במבחנת ההקלטה של פעילות עצבית Mesenteric מביא עכבר Jejunal ופלחים גסים
25 באוקטובר 2016
עצבים אפרנטיים מזנטרי מעבירים מידע ממערכת העיכול לכיוון המוח לגבי הומאוסטזיס תקין כמו גם פתופיזיולוגיה. ניתן להעריך את פעילות העצב האפרנטי במערכת העיכול על ידי הרכבת מקטעי מעיים מבודדים עם עצבים אפרנטיים מחוברים לאמבט איברים, בידוד העצב והערכת פעילות בסיסית כמו גם מגורה.
המטרה הכללית של טכניקה זו היא להקליט in vitro פעילות של עצבים אפרנטים ספלנכיים (splanchnic) מאגורת עצבים בודדת של התריסריון (jejunum) או המעי הגס, בתגובה להרחבות הדרגתיות (ramp distensions) ולהחלת תרכובות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון השאלה האם עצבים אפרנטים המזינים את מערכת העיכול נמצאים במצב של רגישות יתרה או רגישות מופחתת במהלך מצבי מחלה שונים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת הקלטה של פריקה עצבית in vitro ומאפשרת לכמת את הפעילות העצבית ללא מודולציה או קלטים ממערכת העצבים המרכזית.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחנה של מספר תסמונאות כאב, כגון תסמונת המעי הרגיז, מאחר שרגישות עצבית ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקושי, שכן הדיסקציה של צרורות עצבים וניתוח היחידה הבודדת של האות המוקלט דורשים כמות ניכרת של אימון. כדי להתחיל בהליך זה, הנח את העכבר לאחר ההקרבה בתנוחת שכיבה על הגב.
בצעו חתך קו אמצע בבטן דרך העור ושכבת שרירי הבטן באמצעות סכין מנתחים, מהתהליך השיסוי (xiphoid process) ועד לעצם הפוביס. לאחר מכן, שטפו את חלל הבטן בתמיסת Krebs קרה כדי למנוע התייבשות של הרקמות התוך-בטניות. לאחר מכן, הכסירה במהירות את כל המעי הצורב (jejunum) באמצעות מספריים חדים, על ידי הסרה של כ-20 centimeters של המעי הדק, החל מיד מהכיפוף הדואודנו-ג'גונלי (duodenojejunal flexure).
הקפידו לא לפגוע במבנים מסביב, ושמרו על שלמות גרידי המעי, המכילים את כלי הדם והעצבים האפרנטים של התריסריון. לאחר מכן, הניחו את התריסריון שהוצא בתוך תמיסת Krebs קרה על קרח, תוך חממנה ברציפות בחמסן Carbigen. לאחר מכן, חתכו את התריסריון ללולאות באורך של כ-3 סנטימטרים.
אתר את הצרור המזנטרי המכיל את כלי הדם ואת העצב הספלנכי (splanchnic nerve)הקרוב למרכז הלולאה הרלוונטית, כדי להקל על קיבוע הלולאה בתא ההקלטה. לאחר מכן, שטוף כל מקטע בתמיסת Krebs באמצעות קטטר קהה להסרת התוכן הלומנלי והכימוס, שכן אלו מכילים אנזימי עיכול שיאיזו את התדרדרות דגימת הרקמה in vitro. לאחר מכן, בחר מקטע למדידת הפעילות של העצב האפרנטי והנח אותו בתא ההקלטה המצופה בשכבת אלסטומר סיליקוני.
שמרו על טמפרטורת תמיסת קרבס בתא ההקלטה ב-34 degrees Celsius. לאחר מכן, קבעו את מקטע היהנום באמבט האיברים, כך שהקצה הפהי מחובר למניע המזרק המספק זרימה לומנלית והקצה האבוראלי מחובר למערכת הניקוז. מתוח את המקטע קלות, אך הקפידו שלא להפעיל מתיחה מופרזת.
הקפידו להצמיד את שני הקצוות בחוזקה לפתחי הכניסה והיציאה באמצעות ליגטורות משי. לאחר מכן, חברו את מזרק הדחיפה (syringe driver) לקצה האוראלי ובצעו פרפוזיה תוך-לומית של מקטע היהנום (jejunal segment) באמצעות תמיסת Krebs בקצב של 10 milliliters לשעה. קבעו את הגריסה (mesentery) של מקטע המעי המותקן באופן שטוח אל שכבת התחתית של האלסטומר מסיליקון.
