופיה Avanzada-UNAM על רכישת תמונות קונפוקליות. י.מ.-ד. ו-T.M.V.C. נתמכו על ידי מענקים 157634 ו-253596 מ-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. זוכה מלגה (245192) מ-CONACYT. אנו מודים גם לתמיכתה של ה-Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

דם היקפיים מתורמים זכר בריא הושג עם הסכמה מדעת ואישור ועדת הביו-אתיקה של Centro de Investigaciòn en Dinámica Celular- Universidad האוטונומית del Estado de Morelos. בידוד הפעלת 1. הנאיבי האדם CD4 + T תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 2 מ&quot;ל של דם היקפיים נגזר מתורמים אדם בריא באמצעות הסכמה מדעת לדלל עם 2 מ&quot;ל של PBS-EDTA סטרילי (בופר פוספט 1x (PBS), 2 מ&quot;מ EDTA, pH 7.4). מוסיפים את דם מדולל לאט על גבי 3 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז עם 1.077 צפיפות כפי שתואר לעיל 8. הערה: הגירה דיפרנציאלי במהלך צנטריפוגה הנגרמת על ידי הבדלים בצפיפות תגרום אריתרוציטים משקעים לחלוטין שכבה של תאי mononuclear צפופים פחות תהווה לעיל. 2 מ&quot;ל של דם היקפיים יעבד כ 0.5 x 10 6 תאים מסוג CD4 + T נאיבי לאחר purificatiעל צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 30 דקות ב 250 XG ב 21 ° C (הרוטור לשימוש עבור צינורות תחתית עגולה עם בזווית קבועה של 30 מ&quot;מ) ללא הפסקה כדי ליצור שיפוע של תאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). לאחר צנטריפוגה, PBMCs ניתן להבחין בבירור כמו טבעת לבנה. אסוף את PBMCs עם טפטפת להעביר צינור סטרילי לרחצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה שוטף עם פתרון PBS-EDTA ב 250 XG במשך 10 דקות והמשך טיהור של תאים מסוג CD4 + T נאיבי. שיטות מיון או מספר סוגים של ערכות טיהור זמינות למטרה זו. רצוי, להשתמש&gt; 1 x 10 7 PBMCs לטיהור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר נאיבי תאים מסוג CD4 + T על ידי סלקציה שלילית עם חרוזים מגנטיים. בצע סלקציה שלילית עם אנטי CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, אנטי TCRγ / δ, אנטי-HLA-DR, ו CD235a (א glycophorin) נוגדנים. להעריך את אחוז טוהר על ידי קביעת CD4 + CD45RA + תאים עד Fcytometry נמוכה. הערה: אם תרצה, תוכל להמשיך הדגירה של PBMCs לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם צפיפות של 1 x 10 מ&quot;ל 6 תאים / ב 10 מ&quot;ל של מדיום בתוספת לקדם דבקות מונוציטים ולהמשיך עם טיהור תא נאיבי CD4 + T. ההתאוששות היעילה של תאים מהסוג CD4 + T נאיביים מדם היקפי תלויה במידה רבה על מערכת הטיהור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות תרבית תאי 24 גם על ידי הוספת 250 μl לכל טוב של PBS עם 5 מיקרוגרם / מיליליטר נוגדנים חד שבטיים CD3 אנטי דגירה במשך שעה לפחות 2 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: צלחות עם 96 בארות ניתן להשתמש כאשר מספר קטן יותר מתאי CD4 + T נאיביים משמש (למשל, 2 x10 4 -1 x 10 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את דילול נוגדן CD3 אנטי מ -24 היטב או 96 צלחות היטב ולשטוף את הצלחות פעמיים באמצעות PBS 1x סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי CD4 + T הנאיביים עם&gt; 95% של טוהר (CD4 +CD45RA +) לצפיפות של 1 x 10 מ&quot;ל 6 תאים / במדיום מתקדמים RPMI 1640 בתוספת 3% בסרום שור העובר (או RPMI בתוספת 10% נסיוב), 2 מ&quot;מ גלוטמין ואנטיביוטיקה (1 U / פניצילין מ&quot;ל, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין). הערה: אם לוקליזציה ganglioside נדרשת PBMCs, לעקוב אחר פרוטוקול זהה עבור דילול וגירוי כמתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של דילול התא לבארות אנטי מצופה CD3 ו לבארות הלא מצופה (תאי שליטה) ב 24 את הצלחת היטב. לחלופין, להוסיף 100 μl של דילול התא אל הבארות של 96 את הצלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את התנאים גירוי של תאים נאיביים CD4 + T בבארות אנטי CD3 מצופה על ידי הוספת 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל של נוגדן CD28 אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים מסוג CD4 + T נח כמו שליטה הבארות הלא מצופה ללא תוספת של נוגדנים CD28 אנטי. CD4 + T תא דגירה להשראה והופעל עבור 0 כדי 72 שעות בתנאים סטנדרטיים של 37 מעלותC ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת הפעלה נאותה להעריך על ידי זרימת cytometry הביטוי של סמן ההפעלה מוקדם CD69 (16 שעות שלאחר הפעלה) או סמן הפעלה מאוחר CD25 (48 שעות שלאחר הפעלה) ב מנוחה והופעל תאי CD4 + T נאיביים וטופחו על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 ב היעדרותם ונוכחותם של CD3 אנטי / נוגדנים CD28 9,10. </li></ol> דבקות 2. של מנוחה הופעלו תאים הנאיביים CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר 12 מ&quot;מ עגול coverslips ידי מעוקר וחשיפה לאור UV למשך 15 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips צלחות תרבית תאים סטריליים 24 גם. הערה: עבור תרבויות עם פחות מ 1 x 10 5 תאים עדיף להשתמש בתאי שקופיות עם בארות קטנות המותאמות למנוע פיזור של תאים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מעיל (או תא שקופיות) עם 200 μl של פולי- L- ליזין (MW 150-300 KDA) 0.1% (w / v) פתרון דגירה במשך 5 דקות ב rטמפרטורת אום (RT), להסיר ויבש לפחות שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב בזהירות ולאסוף להשראה והופעל תאי CD4 + T נאיביים מצלחות 24 גם. ספירת התאים ובמידת הצורך להתאים עם המדיום השלימו טריים להעביר 1 