Name: הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למדו לכמת תאי B מפרישי נוגדנים מדם אנושי באמצעות שיטת ELISpot. שיטה זו מאפשרת זיהוי ומדידה ברמת התא הבודד, ומסייעת במחקר חיסונים וביולוגיה של תאי B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר ממשרד המדע והטכנולוגיה של היואן המנהלי של טייוואן (NSC99-2320-B-002-011). ברצוני להודות לשירות המצוין הניתן על ידי ליבת הניתוח והמיון הציטומטרי של מעבדת הליבה הראשונה במכללה לרפואה של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן.

דם היקפי אדם יש לקבל מתורמים בריאים תחת הסכמה מדעת, ושימוש דגימות דם חייב לעמוד בהנחיות שאשרו שהקימו לוחות סקירה מוסדיים בודדים. במחקר זה, כי הפרוטוקול משתמשים בדם אדם בהפגנה של תוצאות cytometry זרימה (איור 1) מבחני ELISPOT (איור 3) אושרה על ידי המועצה לביקורת פנימית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי בטייוואן (מספר פרוטוקול 201307019RINB). בידוד וטיהור 1. של אדם תאי הדם ההיקפי B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר ~ 10 מ&quot;ל של דם מהעורק cubital החציוני (ב הקדמי fossa cubital עד המרפק) לתוך צינור 15 מ&quot;ל המכיל EDTA K 2 (1.5 עד 2.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל דם) ומיד להפוך את הצינור מספר פעמים כדי למנוע קריש היווצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 35 מ&quot;ל של autoclaved (121 ° C, 15 דקות) תאי דם אדומים (RBC) תמוגה חיץ (150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ 3 KHCO, ו 1 mM EDTA; pH 7.4) כדי צינור המכיל את דגימת הדם טרי (≥ 3: 1 כרך / כרך) ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך לא יותר מ -5 דקות. הערה: המראה של העברת אור דרך הצינור מציין את השלמת תמוגה RBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. ודא כי הגלולה היא בצבע לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 10 מ&quot;ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו autoclaved (PBS, 137 מ&quot;מ NaCl, KCl 2.7 מ&quot;מ, 4.3 מ&quot;מ Na 2 4 HPO, ו 1.47 מ&quot;מ KH 2 PO 4; pH 7.4) ו צנטריפוגות כמו בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend גלולה עם 10 מ&quot;ל של RPMI 1640 בינוני (תוספי: נסיוב עגל עוברית 10%, 100 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​amphotericin B, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין), ולאחר מכן צלחת תאים לתוך צלחת תרבות 10 ס&quot;מ (10 מ&quot;ל של דם לכל צלחת). מניח את הצלחת בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את מנת התרבות כמה פעמים ומקוםמדיום תרבות (תאי השעיה) לתוך צינורות חרוטי פלסטיק 15 מיליליטר. מחק את התאים החסידים (בעיקר מקרופאגים) על תרבות המנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 1 מ&quot;ל של מדיום RPMI 1640. ספירת התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי. הערה: הכדאיות של לויקוציטים מבודד היא בדרך כלל יותר מ -90% על ידי הרחקה הכחולה trypan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כמו בשלב 1.7 ו resuspend התאים ~ 200 μL של חיץ קר PBS (אלבומין 0.5% שור (BSA) ו 2 מ&quot;מ EDTA) בריכוז של 5 - 10 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μL של קוקטייל Ab אנטי אנושי biotinylated ספציפי לתאי דם (עבור הסלקציה השלילית של תאי B) לכל 10 6 תאי דגירה על קרח למשך 30 דקות 21. הערה: קוקטייל Ab אנטי אנושי צריך לפחות כוללים Abs ספציפי CD2 (או CD3), CD14, CD16 ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח עודף של פי 10של PBS סטרילי אל התאים, צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות שווות של microbeads streptavidin מצומדות (5 μL לכל 10 6 תאים) על הגלולה ומערבבת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על קרח למשך 30 דקות בתוך צינור חרוטי פלסטיק 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של חיץ PBS לתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך מעמד מגנטי דגירה ב RT עבור 8 דקות. Microbeads חום יצרף בהדרגה אל הקיר צינור ליד המגנט 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצינור שנותרו לעמוד מגנטי, ובזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור 15 מ&quot;ל סטרילי חדש 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.14 כדי 1.16, ולשלב את שני supernatants המכילים את תאי B פגע. מחק את microbeads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במדיום RPMI 1640 לניסויים במורד הזרם. הערה: בדרך כלל, 1 - 5 x 10 5 B תאים שנינותחה טוהר יותר מ 95% מ -10 מ&quot;ל של דם היקפיים ניתן לבודד 23. </li></ol> 2. טיהור והפרדה של זיכרון והתמים B תאי מתאי B מבודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאים מטוהרים משלב 1 ולקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 100 μL של חיץ PBS קר לאחר צנטריפוגה ב 600 XG ו RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 - 2 מיקרוגרם של מב CD27 biotinylated לכל 10 6 תאים דגירה על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ PBS אל הצינור צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend התאים 50 μL של חיץ PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות שוות של microbeads מגנטי streptavidin (1 - 2 מיקרוגרם / 10 6 תאים) לתאים צינור חרוטי פלסטיק 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבבים היטב דגירה על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2 - 3 מ&quot;ל של חיץ PBS אל הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אתצינור לתוך עמדת מגנטי הדגירה ב RT עבור 8 דקות כדי לאפשר microbeads החום לצרף את הצד הקרוב המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצינורית לעמוד המגנטי, ובזהירות להעביר את החלק היחסי supernatant לתוך צינור סטרילי חדשה. חלק זה מכיל את CD27 המועשר - תאי B נאיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל שפופרת המכילה את microbeads בעדינות resuspend microbeads (כלומר, את החלק היחסי מועשר של תאי זיכרון B CD27 +) 24-25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG ב RT במשך 5 דקות. Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI 1640 עבור הניסויים במורד הזרם. הערה: בדרך כלל, ~ 30 - 60% של תאי B יכולים להיטהר כתאי זיכרון CD27 + מן PBMCs של מתורם בריא 7, 25-26. </li></ol> 3. מיון תאים עבור האוסף של תאי B הנאיבי, תאי B הזיכרון, ו- PBS / מחשבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תאים מטוהרים משלב 1, לקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חיץ PBS קר בריכוז של 10 7 לכל מ&quot;ל בתוך שפופרת קלקר 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 - 2 מיקרוגרם של IgG אדם לכל 10 6 תאים דגירה על קרח למשך 10 דקות עבור בלוק Fc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיקרוגרם אחד נגד CD19-APC (שיבוט: HIB19), אנטי CD27-eFluor450 (שיבוט: O323), ואנטי-CD38-PE (שיבוט: HIT2) לכל 10 6 תאים; מערבבים היטב לדגור על קרח למשך 30 דקות 4, 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב -5 הדקות האחרונות בשלב 3.4, להוסיף 5 μL של D 7-aminoactinomycin המסחרי (7-AAD). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של PBS על הצינור, מערבולת, ו צנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים מיון חיץ (PBS סטרילי עם BSA 2% ו 2 מ&quot;מ EDTA) בריכוז של 1 - 5 x 10 7 תאים לכל מ&quot;ל בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התאים דרך מסננת תא רשת ניילון (40 מיקרומטר גודל נקבובי) לחסל גושי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את התאים עם מעין תזרים cytometricאה מצויד בשלושה לייזרים: סגול (405 ננומטר), כחול (488 ננומטר), ואדום (640 ננומטר). הערה: לייזר כחול בלבד מספיקה עבור 3-צבע cytometry זרימה 27-28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין התאים לשלושה צינורות 15 מ&quot;ל (המכיל 5 מ&quot;ל של מדיום RPMI) לאיסוף סימולטני של תאי B נאיבי (CD19 + CD27 -), תאי B זיכרון (CD19 + CD27 +), ו PBS / מחשבים (CD19 + CD27 + / היי CD38 +) 3-4, 28. הערה: ממוין נאיבי וזיכרון B תאים יכולים להיות מתורבתים כמתואר בשלב 4. </li></ol> 4. במבחנת הבידול של CD19 האדם מבודד תאים + B, תאי CD19 + CD27 + זיכרון B ו- CD19 + CD27 - תאי B הנאיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות התאים מטוהרים בצעדים 1.19, 2.10, 2.11 ו -3.10, לקבוע את המספר הסלולרי עם hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עם המדיום RPMI 1640בריכוז של 1 - 10 x 10 5 לכל מ&quot;ל ו aliquot אותם לתוך הבארות של צלחת 12-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף CPG (ODN 2006) בשעה 5 מיקרוגרם / 10 6 תאים / מ&quot;ל 18, 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים מכל טוב, למקם אותם בתוך צינוריות 15 מ&quot;ל, מוסיפים 5 מ&quot;ל של PBS על צינור אחד, צנטריפוגות אותם ב 600 XG ו RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. Resuspend התאים בריכוז של 1 - 10 x 10 5 לכל מ&quot;ל עם RPMI 1640 בינוני. </li></ol> 5. Assay ELISPOT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μL של אתנול 35% במים מזוקקים היטב כל הצלחות ELISPOT למשך 30 שניות. הערה: כאשר pipetting, להימנע מלגעת קרום בבארות בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את צלחות ELISPOT להסיר את אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 150 μL של DDH autoclaved 2 O לתוך זה היטב דגירהאותם ב RT במשך 5 דקות כדי לשטוף את אתנול שיורית; בצע עם לשטוף של PBS סטרילי ב RT במשך 3 דקות. הערה: שלבי 5.1 כדי 5.3 עשויים להיות אופציונליים, תלוי בייצור של הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 50 μL של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל polyclonal F (ab &#39;) 2 שבר (IgA IgG + IgM +) אנטי אנושי איג (PBS) לבאר כל הצלחות ELISPOT דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (המועדפת) או 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות 11. הערה: לאטום את הקצוות של הצלחות עם Parafilm עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצלחות להסיר Abs המאוגד, להוסיף 200 μL של PBS על כל היטב, דגירה אותם פעמים ב RT במשך 3 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של PBS עם 5% BSA (או RPMI 1640 בינוני) זה טוב עבור חסימה, דגירה אותם ב RT עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצלחות להסיר למאגר החסימה. לשטוף כל פעמיים גם עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של RPMI 1640 בינוני היטב כל דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן זרע התאים, להפוך את הצלחות להסיר את מדיום RPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 100 μL (5 x 10 4), 50 μL (2.5 x 10 4), ו -25 μL (1.25 x 10 4) של התאים (מן הצעדים 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, ו -4.6) לתוך הבארות של צלחת ELISPOT. עם המדיום RPMI 1640, ולהביא את נפח 150 μL / טוב. הערה: מינימום של אחד או שניים דילולים סדרו פי 2 עבור ציפוי התא מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות 37 ° C חממה עם 5% CO 2 עבור 8 - 14 שעות 18. הימנע הזזת הצלחות במהלך דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצלחות כדי להסיר את התאים ובינוניים RPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL / טוב של PBS-T (PBS עם 0.05% Tween 20) דגירה אותם 5 פעמים ב RT, בכל פעם למשך 3 דקות. הפוך את הצלחת להסיר את החיץ לשטוף בין כל 5 הכביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף או עז נגד אדם phosphatase IgG-אלקליין (AP), שרירי הבטן ספציפי Fcγ (לגילוי IgG, 1: 5,000 ב PBS-T) או עז נגד אדם IgM-AP, Fcμ שבר ספציפי Abs (לגילוי IgM, 1: 5,000 ב PBS-T) לתוך הבארות המיועדות לדגור על RT עבור 2 שעות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל פעמיים גם עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL / היטב tetrazolium כחול פוספט-ניטרו bromochloroindolyl פתרון המצע (BCIP / NBT). כתמים סגולים בצבע בדרך כלל מופיעים 5 - 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL / טוב של DDH 2 O כדי למנוע כתמים התפתחות יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצלחות עם ריצה ברז מים לאחר הפיתוח המלא של כל הכתמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את underdrain של הצלחות ולאפשר להם אוויר יבש בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את הנקודות באמצעות קורא צלחת אוטומטית עם יחידת רכישת תמונה / ניתוח (לדוגמא, סורק אוטומטי או ידני באמצעות מיקרוסקופ לנתח). הערה: ניתן לאחסן את הצלחות ב RT בחושך ונותחו לאחר מכן. </li></ol>

<ol><li>Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+transitions+-+how+to+decipher+peripheral+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Res%22%5BJournal%5D)">Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development.</a> J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).</li>
<li>Odendahl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+migratory+antigen-specific+plasmablasts+and+mobilization+of+resident+plasma+cells+in+a+secondary+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response.</a> Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).</li>
<li>Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human B cell subsets.</a> Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).</li>
<li>Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells.</a> Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).</li>
<li>Perez-Andres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+B-cell+compartments%3A+A+crossroad+in+B-cell+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).</li>
<li>Huggins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+DNA+activation+and+plasma-cell+differentiation+of+CD27-+na%C3%AFve+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells.</a> Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).</li>
