קביעת פוטנציאל זטה באמצעות Nanoparticle טרנסלוקציה מהירויות באמצעות nanopore מתכוונן: באמצעות חלקיקים שונה-DNA כמשל
26 באוקטובר 2016
כאן אנו משתמשים nanopore מתכונן פוליאוריטן משולבים טכניקה חישה הדופק resistive לאפיין כימיה של פני השטח חלקיקים באמצעות מדידת מהירויות טרנסלוקציה החלקיקים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הפוטנציאל זטא של חלקיקים בודדים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין את כימיית פני השטח של חלקיקי ננו באמצעות חישת פוסט עמידה מתכווננת, או TRPS, ולקבוע את פוטנציאל הזטה של החומר. זה מדגים על ידי אפיון חלקיקי ננו שעברו שינוי DNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באפיון ננו-חומרים ופיתוח ביו-מבחן.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשלים חלקיקים על ידי ניתוח חלקיקים. כל אות של חלקיק DNA מתורגם למדידת פוטנציאל זטה, ומספק תמונה מלאה של הדגימה המנותחת. השיטה העתיקה ביותר יכולה לספק תובנה לגבי אפיון החומרים.
ניתן ליישם אותו גם ביישומים אחרים, כגון פיתוח ביו-מבחן לזיהוי תאים, וירוסים, DNA וחלבונים. בדרך כלל, אדם חדש בשיטה זו יתקשה מכיוון שזה לא פשוט להזריק את ה-samp ואז לחכות לתשובה. יש צורך בקלט כלשהו מהמדען.
כדי להתחיל בהליך זה, מערבולת סטרפטווידין ציפתה חלקיקים למשך 30 שניות לפני סוניקציה למשך שתי דקות ב-80 וואט כדי להבטיח פיזור מונו. לדלל את החלקיקים המצופים סטרפטווידין אחד למאה במאגר PBST כדי להשיג ריכוז מתקבל של אחד כפול עשרה עד תשעת החלקיקים למיליליטר. ואז מערבל את החלקיקים למשך 30 שניות.
מבוסס על יכולת קשירה של 4,352 פיקומול למיליגרם בריכוז המתאים של DNA לחלקיקים לריכוזים המתקבלים של 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 ו-210 ננו-מולר. לאחר מערבולת הדגימות במשך 10 שניות, הנח אותן על גלגל סיבובי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-DNA להיקשר למשטחי החלקיקים באמצעות אינטראקציה של סטרפטווידין ביוטין. לאחר הוספת ה-DNA שנלכד והדגירה עם החלקיקים, הסר את עודפי ה-DNA והתמיסה באמצעות הפרדה מגנטית על ידי הנחת הדגימות על מתלה מגנטי למשך 30 דקות.
לאחר מכן, הסירו את הסופרנטנט, והקפידו לא להפריע לצביר החלקיקים החדש שנוצר, הקרוב ביותר למגנט. לאחר מכן החלף את הסופרנטנט באותו נפח של מאגר PBST טרי. כעת הוסף את הכמות הנדרשת של DNA מטרה לכל דגימה כדי להבטיח את קשירת המטרה המקסימלית האפשרית.
מערבולת את הדגימות למשך 10 שניות. והניחו אותם על הגלגל הסיבובי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר השלמת ההכלאה, הסר את עודף ה-DNA של המטרה באמצעות הפרדה מגנטית על ידי הנחת הדגימות על המדף המגנטי למשך 30 דקות.
לאחר מכן הסר את הסופרנטנט, תוך הקפדה לא להפריע לצביר החלקיקים החדש שנוצר, הקרוב ביותר למגנט. לאחר מכן החלף את הסופרנטנט באותו נפח של מאגר PBST טרי. לאחר חזרה על השלבים הקודמים עבור דגימות כפולות, הנח את הדגימות על הגלגל הסיבובי בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות כדי לחקור את זמני הכלאת ה-DNA.
בשלב זה, חבר מכשיר TRPS למערכת מחשב עם תוכנה במקום. בעזרת מחוגה מודדים את המרחק בין החלק החיצוני של שתי לסתות מקבילות. הקלד את המרחק בשדה המתיחה בלשונית הגדרות המכשיר ולחץ על כיול מתיחה מתחת ללשונית.
לאחר מכן, התקן לרוחב קרום ננו-נקבוביות פוליאוריטן בגודל מתאים לניתוח על הלסתות כאשר מספר הזיהוי של הננו-נקבוביות פונה כלפי מעלה. לאחר מכן מתחו את הלסתות למתיחה הנדרשת לניתוח באמצעות ידית כוונון המתיחה בצד המכשיר. הנח 80 מיקרוליטר של מאגר PBST בתא הנוזל התחתון מתחת לננו-נקבוביות, וודא שאין בועות שעלולות להשפיע על המדידה.