x 10 5 תאים על coverslips מצופה פולי- L- ליזין. דגירה התאים למשך תקופה מינימלית של 6 שעות ב 37 מעלות צלסיוס ו 5% CO 2. </li></ol> 3. איסוף קיבוע של מנוחה הופעלו הנאיבית CD4 + T תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את מדיום מנוחה תרבותית והופעלו תאי CD4 + T נאיביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של RT סטרילי PBS לאט. הערה: בנוסף זהירות והסרת פתרונות מבארות מונע ניתוק של תאים מן coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS ולהוסיף עוד 500 μl PBS להסיר תקשורת ותרבות ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי תוספת של 500 μl מסוננים 4% paraformaldehyde (filtמנת מסיר microparticles שיכול להפריע ניתוח מיקרוסקופיה) דגירה במשך 30 דקות ב RT (מועדף) או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. זהירות: Paraformaldehyde הוא תרכובת רעילה ונפיצה. זה ידוע להיות קרצינוגן אדם. השתמש בזהירות עם פרוטוקול בטיחות מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף לפחות פעמיים עם PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב הבא או לשמור על בארות צלחת עם 500 μl של PBS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד מכתים. הערה: עקרות במהלך תהליך זה עוזר למנוע צמיחה מיקרואורגניזם. </li></ol> 4. מכתים, הרכבה ויזואליזציה ידי מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהבארות. הוסף 500 μl של חיץ חסימה קר (PBS 1x, 0.5% אלבומין בסרום תקן כיתה שור, 1% pH בסרום שור עוברי 7.4). דגירה במשך 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ החסימה בזהירות ולהוסיף הנוגדנים הראשוניים (R24 שיבוט אנטי gangliosides GD3, שיבוט GD2 14G2a),PE מצומדות CD25 אנטי APC מצומדות אנטי TCR ו isotypes שולטת מדולל חסימת חיץ 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 2 שעות על הקרח או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: התסיסה מסלולית איטית עדיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן בזהירות ולהוסיף לאט 500 μl של PBS. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נוגדנים משני (IgG3 אנטי מצומדות FITC עבור GD3 R24 אנטי, Alexa פלואוריד 488 מצומדות או אלקסה פלואוריד 647 מצומדות IgG2a אנטי עבור 14G2a אנטי GD2) מדולל חסימת חיץ 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שעה 1 על הקרח בחושך בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים PBS כמתואר 4.4). שמור את הבארות עם מספיק PBS כדי למנוע התייבשות של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Hoechst 333,258 כתם מדולל PBS ל 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות ב RT ולהסיר. לשטוף שלוש פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות על מגבת נייר ולהוסיף 20 μl של פתרון גובר (גליצרול 50% ב- PBS) או פתרון גובר מסחריים כדי למנוע דהייה מרווה ממדגמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את coverslip עם פינצטה בסדר ומניח אותו על הפתרון הגובר. ודא שהצד של coverslip שבו התאים מחוברים נמצא בקשר עם הפתרון. חותם את coverslips עם לק ולנתח באמצעות קרינה או confocal. </li></ol> בידוד 5. של RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן נוגדני CD3 אנטי (5 מיקרוגרם / מיליליטר) מצופה 96-גם צלחות. דגירה 4 x 10 4 תאים מסוג CD4 + T נאיבי / גם ב 100 μl של המדיום תרבות בתוספת נוגדנים CD28 אנטי (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי להשלים את הגירוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 0 כדי 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פעמים שלאחר הפעלה שונות למקם את התאים לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף מגיב Trizol 1ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב RT ולשמור המדגם ב -8076; C במשך שעה 24 לפחות. המשך עם בידוד RNA בעת הצורך. הערה: השארת המדגם ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות משפרת תשואת RNA. כמו כן, שימוש בכפפות יד חיוני כדי למנוע שפלת RNA על ידי RNases. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את המדגם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 כלורופורם μl ולנער במרץ ביד במשך 30 שניות (כדי למנוע ערבוב אגרסיבי של RNA על ידי vortexing). דגירה 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את השלב המימי לתוך צינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl isopropanol ו להפוך את הצינור שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10 דקות ב RT ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אתנול 75% קר קרח 10 דקות צנטריפוגות ב XG 12,000 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי לבטל את supernatant ומייבשים גלולה RNA על ידי השארת את הכובע של הצינור פתוח. לֹאדואר: בשלב זה הגלול, אינו ברור. המשך בכל זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 20 μl של מי כיתה מולקולריים. חשב את הריכוז וטוהר של חומצות גרעין על ידי מדידת ספיגת 260 ננומטר ו -280 ננומטר באמצעות nanodrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בזהירות סינתזה של cDNA באמצעות כל ערכת transcriptase הפוכה קונבנציונלית בעקבות פרוטוקול manufacturer&#39;s. הערה: כ 0.5-2 מיקרוגרם RNA מתקבל 4 x 10 4 תאים מסוג CD4 + T נאיבי. cDNA ניתן synthetized מ 100 ננוגרם של רנ&quot;א המשמש PCR תגובות בזמן אמת ללא צורך ערכות קלט RNA הנמוך. </li></ol>

