מדידה במבחנה פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את פעילות האינטגרציה במבחנה של קומפלקסים טרום-אינטגרציה, או PICs, המבודדים מתאי SupT1 נגועים ב-HIV-1. שיטה זו תענה על כמה משאלות המפתח בביולוגיה של HIV, במיוחד כיצד גורמים מארחים מסוימים וגורמים ויראליים, למשל קפסיד נגיפי, ממלאים תפקיד באינטגרציה של DNA HIV-1, ופעולה זו תעזור לנו לתכנן או לזהות מטרות חדשות לטיפול אנטי-רטרו-ויראלי. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא דורשת כמות קטנה יחסית של הכנה מורכבת טרום-אינטגרציה, או PIC, למדידת פעילות האינטגרציה במבחנה.

ההשלכות של טכניקה זו יכולות להתרחב לקראת אבחון כמו גם טיפול באיידס, וזאת מכיוון שהגרסאות המוקדמות יותר של טכניקה זו היו קריטיות בגילוי מעכבי אינטגראז HIV-1, שהם אחת התרופות העיקריות נגד HIV בשימוש קליני כיום, כך שניתן להשתמש בשיטה זו לא רק להבנת אינטגרציה של HIV-1, אך ניתן ליישם אותו גם לחקר רטרו-וירוסים אחרים, כגון RSV ו-MLV. מי שידגים פרוטוקול זה יהיה ד"ר Muthukumar Balasubramaniam, שהוא עמית פוסט-דוקטורט במעבדה. כדי להדביק את SupT1 ב-HIV-1, במעבדת BSL-2, שמור על תאי SupT1 בין אחד לפעמיים 10 עד שישי תאים למיליליטר במכון רוזוול פארק ממוריאל או מדיום RPMI בתוספת 10% FBS ו-Pen-Strep.

לאחר יצירת טיטרים גבוהים של HIV-1 זיהומי על פי פרוטוקול הטקסט, אסוף את תאי ה-SupT1 מצלוחיות התרבית, ערבב היטב על ידי פיפטינג והשתמש בצביעת אי הכללה כחולה של טריפן בהמוציטומטר כדי לקבוע את ספירת התאים הקיימת. Aliquot שמונה פעמים 106 תאים לכל זיהום בנגיף בצינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מיליליטר, ואז צנטריפוגה את התאים ברוטור דלי מתנדנד ב-500 פעמים g ו-25 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מבלי להסיר את מדיום תרבית התאים, העבירו את הצינורות המכילים תאים גלוליים למעבדת BSL-3 להמשך עיבוד, ולאחר מכן שאפו בזהירות את המדיום מהצינור מבלי להפריע לגלולה.

לאחר מכן, הוסיפו לתאים 30 מיליליטר של חיסון הנגיף שטיפלתי בו וערבבו על ידי פיפטינג עדין, ואז חלקו את התערובת באופן שווה בין שתי צלחות תרבית רקמות שש בארות. לצורך ניקוקולציה, הניחו את צלחות התרבות במנשאי צלחות וצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורה של 480 פעמים גרם ו -25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ואז דגרו על התאים ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך חמש שעות. כדי לקצור ולייז את התאים הנגועים, אסוף את התאים המתאימים לכל זיהום לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 300 פעמים גרם ו -25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז שאפו בזהירות או פיפטו את הסופרנטנט. כדי להסיר חלקיקי וירוס שנותרו, שטפו כל כדור על ידי הוספת שני מיליליטר של מאגר K מינוס מינוס וסובבו את הדגימה שוב, ואז מבלי להפריע לגלולה, הסירו בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה או עם פיפטה לפני שתחזרו על הכביסה פעם נוספת. לאחר הסרת בזהירות כל שאריות חיץ עם מיקרופיפטה, השתמש במאגר ליזה קר כקרח K פלוס פלוס כדי להשעות בעדינות כל כדור ולהעביר לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר.

כדי להכין קומפלקסים ציטופלזמיים טרום-אינטגרציה, או PICs, נדנדו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ואז הכניסו את הצינורות לרוטור מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס, וצנטריפוגה ב-1, 500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. מבלי להפריע לגלולה, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי וסובבו ב-16,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי, ואז הוסיפו RNase A לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר, ודגרו על התוכן בטמפרטורת החדר מבלי להתנדנד במשך 30 דקות.