<li>Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+CD27+negative+and+positive+B+cell+populations+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood.</a> Front. Immunol. 2, 81(2011).</li>
<li>Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD38hiCD138%E2%81%BA+plasma+cells+can+be+generated+in+vitro+from+CD40-activated+switched-memory+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes.</a> J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).</li>
<li>Wienands, J., Engels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+memory+function+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The memory function of the B cell antigen receptor.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).</li>
<li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory B cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li>
<li>Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%CE%B3RIIB+mediates+antigen-independent+inhibition+on+human+B+lymphocytes+through+Btk+and+p38+MAPK+%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK .</a> J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).</li>
<li>Ettinger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+induces+differentiation+of+human+na%C3%AFve+and+memory+B+cells+into+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells.</a> J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).</li>
<li>Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poke+weed+mitogen+requires+Toll-like+receptor+ligands+for+proliferative+activity+in+human+and+murine+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes.</a> PLoS One. 7 (1), e29806(2012).</li>
<li>Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).</li>
<li>Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDefrance%2C+T+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 175 (3), 671-682 (1992).</li>
<li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+P+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2001).</li>
<li>Tanguay, S., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+ELISPOT+and+ELISA-based+assays+for+detection+of+individual+cytokine-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphokine+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells.</a> Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).</li>
<li>Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+human+antigen-specific+memory+B+cells%3A+a+sensitive+and+generalized+ELISPOT+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system.</a> J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+retarded+influenza+virus-specific+immunoglobulin+class+switch+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice.</a> J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).</li>
<li>Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+numbers+of+memory+B-cells+and+Th2-cytokine+skewing+in+high+responders+to+hepatitis+B+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination.</a> Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).</li>
<li>Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeine%2C+G+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , (2011).</li>
<li>Safarík, I., Safaríková, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).</li>
<li>Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+values+for+B+cell+subpopulations+from+infancy+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood.</a> Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThornton%2C+AM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2003).</li>
<li>Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlein%2C+U+%22J.Exp.+Med%22">J.Exp. Med</a>. 188 (9), 1679-1689 (1998).</li>
<li>Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm1-Bm5+classification+of+peripheral+blood+B+cells+reveals+circulating+germinal+center+founder+cells+in+healthy+individuals+and+disturbance+in+the+B+cell+subpopulations+in+patients+with+primary+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome.</a> J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).</li>
<li>Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBleesing%2C+JJ+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2003).</li>