<ol><li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tango+to+quadrilla%3A+current+views+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li>
<li>Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+human+CD4%2B+T-cell+population%3A+two+distinct+CD4%2B+T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li>
<li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSOM+%2F+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+%2F+CD3+Mediated+T-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498(2013).</li>
<li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li>
<li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+the+brain%3A+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development%2C+stability%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li>
<li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+na%C3%AFve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li>
<li>Müthing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li>
<li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li>
<li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li>
<li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li>
<li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li>
<li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming%3A+implications+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li>
<li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28GD3+synthase%29+gene+in+human+cancer+cell+lines%3A+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li>
<li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+%28CD60b%29+and+7-O-acetyl-GD3+%28CD60c%29+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li>
<li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD3%2C+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי לבצע לוקליזציה gangliosides או חלבונים השעיות התא של תאי CD4 + T או תאי חיסון אחרים (למשל, PMBCs, איור 5) החל ממספר קטן של תאים. בגלל גודלו הקטן של תאי T ומאפיינים לא חסידים, רכישת תוצאות תמונות מיקרוסקופיות קרינת מידע עני או באיכות נמוכה אם התאים לא ימולאו כראוי. פרוטוקול זה בשילוב עם ניתוח מיקרוסקופיה confocal באיכות טובה הוא יתרון מרכזי על פני...