לאחר מכן, מתוחו את המזנטריום (הקרום המעי) כדי להבטיח ויזואליזציה אופטימלית של הצורר המזנטרי. כעת, בצעו בדיקה של התפשטות מדורגת על ידי סגירת יציאת הנוזלים עד שהלחץ האינטראלומנלי של מקטע המעי מגיע ל-60 millimeters of mercury, וזאת כדי לוודא שאין דליפה של תמיסת Krebs מהמקטע המותקן. שימו לב לעלייה חלקה בלחץ האינטראלומנלי ללא הפרעות.
צפו בהתכווצויות קטנות של המקטע במהלך שלב ההרחבה הראשוני. במידת הצורך, חסמו את הפעילות הפריסטלטית על ידי הוספת מיקרומול אחד של nifedipine, חוסם תעלות סידן מסוג L, לתמיסת ה-Krebs. תחת מיקרוסקופ סטריאו, התחילו לקלף בעדינות את רקמת השומן מהקרומים (mesentery) על ידי משיכה עדינה בעזרת שתי פינצטות קטנות, תוך הקפדה שלא לפגוע בכלי הדם ובנרב האפרנטי (afferent nerve) הטמונים ברקמת השומן.
התחילו בקילוף רקמת השומן במרחק מהמעי הצם (jejunum) כדי לחשוף את שני כלי הדם בצרור הגריס (mesenteric bundle). זהו את עצב ה-jejunum האפרנטי בין שני כלי הדם כחוט לבן דק העטוף ברקמת שומן. לאחר מכן, בצעו דיסקציה באופן פרוקסימלי יותר לכיוון המעי הצם על ידי קילוף עדין של רקמת השומן באמצעות פינצטה.
בשלב הבא, נתחו את עצב המזנטרי של ת'נאי (jejunal mesenteric nerve) של המקטע על ידי הסרת הרקמה השומנית הדבקה לעצב. חתכו את העצב באמצעות מספרי רקמה חדים. במידת הצורך, קלפו את השומן ורקמת החיבור שנותרו, cũng כמו את מעטפת העצב (epineural sheath), על ידי משיכה עדינה.
בפרוצדורה זו, השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להוריד את קצה אלקטרודת השאיבה אל תוך אמבט האיברים. לאחר מכן, שאבו בעדינות כמות קטנה של תמיסת Krebs מאמבט האיברים, כך שקצה האלקטרודה יהיה טבול בתמיסת ה-Krebs. ודאו שתמיסת ה-Krebs מכסה את אלקטרודת התיל שבתוך אלקטרודת השאיבה.
בשלב הבא, מקמו את קצה אלקטרודת השאיבה בסמיכות מיידית לחוט העצב האפרנטי שנקטע, ושאבו את חוט העצב הקטוע אל תוך הנימי לכל אורכו. הזיזו את קצה האלקטרודה לעבר הרקמה השומנית, ושאבו אותה אל תוך הנימי הזכוכית באמצעות הבוכנה, ובכך תאטמו באופן מכני את העצב בתוך הנימי מהתכני של אמבט האיבר. איטום הולם של נימי הזכוכית מתא ההקלטה, באמצעות שאיבת מעט רקמת שומן סביבה אל תוך הנימי, הוא קריטי על מנת למזער את רעש הרקע המיותר שיפריע בסופו של דבר לניתוח הסופי.
כדי לאמת את רישום הפעילות של העצב האפרנטי, בצעו עלייה בפריקה האפרנטית המושראת על ידי התפשטות רמפ (ramp distension) באמצעות סגירת פתח היציאה, כדי להוביל לעלייה הדרגתית בלחץ במקטע המעי. בצעו את הפרוטוקול הניסויי הרצוי רק כאשר שלוש התפשטויות רמפ רצופות מניבות פריקה רב-יחידתית (multi-unit discharge) הניתנת לשחזור. לאחר בידוד העצב, ייצבו את הדגימה למשך 15 דקות כדי להשיג פעילות עצבית אפרנטית ספונטנית ויציבה לפני ביצוע הניסויים בפועל.