מוסיפים סוכרוז לריכוז סופי של 7% ומערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין, ואז מכינים כמויות של ה-PIC בצינורות מיקרו-צנטריפוגה. הקפיא בזק בחנקן נוזלי והניח במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. כדי להכין את ה-DNA היעד המשמש באינטגרציה חוץ גופית או בבדיקת IVI, הרכיבו את תערובות ה-PCR כדי להגביר אזור של 2.0 קילו-בסיס מה-DNA של הפלסמיד phiX174 באמצעות הפריימרים המותאמים אישית phiX174-Forward ו-phiX174-Reverse, ובצעו PCR באמצעות התוכנית בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

לאחר טיהור ג'ל וציטוט הדגימה, הוסף 600 ננוגרם של DNA מטרה ל-200 מיקרוליטר של PICs. מערבבים היטב ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. עצרו את תגובת IVI על ידי הוספת SDS, EDTA ופרוטאינאז K, ואז ערבבו היטב את תוכן התגובה ודגרו בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, כדי לטהר את ה-DNA הכולל מתגובת ה-IVI, הוסף נפח שווה של פנול לדגימה נטולת החלבון. מערבבים במרץ על ידי מערבולת וצנטריפוגה במשך שתי דקות. הסר בזהירות את השלב המימי העליון והעביר אותו לצינור טרי לפני שתחזור על מיצוי הפנול, ולאחר מכן הוסף נפח שווה של אחד לאחד פנול כלורופורם.

מערבבים את הדגימה על ידי מערבולת וצנטריפוגה של הצינור למשך שתי דקות, ואז מעבירים את השלב המימי העליון לצינור טרי. לאחר מיצוי עם כלורופורם על פי פרוטוקול הטקסט, זרז את ה- DNA מהשלב המימי על ידי הוספת 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר גליקוגן, 0.3 נתרן אצטט מולרי ו -2.5 נפחים של 100% אתנול קר כקרח. הנח את הצינור בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. כדי לבצע PCR לכימות פעילות PIC, התחל בסבב הראשון של PCR קונבנציונלי באמצעות פריימרים המכוונים ל-LTR הנגיפי ול-phiX174 DNA כדי להגביר את הצמתים של ה-DNA המשולב של HIV-1. הרכיבו את תערובת המאסטר מינוס ה-DNA של התבנית כמתואר כאן, ואז חלקו 45 מיקרוליטר לתוך צינורות PCR נפרדים והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של DNA תבנית או מים ללא נוקלאז כבקרה.

הפעל את התגובה בתרמו-סייקלר באמצעות התוכנית המתוארת בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן בצע סבב שני של PCR כמותי ונתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. בבדיקת IVI זו, SupT1 חוסן ב-DNA I טיפלתי ב-HIV-1, ובהיעדר או נוכחות של מעכב אינטגראז HIV-1, Raltegravir. לאחר הדגירה, בודדו PICs וה-DNA המטוהר נותח לשילוב DNA נגיפי.

כפי שמוצג כאן, ה-PICs של HIV-1 משלבים בצורה חזקה את ה-DNA הנגיפי הקשור ל-DNA המטרה ויעילות ה-IVI של PICs הופחתה מאוד בתגובות בתוספת Raltegravir, מה שמרמז מאוד על פעילות האינטגרציה שנמדדה בבדיקה זו לאינטגראז HIV-1. תגובות הביקורת לא הראו פעילות אינטגרציה כלשהי. בנוסף, הבקרה שלא כללה את Taq polymerase בסבב הראשון של PCR לא הגבירה את מוצרי האינטגרציה.

יש לציין כי הנתונים מבקרת ה-PIC בלבד הצביעו על כך שאסטרטגיית ה-qPCR המקוננת מדדה באופן ספציפי את ה-DNA הנגיפי המשולב, אך לא את ה-DNA הנגיפי הקשור ל-PIC. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מדגימים את פעילות האינטגרציה הקשורה ל-PIC. לאחר השליטה, ניתן להשלים את הכנת הנגיף ובדיקות PCR לכימות פעילות ה-PIC תוך שבוע.

הדבקה של תאי SupT1 ובידוד ה-PIC מהתאים הנגועים יכולים להיעשות תוך יום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את ה-HIV-1 PICs ולמדוד את פעילות האינטגרציה במבחנה. אל תשכח שעבודה עם טיטרים גבוהים של HIV-1 זיהומי עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות מתאימים, כולל ביגוד מגן כגון סינרים וחלוקים, כפפות כפולות ומשקפי מגן, בעת ביצוע הליך זה.