תאי CD4 + T לתזמר את התגובה החיסונית באמצעות פונקציות המפעיל שלהם לאחר הפעלה על ידי תאי מציגי אנטיגן 1. המחקר של המנגנונים התאיים הם מווסתים במהלך ההפעלה מאפשר תובנה תהליך בסיסי של תפקוד מערכת חיסון. עם זאת, המחקר של תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מסובך, כי הם מייצגים אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים בפריפריה דם 2. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספר דיווחים לומדים את הלוקליזציה של מולקולות שונות מעורבים הפעיל תא T מסוג CD4 +, בעיקר חלבונים הקשורים קרום הפלזמה 3. Gangliosides הם המכילים חומצה sialic glycosphingolipids ולמרות שהם נחקרו רבות בתאי עצב היכן הם נמצאים בשפע, תאים אחרים כגון תאי מערכת החיסון גם להביע gangliosides עם פונקציות רלוונטיות מבחינה ביולוגית 4,5. בעבר דיווחנו that במהלך ההפעלה של תאים אנושיים נאיבי CD4 + T קיימת הגברת הביטוי של α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (synthase GD3) ואת synthase GM2 / GD2, כי לגרום neoexpression משטח משמעותי GD2 ואת הגברת הביטוי של GD3 ganglioside 6. מחקר נוסף של GD3, GD2 ו gangliosides האחר בתאי מערכת חיסוניים יש צורך להשלים נוף חלק המבוסס על חלבונים של תפקוד מערכת חיסון. בדרך כלל, המחקר הביטוי ganglioside מבוסס על טכניקות כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 7, אבל טכניקה זו אינה מאפשרת לוקליזציה המרחבי של gangliosides על הממברנה פלזמה או בתאים subcellular, הגבלת ניתוח ביולוגי. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בתיווך נוגדנים ולוקליזציה של gangliosides GD3 ו GD2 בתאים אנושיים נאיבי CD4 + T ו PBMCs לאחר הפעלת אנטי CD3 / אנטי CD28. עם i זה בפרוטוקול זהגם אפשרי לנתח את הגן והביטוי המולקולרי של gangliosides במספר נמוך של התאים בתרחיף, עם הרכישה של תמונות באיכות גבוהה 6, בהתחשב בגודל קטן של לימפוציטים (9 מיקרומטר).

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp מתקדם;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplemented with 3% FBS</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD3 נוגדן</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 שיבוט</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD28 נוגדן</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 שיבוט</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי GD3&nbsp; נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24</td></tr><tr><td>שיבוט עכבר אנטי אנושי GD2 נוגדן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-53831</td><td>14G2a שיבוט</td></tr><tr><td>מצומד FITC נגד עכבר IgG3 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 מצומד נגד עכבר</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr>נוגדן <td></td><td></td><td></td><td>IgG2a</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 מצומד נגד עכבר</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; נוגדן Tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td> Hoechst 333258 Sigma-Aldrich 861405&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> פיקול פאק-פלוס</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>טריזול ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאי T נאיבית CD4+ II, MACS אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>מיון&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת שקופיות קאמרית Nunc Lab-tek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר (אולימפוס)&nbsp;</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>זקוף BX61WI ו-IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>פריימר רצף קדימה GD3 סינתאז</td><td>5&acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>פריימר רצף הפוך GD3 סינתאז</td><td>5&acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGATAAG-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>פריימר רצף קדימה GM2/GD2 סינתאז</td><td>5&acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>פריימר רצף הפוך GM2/GD2 סינתאז</td><td>5&acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&acute;</td><td></td><td>אסמכתא 7</td></tr></tbody></table>