כאן מוצג ייצוג סכימטי של יחידות סיבים אפרנטיות שונות, על בסיס הפרופיל המכנו-סנסורי שלהן. סיבים בעלי סף נמוך (Low threshold) מראים בעיקר פעילות עצבית מוגברת בלחצי התפשטות נמוכים, מה שמוביל לאחוז LT של מעל 55%. לעומתם, יחידות בעלות סף גבוה (High threshold) מראות עלייה בקצב הפריקה רק בלחצים המעוררים כאב (noxious pressures). סיבים בעלי טווח דינמי רחב (Wide dynamic range) מראים עלייה הדרגתית בפעילות העצבית לאורך כל ההתפשטות, בעוד שסיבים שאינם רגישים מכנית אינם מגיבים ללחצי התפשטות עולים.
איור זה מציג את פריקת העצב האפרנטי המזנטרי בעכברים מסוג wild type במהלך התפשטות מדורגת (ramp distension). שימו לב שבפרופיל התפשטות דו-פאזי, העלייה הראשונית בפריקת העצב נובעת מסיבים בעלי סף נמוך וטווח דינמי רחב, בעוד שסיבים בעלי סף גבוה וטווח דינמי רחב תורמים לעלייה השנייה בפריקה. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע את בידוד עצב התריסריון ואת הקלטת קו הבסיס הראשונית בפחות משעה, אם התהליך מבוצע כראוי.
נדרש זמן נוסף בעת חקר השפעת תרכובות המוגשות לאמבט האיברים. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על גישה סטנדרטית ומודגשת, כגון זיהוי עקבי של אותו מקטע עבור כל הניסויים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בידוד של ganglion של השורש האחורי (dorsal root ganglia) עם דימות סידן (calcium imaging) בעקבותיו, וזאת כדי להעריך אילו תחנות ממסר במערכת העצבים הגסטרו-אינטסטינלית מעורבות בפתוגנזה של מספר מחלות.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצבים לחקור את הפתוגנזה של מספר תסדרומי כאב במחקרים על מערכת העיכול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים עצבים אפרנטיים של התריסריון (jejunal afferent nerves) ממערכת העיכול של עכבר, וכיצד מקליטים מהם פעילות במהלך התרחבות הדרגית (ramp distensions).
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בטכניקה להקלטה in vitro של פעילות עצבים אפרנטיים ספלנכיים (splanchnic afferent nerve) מאגודות עצבים של התריסון (jejunum) או המעי הגס. השיטה מעריכה תגובות עצביות להתרחבויות מדורגות (ramp distensions) ולהגשות של תרכובות, ובכך מספקת תובנות לגבי תפקוד העצבים במערכת העיכול במצב בריאותי ובמצב מחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- גסטרואנטרולוגיה
- פיזיולוגיה
רקע
- עצבים אפרנטיים מזנטריים מעבירים מידע ממערכת העיכול למוח.
- עצבים אלו מעורבים בשמירה על הומאוסטזיס ובתגובה למצבים פתופיזיולוגיים.
- הבנת פעילותם עשויה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפול בתסמונאות כאב.
- דיסקציה וניתוח של צרורות עצבים דורשים הכשרה מיוחדת.
מטרת המחקר
- להקליט פעילות של עצבים אפרנטיים בתגובה לגירויים מכניים וכימיים.
- לקבוע אם עצבים אפרנטיים של מערכת העיכול נמצאים במצב של רגישות יתר (hypersensitized) או רגישות מופחתת (desensitized) במצבי מחלה.
- לבחון השלכות על אבחון וטיפול במצבים כגון תסמויי מעי רגיש (irritable bowel syndrome).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד מקטעי מעי עם עצבים אפרנטיים צמודים.
- הצבה באמבט איברים להערכת פעילות עצבית.
- הקלטה של פעילות עצבית בסיסית ומעוררת.
- החלת הרחבות הדרגתיות (ramp distensions) ותרכובות שונות.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת כימות של פעילות עצבית ללא מודולציה של מערכת העצבים המרכזית.
- היא מספקת תובנות לגבי תפקידה של רגישות עצבית בהפרעות גסטרו-אינטסטנליות.
- הדרכה היא חיונית להצלחה בדיסקציה ובניתוח של צרורות עצבים.
- השיטה יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במדעי המוח בנוגע לתפקוד עצבי.
מסקנות
- טכניקה זו בעלת ערך למחקרי פעילות של עצבים אפרנטיים במערכת העיכול.
- יש לה השפעות פוטנציאליות על הבנתם וטיפולם של תסמונאות כאב.