<li>Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+pure+lymphocyte+gate+for+subset+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry.</a> Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).</li>
<li>Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+stimulation+as+a+third+signal+required+for+activation+of+human+naive+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells.</a> Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Caraux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+human+B+and+plasma+cells.+Age-associated+changes+in+counts+and+detailed+characterization+of+circulating+normal+CD138-+and+CD138%2B+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells.</a> Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).</li>
<li>Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+IL-21+in+B+cell+activation%2C+expansion%2C+and+plasma+cell+generation+during+CD4%2B+T+cell-B+cell+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration.</a> J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).</li>
<li>Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+dissection+of+the+human+memory+B-cell+repertoire+following+infection+and+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination.</a> Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).</li>
<li>Jahnmatz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+human+IgG+B-cell+ELISpot+assay+for+the+analysis+of+vaccine-induced+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses.</a> J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).</li>
<li>Weiss, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+human+memory+B+cell+assay+and+its+application+to+studying+Plasmodium+falciparum-specific+memory+B+cells+in+natural+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections.</a> J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).</li>
<li>Leehan, K. M., Koelsch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+ELISPOT%3A+For+the+identification+of+specific+cytokine-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells.</a> Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).</li>
<li>Karahan, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HLA+class+II-specific+memory+B+cells+in+HLA-sensitized+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals.</a> Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).</li>
<li>Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+B+cell%2Fantibody+cross-reactivity+using+a+novel+multicolor+FluoroSpot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay.</a> J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).</li>
<li>Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepping+up+ELISpot%3A+multi-level+analysis+in+FluoroSpot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays.</a> Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).</li>
<li>Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+cell+responses+to+hepatitis+C+virus+%28HCV%29+in+the+liver+of+persons+with+HCV-HIV+coinfection+versus+HCV+monoinfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection.</a> J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).</li>
<li>Smith, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+major+factors+influencing+ELISpot-based+monitoring+of+cellular+responses+to+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).</li>
<li>Sundararaman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+reproducibility+of+ELISPOT+counts+from+nine+different+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories.</a> Cells. 4 (1), 21-39 (2015).</li>
<li>Janetzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+automated+evaluation+of+Elispot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays.</a> Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).</li>
</ol>

המחבר מצהיר שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בידוד וטיהור של אדם תאי הדם ההיקפי B בדרך כלל, RBCs ניתן מקרע ביעילות מסומן על ידי חיץ תמוגה (שלב 1.2). חשוב לא כדי לדגור PBMCs עם למאגר תמוגה RBC יותר מ -5 דקות, כפי כדאיות התא עלול להיות מושפע אמוניום כלוריד. לחלופין, RBCs וטסיות ניתן להסיר זמנית על ידי הפרוטוקול הבא. מערבבים טריים דם שלם עם ציטרט חומצה דקסטרוז (ACD) חיץ (חומצת לימון 39 מ&quot;מ,...