הכנת cd4<sup&gt; +</sup&gt; t תאים עבור ניתוח של ביטוי gd3 ו gd2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

השיטות שתוארו לעיל לצורך הפעלה של תאים נאיביים CD4 + T השעיה ואת דבקותם ב coverslips לניתוח מיקרוסקופיה confocal לאפשר לוקליזציה מרחבים ובראייה של gangliosides מעורב הפעלת תא CD4 + T, כי ביטוי המשלים פרופיל ניסויים כגון cytometry זרימה, מערבי סופג או בזמן אמת PCR. כימות של ביטוי ganglioside דרך cytometry זרימת לוקליזציה הסלולר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה ניתן להשיג על ידי השימוש של נוגדנים נגד ganglioside עם זיקה גבוהה וספציפי. עם זאת, גידול טיפול הולם של תאים בתרחיף כרוך בטיפול צלחות התרבות לקדם את דבקות הנדרשות עבור קרינה או רכישת מיקרוסקופיה confocal. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לקביעת ביטוי ganglioside GD3 ו GD2 ו colocalization עם TCR במהלך הפעלת CD4 + T תאים נאיבית. כמו כן, אמת tIME PCR ניסויים באמצעות &lt;40,000 תאים מתוארים ביחס קביעת GD3 ו GM2 / GD2 גני synthase, הוכחה כי ניסויים בניתוח גנטי יכול להתבצע עם מספר נמוך של תאים וללא הצורך של ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הופך באיכות טובה של בתרבית ולנוח דבקה והופעלו תאים אנושיים נאיביים CD4 + T (איור 1). התאים מופעל CD4 + T להראות את פרופיל שגשוג מאפיין (איור 1B) בהשוואה למצב המנוחה (איור 1 א). סמן ההפעלה מאוחר CD25 הוא שימושי כדי להעריך את ההפעלה היעילה 72 שעות נצפו על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 1 ג). סמן CD69 משמש כיום כסמן הפעלה מוקדם על ידי ...

אנו מתארים פרוטוקול מכתים נוגדן תקן לשימוש במיקרוסקופ כדי לקבוע את ביטוי הקרום ולוקליזציה של gangliosides ב מנוחה ותאי T מסוג CD4 + נאיביים אדם הופעל. כמו כן תארו הם ניסויים בזמן אמת באמצעות PCR &lt;40,000 תאים שאינם דורשים ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

הכנת CD4<sup&gt; +</sup&gt; T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנת תרחיף תאי CD4+T לצורך צביעה להדמיית מיקום הגנגליוזידים GD3 ו-GD2 על פני השטח של התא, תוך שימוש במספר נמוך של תאים. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של גליקוליפידים ממברנתיים במספר נמוך של תאי תרחיף קטנים, כפי שקורה במקרה של תאים מונונוקלאריים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להעריך את הביטוי והמיקום של גנגליוזידים בכמויות קטנות של תאי CD4+T באמצעות אופטימיזציה של השימוש בדגימה.ההשלכות של טכניקה זו עשויות להתרחב למחקר ואבחנה של סוגים מסוימים של לוקמיה של תאי T. כפי שמצאנו, קווי תאים של לוקמיה מסוימים מראים ביטוי מוגבר של גנגליוזידים GD3 ו-GD2. התחילו בדילול של שני מיליליטר של דם פריפרי שנתרם מתורמים אנושיים בריאים עם שני מיליליטר של PBS EDTA סטרילי.שפוך באיטיות את הדם המדולל מעל שלושה מיליליטר של תמיסת סוכרוז בריכוז 1.077. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-250 ×g בטמפרטורה של 21 °C ללא בלימה (no break), כדי ליצור את מדרג הריכוזים של תאי דם לבנים מונונוקליאריים פריפריים (PBMCs). לאחר הסבב בצנטריפוגה, ניתן להבחין ב-PBMCs בבירור כטבעת לבנה.אספו את ה-PBMCs באמצעות פיפטה והעבירו לשפופרת סטרילית לשטיפה. לאחר שטיפת התאים ב-PBS EDTA, טהרו תאי Naive CD4+T על ידי סלקציה שלילית באמצעות חרוזים מגנטיים, תוך שימוש בערכה זמינה מסחרית. לאחר שהושג