- מחקרים נוספים עשויים לשפר את הבנתנו לגבי התנהגות עצבים במצבי מחלה שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו מאפשרת מדידה ישירה של פעילות עצבים אפרנטים פריפריים במקטעי מעי מבודדים, ובכך מספקת מודל רדוקציוני להערכת מנגנוני רגישות נוירונלית הרלוונטיים לתסמונות של כאב ויסרלי. על ידי בידוד האותות האפרנטים ממודולציה של מערכת העצבים המרכזית, היא תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מנגנוניים בתוכניות גילוי מוקדמות המתמקדות בנוירומודולציה של מערכת העיכול. גישה זו מציעה רציפות תרגומית ממודלים של מכרסמים לרקמה אנושית, ובכך מקלה על אישור מטרות בין-מיני ועל ביטחון חיזוי בפיתוח תרופות משככות כאבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנוגע לרגישות יתר של עצבים אפרנטיים במסלולי כאב ויסרלי.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של עצבים אפרנטיים מזנטריים כמטרות תרופתיות באופן בלתי תלוי בפיצוי מרכזי.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי הבחנה בין תרכובות המווסתות רגישות פריפרית לבין אלו הדורשות מעורבות מרכזית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר קריאות כמותיות של פריקה עצבית רב-יחידתית בתגובה להתרחבות הדרגתית (ramp distension) ואתגר פרמקולוגי.
- שחזור: דורש בחירה סטנדרטית של מקטעים ותקופות ייצוב כדי להבטיח פעילות בסיס עקבית בין ניסויים שונים.
- מדרגיות: תואם לסריקת תרכובות בפורמט של אמבט איברים (organ bath) לצורך בניית פרופיל תגובה למינון של נוירומודולטורים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מדמה באופן ישיר מנגנונים של רגישות יתר ויסצרלית ב-IBS ובתסמונאות כאב קשורות.
- מקשר דפוסי פריקה אפרנטים לסוגי תסיבי סיבים מכנו-סנסוריים (סף נמוך, טווח דינמי רחב) כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים למצב של סנסיטיזציה.
- תומך בהערכה של שינויים עצביים המושרים על ידי המחלה באמצעות על-נוזלים (supernatants) מחולי IBS או באמצעות אתגר LPS.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד תרומות של עצבים פריפריים לפני מעבר לבדיקות התלויות ב-CNS.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת קריאות תפקודיות בשלב מוקדם המנחות החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) לפני השקעה משמעותית בכימיה רפואית או במחקרי יעילות in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: בודק האם תרכובות מועמדות משנות את עירור העצבים האפרנטיים בהקשרים מכניים או דלקתיים הרלוונטיים למחלה.
- סריקה: מספקת מדידות הדירות וכמותיות של פעילות עצבית המאפשרות ניתוח של קשרי מבנה-פעילות עבור כימוטיפים נוירומודולטוריים.
- אנליטיקה: מספקת תדירות פריקה ותגובות ספציפיות לסוגי סיבים המאפשרות ניתוח השוואתי של השפעות התרכובות במצבים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים במכרסמים לישימות ברקמות אנושיות, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים ובתיקוף מטרות בין מינים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת נוירומודולטורים פריפריים במגוון אינדיקציות למערכת העיכול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד תרומות אפרנטיות פריפריאליות לאותות ויסצרליים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של נהלי בידוד והקלטה של עצבים כדי למזער שונות בין מעבדות בנתוני מעורבות המטרה.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בהחלטות go/no-go על ידי אישור מודולציה של המטרה ברמה הנוירונלית הפריפריאלית.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכון של תרכובות המדגימות השפעות סלקטיביות על מסלולים אפרנטיים רגישים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה מיקרו-כירורגית של צרורות עצבים מזנטריים וברכישת אותות אלקטרופיזיולוגיים.
- תלוי בתשתית של אמבט איברים הכוללת בקרת טמפרטורה, מערכות פרפוזיה ומניפולציה של אלקטרודות יניקה.
- נדרש סטנדרזציה בין-צוותית של בחירת המקטעים, תקופות הייצוב ופרוטוקולי התפחות להשגת תוצאות הדירות.
- שיקולי התאמה כוללים את האנטומיה של העצבים הספציפית למין ואת חיוניות הרקמה בעת מעבר ממקטעי מעי גס של עכבר למקטעים אנושיים.
- מגבלות מעשיות כוללות את האתגר הטכני של ניתוח יחידה אחת (single-unit analysis) ואת הצורך לתקף ממצאים בתחנות ממסר נוירונליות משלימות (למשל, גנגליון השורש האחורי, חוט השדרה) להבנה מלאה של המסלול.