תאי B למלא תפקיד מרכזי בפיתוח של חסינות לחות. בהתחלה הוא לפתח במח העצם ולהיכנס לזרם הדם כמו תאי B נאיביים, אשר ניתן להעביר לתוך הרקמות הלימפה, כמו הטחול, בלוטות הלימפה, ואת שקדים, להמשך פיתוח. לאחר מפגש Ag, כמה תאי B נאיביים לנדוד לתוך זקיקי הלימפה, שם מרכז נבטי תאי B יכולים להתמיין לתאי B זיכרון plasmablasts (PBS) / תאי פלזמה (מחשבים). בעוד שרוב PBS / מחשבי היציאה לתוך זרם הדם, כמה בסופו של דבר להתגורר במח העצם כדי לעבור התמיינות מסוף מחשבי חיים ארוכים 1. תאי B שבמחזור הם הטרוגניות, ו על מצב יציב, מחשבי PBS / הם נדירים בדם היקפי 2. כתוצאת הזמינות של סמני משטח ספציפי שושלת, cytometry זרימה הפכה שיטה פופולרית לזיהוי והאפיון של תת B-cell בדם היקפי. יישום מורחב של הזרימה cytometry הוא התוספת של פונקצית סדרן תא, המאפשרת פרדה ובידוד של תת בודדים של תאי B עם טוהר גבוה. בהתבסס על הביטוי של קולטנים משטח ספציפי בשלבים התפתחותיים שונים, תאי B במחזור האדם מסווגים בדרך כלל לשלוש תת-אוכלוסיות עיקריות: תאי B נאיבי (CD19 + CD27 - CD38 -), תאי B זיכרון (CD19 + CD27 + CD38 -), ו PBS / מחשבים (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (איור 1). תאי B נאיביים מטבעו לא נתקלו AGS. עם זאת, הם יכולים להיות מובחנים לתוך IgM + CD27 + תאי הזיכרון B. למרות שתאי B נאיבי הם הומוגניים בהבעת הקולטן לאנטיגן B-cell (BCR) מולקולות -associated (למשל, CD19, CD20 ו CD22) הם הטרוגניים ברפרטואר אימונוגלובולינים שלהם 5. רוב תאי B זיכרון CD27 + יכול להיות מובחן לתוך CD27+ / היי CD38 + PBS / מחשבים 6. בנוסף, תאי B זיכרון PBS / מחשבים הם polyclonal ולהציג ההטרוגניות התפתחותית תפקודית 4-7. PBS / מחשבים שבמחזור הם בדרך כלל קצרי מועד מחווי CD138, אבל אלה שנעשו להתיישב במח עצם סופנים יבדילו ולהיות קבוע לטווח ארוך. סופני מחשבים הבדיל להביע CD138 ולמטה להסדיר מולקולות CD27 על פני השטח שלהן 8. מאז הוא PBS ומחשבים מסוגלים מפריש Abs, בהזדמנויות רבות הם מסומנים קולקטיביים ASCs. לעומת זאת, לא תאי B נאיביים ולא תאי B זיכרון יכול לייצר כמות ניכרת של שרירי הבטן 9-10. אף על פי כן, כאשר מבודד, הן תאי B נאיביים וזיכרון יכולים להיות מובחנים לתוך ASCs ב 3 - 10 ימים כאשר הניחו את תנאי התרבות הנכונים 6, 11-15. למעשה, ASCs נגזר ביטויי משטח דומים נתח בידול במבחנה של CD27 ו CD38 עם אלה fr ישירות המבודדדם 6 היקפי אום. בנוסף, ASCs הבדיל במבחנה להביע רמה נמוכה של CD20 השטח, בדומה לזה של מחזורי PBS / מחשבים 6. למרות ASCs נגזרת התרבות היא כל קצרת מועד, הם יכולים להפריש Abs, המציין כי הם תפקודיים מוכשרים ומסוגלים לתרום חסינויות לחות. שניהם ELISA ו ELISPOT הוא ללא ספק השיטות ביותר מיושם כלל עם אשר להשיג מידע פונקציונלי על תגובת הלחות החיסונית. ELISA הוא assay 96-היטב מבוססי צלחת, והוא משמש לעתים קרובות כדי למדוד את טיטר של שרירי הבטן בסרום Ag ספציפיים analytes אחרים (למשל, ציטוקינים). זה נוח, וניתן להרחבה. ELISA נועד להשתמש assay אנזים מוצק שלב כדי לזהות הנוכחות של שרירי בטן או חומרים אחרים, כגון סרום, במדגם נוזל 16. המצגים מ ELISAs בסרום היו בשימוש נרחב לייצג את התגובה החיסונית של הגוף. כלי הכרחי לרכישה מחדשadouts מבחני ELISA הוא קורא microplate spectrophotometric. הקורא יכול לקבוע את הצפיפות האופטית (OD) של מוצרי הקצה בדרך כלל בעקבות התגובה של peroxidase חזרת (HRP) Abs זיהוי מצומדות ו -17 מצעים הספציפיים שלהם. באשר לדיווח תגובת הלחות החיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA לציין