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך זה מדגים את טיהור בהרחבת במבחנה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים מדם היקפי שלם להדמיה שלהם באמצעות MHC בכיתה tetramers השנייה. Tetramers לאפשר הדמיה ישירה של תאים T עם סגוליות לאנטיגן יחיד ומוגדר הגבלה MHC Class II.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

סרטון זה מדגים את התמיינות החוץ גופית של גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה או תאי T מסייעים מייצרי GM-CSF (THGM). תאי T נאיביים מבודדים עוברים גירוי לצורך התמיינות ל-THGM, אשר מאושר על ידי זיהוי ייצור GM-CSF תוך-תאי גבוה וביטוי נמוך של ציטוקינים ספציפיים אחרים לתאי T עוזרים.

טכניקת In Vitro להבדיל בין GM-CSF המייצרים תאי T מסייעים לבין תאי T נאיביים

סרטון זה מדגים את ההקרנה של תרכובות אימונומודולטוריות באמצעות בדיקה מבוססת פלורסנט. לימפוציטים T שמקורם בעכבר מהונדס עם קלטות ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק מטופלים בתרכובות אלה. אותות ה-GFP המשופרים והמופחתים מאפשרים לזהות את ההשפעות הממריצות והמעכבות של התרכובות, בהתאמה.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

סרטון זה מדגים בדיקה לניתוח תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בשלבי מחזור תאים שונים. תאים ברי קיימא בעלי תווית פלואורסצנטית נבחרים באמצעות ציטומטריית זרימה, והתאים בשלבי מחזור התא השונים מזוהים על ידי תכולת הדנ"א שלהם באמצעות נוגדנים כנגד חלבון גרעיני הקשור להתרבות תאים וכתם חומצת גרעין.

בדיקה לניתוח מחזור התא של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T...

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

מקרופאגים הם תאי פלסטיק של מערכת hematopoietic כי יש תפקיד מכריע בחסינות מגן הומיאוסטזיס. בדו"ח זה, אנו מתארים אופטימיזציה של טכניקות חוץ גופית כדי phenotypically ופונקציונלית לאפיין להשתלשלים מסתננים מקרופאגים תקינה המצטברים באיבר המושתל בתנאים סובלני.

אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות

אנו מתארים כאן שיטת בידוד להשגת לימפוציטים תוך-אפיתליאליים אנדו-צוואריים אנושיים לניתוח תאי T גמא דלתא תוך-אפיתליים. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לטיהור תאי T גמא דלתא אנדו-צוואריים על ידי חרוזים מגנטיים או על ידי מיון תאים.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

גנגליוסידים הם גליקוספינגוליפידים נושאי חומצה סיאלית הנמצאים בשפע במיוחד במוח. טבעם האמפיפתי דורש טכניקות מיצוי וטיהור אורגניות/מימיות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית וניתוחים מדויקים. מאמר זה מספק סקירות כלליות של מיצוי גנגליוסיד בקנה מידה אנליטי ומכין, טיהור, וניתוח כרומטוגרפיה שכבה דקה.

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

למד הכנת תאי CD4+ T לצביעת GD3 ו-GD2 ganglioside בממברנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גליקוליפידים בכמות קטנה של תאים, עם יישומים במחקר לוקמיה של תאי T.

הכנת CD4

גלה סרטונים נוספים