כעת לחץ על תא הנוזל העליון למקומו והוסף 40 מיקרוליטר של מאגר, וודא שאין בועות. לאחר מכן הניחו כלוב פאראדיי מעל המערכת והפעילו לחץ חיצוני כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הנחת 40 מיקרוליטר מחלקיקי הכיול בתא הנוזל העליון, השלם מדידת TRPS בשלושה מתחים מופעלים.
שנה את המתח על ידי לחיצה על כפתורי הפלוס והמינוס בסולם המתח בכרטיסיית הגדרות המכשיר בתוכנה. בדוק ששלושת המתחים מחזירים את זרמי הרקע המתאימים. וודא שבמתח הבינוני, חלקיקי הכיול מייצרים גודל חסימה ממוצע של לפחות 0.3 ננו-אמפר.
לאחר שהושגו התנאים המתוארים בפרוטוקול הטקסט, התחל את הריצה על ידי לחיצה על התחל בתוכנה בכרטיסייה רכישת נתונים. להשלמת המדידה, לחצו על 'עצירה' בכרטיסייה 'רכישת נתונים' ושמרו את קובץ הנתונים. שטפו את המערכת על ידי החלפת חלקיקי הכיול ב-40 מיקרוליטר עם מאגר PBST לתאי הנוזל העליונים מספר פעמים.
והפעלת לחצים שונים עד שלא יהיו אירועי מצור נוספים, כדי להבטיח שאין חלקיקים שיוריים ואין זיהום צולב. לאחר השגת זרם הבסיס המתאים, החלף את האלקטרוליט בתא הנוזל העליון ב-40 מיקרוליטר דגימה. התחל את הריצה לדוגמה על-ידי לחיצה על התחל בכרטיסייה רכישת נתונים.
רשום מינימום של 500 חלקיקים וודא שזמן הריצה הוא מינימום 30 שניות. להשלמת המדידה, לחצו על 'עצירה' בכרטיסייה 'רכישת נתונים' ושמרו את קובץ הנתונים. דוגמה לניתוח גודל ופוטנציאל זטה של חלקיקים מצופים סטרפטווידין ללא שינויים וחלקיקים מצופים סטרפטווידין רוויים ב-DNA חד-גדילי על פני השטח מוצגת כאן.
למרות ששתי הדגימות היו בגודל דומה, פוטנציאל הזטה היה שונה משמעותית וגדול בהרבה כאשר ה-DNA התפקד על פני החלקיקים. נתוני הגודל ופוטנציאל הזטה המוצגים עבור דגימות עם הריכוזים הנמוכים והגבוהים ביותר של DNA הכלאה לחלקיקים מצופים סטרפטווידין מוצגים כאן. ערך פוטנציאלי זטה גדול יותר נרשם עבור חלקיקים הכלאה עם ריכוז גבוה יותר של DNA.
השינוי בפוטנציאל הזטה שנמדד עבור לכידת DNA נבדק בלבד, יעד DNA משלים לחלוטין, יעד DNA קושר אמצעי, יעד DNA קושר קצה ומטרת DNA תלויה מוצג כאן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשטוף היטב ננו-קוטב בין כל כיול לדגימה כדי להבטיח שאין זיהום צולב בין הדגימות ולמנוע חסימת ננו-קוטבים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוסנסנס לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-DNA במבחני מולטיפלקס. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג פוטנציאל זטה באמצעות TRPS ולהכין חלקיקים שעברו שינוי DNA לבדיקות ביולוגיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש בחסימה מבוקרת של נקבוביות (tunable resistive pulse sensing - TRPS) לאפיון הכימיה של פני השטח של ננו-חלקיקים, עם דגש מיוחד על ננו-חלקיקים משוכללים ב-DNA. על ידי מדידת מהירויות התעתוק של החלקיקים, ניתן לקבוע את פוטנציאל הזטא של ננו-חלקיקים בודדים, ובכך לקבל תובנות לגבי תכונותיהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ננוטכנולוגיה
- ביופיזיקה
- מדע החומרים
רקע
- בדיקת דחף התנגדותי כעתיר-כיוון (TRPS) היא טכניקה לניתוח ננו-חלקיקים.
- אפיון הכימיה של הפני השטח חיוני להבנת התנהגותם של ננו-חלקיקים.
- פוטנציאל זטא הוא פרמטר חשוב ביציבות קולואידית.
- מודיפיקציה של ננו-חלקיקים באמצעות DNA יכולה לשפר את התפקוד שלהם בבדיקות ביולוגיות.
מטרת המחקר
- לאפיין את הכימיה של פני הננו-חלקיקים באמצעות TRPS.
- לקבוע את פוטנציאל זטא של ננו-חלקיקים שעברו מודיפיקציה של DNA.
- לספק שיטה לניתוח של חומרי ננו ברמה של חלקיק בודד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב של ננו-נקב הניתן לכיוונון העשוי פוליאוריתן עם גילוי באמצעות פולס התנגדותי.
- מדידה של מהירויות מעבר של חלקיקים.
- ניתוח של ננו-חלקיקים שעברו מודיפיקציה של DNA להערכת הכימיה של הפנימיות.
- חישוב של פוטנציאל זטא מנתוני המעבר.
