קביעת פוטנציאל זטה באמצעות Nanoparticle טרנסלוקציה מהירויות באמצעות nanopore מתכוונן: באמצעות חלקיקים שונה-DNA כמשל

המטרה הכללית של נוהל זה היא לאפיין את הכימיה של פני השטח של ננו-חלקיקים באמצעות חישוב התנגדות משתנה לאחר חישוש, או TRPS, ולקבוע את פוטנציאל הזטא של החומר. הדבר מודגם באמצעות אפיון של ננו-חלקיקים המודגמים ב-DNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח באפיון של ננו-חומרים ובפיתוח של בדיקות ביולוגיות (bioassay).

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבצע ניתוח של כל חלקיק בנפרד. כל אות של חלקיק DNA מתורגם למדידה של פוטנציאל זטא, מה שמעניק תמונה מלאה של הדגימה המנותחת. השיטה הוותיקה ביותר יכלה לספק תובנות לגבי אפיון של חומרים.

ניתן ליישם זאת גם ביישומים אחרים, כגון פיתוח של בדיקה ביולוגית (bioassay) לזיהוי תאים, נגיפים, DNA וחלבונים. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה יתקשה בביצועה, כיוון שלא מדובר בתהליך פשוט של הזרקת הדגימה והמתנה לתשובה. נדרשת מעורבות פעילה של המדען בתהליך.

כדי להתחיל בהליך זה, ערבבו במערבל Vortex חלקיקים מצופים בסטריפטאבידין למשך 30 שניות לפני ביצוע סוניקציה למשך שתי דקות בהספק של 80 וואט כדי להבטיח פיזור אחיד (monodispersity). דללו את החלקיקים מצופים בסטריפטאבידין ביחס של 1:100 בבופר PBST כדי להגיע לריכוז סופי של 10⁹ חלקיקים למילליטר. לאחר מכן, ערבבו את החלקיקים במערבל Vortex למשך 30 שניות.

בהתבסס על קיבולת קישור של 4,352 picomols למיליגרם בריכוז המתאים של DNA לחלקיקים, עבור ריכוזים סופיים של 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 ו-210 nanomolar. לאחר ערבוב של הדגימות במכשיר vortex למשך 10 שניות, הנח אותן על גלגל סיבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-DNA להיקשר לפני השטח של החלקיקים באמצעות אינטראקציית streptavidin biotin. לאחר שה-DNA הנלכד הוסף ודגר יחד עם החלקיקים, הסר את עודפי ה-DNA והתמיסה באמצעות הפרדה מגנטית על ידי הנחת הדגימות על מעמד מגנטי למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע לצבר החלקיקים שנוצר acabado, הסמוך למגנט. לאחר מכן, החליפו את הנוזל העליון בנפח זהה של בופר PBST טרי. כעת, הוסיפו לכל דגימה את הכמות הנדרשת של DNA המטרה כדי להבטיח הגעה למקסימום קישור אפשרי של המטרה.

ערבבו את הדגימות במכשיר וורטקס (Vortex) למשך 10 שניות, והניחו אותן על גלגל סיבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. עם השלמת ההיברידיזציה, הסירו את עודפי ה-DNA של המטרה באמצעות הפרדה מגנטית על ידי הנחת הדגימות על מעמד מגנטי למשך 30 דקות.

כעת הסר את הנוזל העליון, תוך הקפדה לא להפר את מקבץ החלקיקים שנוצר acabado, הקרוב ביותר למגנט. לאחר מכן, החלף את הנוזל העליון בנפח זהה של באפר PBST טרי. לאחר חזרה על השלבים הקודמים עבור דגימות כפולות, הנח את הדגימות על גלגל סיבוב בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות כדי לבחון זמני היברידיזציה של DNA.

בשלב זה, חברו מכשיר TRPS למערכת מחשב המותקנת בה התוכנה. בעזרת קליפר, מדדו את המרחק בין החלק החיצוני של שתי לסנאות מקבילות. הקלידו את המרחק בשדה המתיחה (stretch) בלשונית הגדרות המכשיר ולחצו על כיול מתיחה (calibrate stretch) מתחת ללשונית.

לאחר מכן, התאימו באופן צדי למלקחיים ממבנה nanopore פוליאורתן בגודל המתאים לניתוח, כאשר מספר הזיהוי של ה-nanopore פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מתחו את הלסתים לרמת המתיחה הנדרשת לניתוח באמצעות ידית כיוון המתיחה שבצד המכשיר. העבירו 80 µL של תמיפת PBST לתא הנוזלים התחתון מתחת ל-nanopore, תוך וידוא שאין בועות שעלולות להשפיע על המדידה.

כעת לחצו את תא הנוזלים העליון למקומו והוסיפו 40 µL של בופר, תוך וידוא שאין בועות. לאחר מכן, הניחו כלוב פאראדיי מעל המערכת והפעילו לחץ חיצוני כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הוספת 40 µL של חלקיקי כיול לתא הנוזלים העליון, בצעו מדידת TRPS בשלושה מתחים מופעלים.

שנו את המתח על ידי לחיצה על כפתורי הפלוס והמינוס בסולם המתח בלשונית הגדרות המכשיר בתוכנה. ודאו ששלושת המתחים מחזירים את זרמי הרקע המתאימים. וכן ודאו שבמתח הבינוני, חלקיקי הכיול מייצרים עוצמת חסימה ממוצעת של לפחות 0.3 nanoamperes.

לאחר השגת התנאים המפורטים בפרוטוקול הכתוב, התחילו את ההרצה על ידי לחיצה על start בתוכנה בלשונית רכישת הנתונים (data acquisition). כדי להשלים את המדידה, לחצו על stop בלשונית רכישת הנתונים ושמרו את קובץ הנתונים. שטפו את המערכת על ידי החלפת חלקיקי הכיול ב-40 µL של בופר PBST בתאי הנוזלים העליונים מספר פעמים.

ויש להפעיל לחצים שונים עד שלא יופיעו יותר אירועי חסימה, כדי להבטיח שאין חלקיקים שביעותים ושאין זיהום צולב. לאחר השגת זרם הבסיס המתאים, החליפו את האלקטרוליט בתא הנוזלים העליון ב-40 µL של דגימה. התחילו את הרצת הדגימה על ידי לחיצה על start בלשונית רכישת הנתונים.

הקליטו לפחות 500 חלקיקים והבטיחו שזמן ההרצה הוא לפחות 30 שניות. כדי להשלים את המדידה, לחצו על stop בלשונית רכישת הנתונים (data acquisition) ושמרו את קובץ הנתונים. כאן מוצגת דוגמה לניתוח גודל ופוטנציאל זטא של חלקיקים מצופים בסטראפטווידין ללא שינויים, ושל חלקיקים מצופים בסטראפטווידין שרוויים ב-DNA גדיל אחד על פני השטח.

למרות ששני הדגימות היו בגודל דומה, פוטנציאל הזטא היה שונה באופן משמעותי וגבוה בהרבה כאשר ה-DNA פונקציונליז ב bề mặt החלקיק. נתוני הגודל ופוטנציאל הזטא עבור דגימות עם הריכוזים הנמוך והגבוה ביותר של DNA שהיבריד עם החלקיקים המצופים בסטRepartitionסטאווידין מוצגים כאן. ערך פוטנציאל זטא גבוה יותר נרשם עבור חלקיקים שהיברידו עם ריכוז גבוה יותר של DNA.

השינוי בפוטנציאל זטא שנמדד עבור DNA גשש לתפיסה בלבד, מטרה של DNA משלימה לחלוטין, מטרה של DNA עם קישור במרכז, מטרה של DNA עם קישור בקצה ומטרה של DNA עם קצה בולט, מוצג כאן. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-20 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ניסיון לבצע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשטוף ביסודיות את הננו-נקב בין כל כיול ודגימה כדי להבטיח שאין זיהום צולב בין הדגימות ולמנוע חסימה של הננו-נקב.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביו-חיישנים לבחון אינטראקציות בין חלבון לחלבון ובין חלבון ל-DNA במערכי בדיקה מרובי-סממנים (multiplex assays). לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן קבלת פוטנציאל זטא באמצעות TRPS והכנת חלקיקים שעברו שינוי עם DNA עבור בדיקות ביולוגיות.