תוצאות עיקריות
- אפיון מוצלח של ננו-חלקיקים שעברו מודיפיקציה של DNA.
- קביעה מדויקת של פוטנציאל זטא עבור ננו-חלקיקים בודדים.
- הדגמת היתרונות של TRPS לניתוח ננו-חומרים.
- השגת תובנות לגבי הכימיה של פני השטח של ננו-חלקיקים.
מסקנות
- TRPS היא שיטה יעילה לאפיון הכימיה של פני השטח של ננו-חלקיקים.
- הטכניקה מאפשרת ניתוח מפורט של ננו-חלקיקים בודדים.
- הממצאים תורמים לפיתוח של ביו-מבחנים וננו-חומרים משופרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אפיון הכימיה של פני השטח של ננו-חלקיקים הוא קריטי לניבוי אינטראקציות ביולוגיות, יציבות וביצועים פונקציונליים ביישומים טיפוליים ואבחנתיים. חישייה של פולס התנגדותי הניתן לכוונון (TRPS) מאפשרת מדידת פוטנציאל זטא ברמה של חלקיק בודד, ובכך מספקת נתונים ברזולוציה גבוהה התומכים בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתכנון ננו-חומרים. יכולת זו מגבירה את הביטחון הניבויי בסריקות שלב מוקדם של נשאי תרופות, חיישנים ביולוגיים וננו-טיפולים סביבתיים, על ידי קישור בין שינויים בפני השטח לתוצאות פונקציונליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השפעות פונקציונליזציית פני השטח על התנהגות חלקיקים ננומטריים, ובכך תומך בתיקוף יעדים באמצעות פרופיל פיזיקו-כימי.
- ערך תפעולי: מספק נתונים כמותיים ברזולוציית חלקיק, המבהירים קשרי מבנה-תכונה בספריות של חומרי ננו.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים של התפלגות פוטנציאל זטא מחלקיקים בודדים, מה שמאפשר זיהוי של תתי-אוכלוסיות בדגימות הטרוגניות.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי אספקת מדידות מטען פני שאינן דורשות סימון (label-free) וניתנות לשחזור בין סדרות ייצור שונות.
מחקר תרגומי וטרום-קלמיני
- ערך מדעי: מודד כיצד היברידיזציה של DNA משנה את המטען הפני, ובכך מספק מידע לחיזוי יציבות וקישור בסביבות ביולוגיות.
- ערך תפעולי: מספק מדדים ניתנים לתרגום להקבלה בין תכונות של ננו-חלקיקים לבין ביצועים פרה-קליניים בבדיקות ביו-כימיות מרובות-מטרות (multiplexed bioassays).
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת ה-TRPS משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקה ראשונית של ננו-חומרים ועד לזיהוי המועמד המוביל, כאשר נתונים על המטען הפני של המטען משמשים לקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) לפני השקעה בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קישור צפיפות שינויי ה-DNA להסתות מדידות בפוטנציאל זטא, ובכך מבהיר את תוצאות ההנדסה של השטח.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה, המאפשרים השוואה של פורמולציות של ננו-חלקיקים תחת תנאים מבוקרים.
- אנליטיקה: מספק קריאות של מהירות התעתוק ועוצמת החסימה המאפשרות השוואה סטטיסטית של אוכלוסיות בעלות שטח שעבר שינוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אפיון השטח לבין רציפות תפקודית בפיתוח ביו-אסיי (bioassay), כגון לזיהוי נגיפים או חלבונים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר לאפיון ננו-חומרים מגוונים בפרויקטים שונים, ובכך מפחית פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי ביציבות ננו-חלקיקים ובפוטנציאל האינטראקציה באמצעות מדידה ישירה של מטען פני השטח.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות ניתוח ברזולוציית חלקיקים, הממזער את השונות בין סדרות ייצור.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות בהתנהגות הננו-חומר, ובכך הורדת הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לנשאי ננו (nanocarriers) בהתבסס על פרופילי פני שטח מאומתים.
שיקולי יישום
- מומחיות בהכנת ננו-חלקיקים, פונקציונליזציה של פני השטח ועקרונות אלקטרוקינטיים.
- גישה למכשור TRPS עם בקרת לחץ ומתח, טיפול בנוזלים וכיול ננו-נקבים.
- פרוטוקולים סטנדרטיים לדילול דגימות, שטיפה ומניעת זיהום בין הרצות.
- שיקולי התאמה עבור גדלי חלקיקים משתנים, כימיה של פני השטח ותנאי בופר.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לחסימת נקבים וצורך בניקיון קפדני בין דגימות לשמירה על שלמות הנתונים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Preparing Streptavidin Coated Particles and Addition of Capture Probe DNA
2:45
Hybridizing Complementary DNA to the Capture Probe-particles
3:46
TRPS Setup
4:58
Calibrating the Nanopore for Zeta Analysis and Running a Sample
6:43
Results: Size and Zeta Potential of Streptavidin Coated Nanoparticles by TRPS
7:47
Conclusion