הקולקטיב, אבל לא אישית, ההישגים של ASCs בגוף. בנוסף, ELISA אינה מביאה בחשבון את ההשתתפות ידי תאי B זיכרון, אשר לא מפרישים Abs. כמו ELISA, ELISPOT היא שיטה בשימוש נרחב לאיתור וניטור התגובה החיסונית בדגימות דם היקפיים 17-18. ELISPOT היא טכניקה הקשורים כריך ELISA. בכל זאת, התאים ממוקמים לתוך difluoride polyvinylidene (PVDF) בארות מגובי הממברנה של 96 גם microplates לתרבות לטווח קצר. את assay ELISPOT משול ביצוע המערבי סופג על microplate ואת developing הכתם על הממברנה PVDF בכל טוב. מערכת קורא אוטומטית ELISPOT או סטראו עבור ספירה ידנית נדרשת. היתרון העיקרי של ELISPOT באיתור תגובה חיסונית הוא הרגישות המעולה שלה כימות של ASCs ותאי ציטוקינים, מפריש. הוא מדווח פעילויות הפעילות שלהן חסינות הלחות ואת הסלולר, בהתאמה. במדידת תפקוד הלחות חיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA ומספר ASCs שמפרטת ELISPOT מתואמות לעתים קרובות, אבל readouts הנתונים משני מבחנים אלה יש כמה בדלי השלכות פונקציונליות 19-20. היתרון העיקרי של ELISPOT הוא רגישותו של השיטה. רמת טיטר בסרום Ab כפי שדווחה על ידי ELISA מוצגת חצי כמותית כמו readouts OD, המציינת את רמת Ab יחסית, או יותר באופן כמותי, כפי readouts ריכוז כאשר כמות ידועה של isotypes התקין של שרירי הבטן נכללה לעיון. לעומת זאת, התוצאות של ELISPOT הם presenteד כמספר מוחלט של ASCs בתוך שלולית התא של עניין (למשל, תאי דם היקפיים mononuclear unfractionated (PBMCs) ותאי B מטוהרים מן PBMCs). ELISPOT יכול לזהות ASC יחיד, אבל ELISA דורש כמויות Ab מ ASCs להגיע ריכוזי assay התלוי אופטימיזציה לפני המדידה. לפיכך, ELISPOT הוא ללא ספק עדיף על ELISA ברגישות של כימות. יתר על כן, ELISPOT מתאים גם לכימות במבחנה ASCs הבדיל מתאי B זיכרון מופעל. תאי B זיכרון לא מפרישים Abs אבל יכול להתמיין ASCs באקטיבציה; הם ולכן אין תרומה Abs בסרום זוהה על ידי ELISA. לפיכך, ELISPOT היא השיטה של ​​בחירה במדידה של התגובה החיסונית של תאי B זיכרון לאחר ההפעלה בתרבות. היא מאפשרת ניטור של החזקת חסינות הלחות לטווח ארוך.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>צינור 10 מ"ל</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>ללא אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>טריפן כחול 0.5% תמיסה</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag סט העשרת לימפוציטים B אנושי</td> BD <td>Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>ביוטינילציה CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>שיבוט 302804</td><td>O323</td></tr><tr><td>סטרפטווידין מיקרו-חרוזים מגנטיים</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות בז</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאי רשת ניילון כחולה, 40 &mu; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>שיבוט HIB19</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>שיבוט O323</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>שיבוט HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>שיבוט HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>שיבוט אנטי אנושי CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>שיבוט HI30</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט 555482</td><td>HI30</td></tr><tr><td>נגד עכבר/חולדה/אדם CD27-PerCP Cy5.5</td><td>שיבוט Biolegend</td><td>124213</td><td>LG.3A10</td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>שיבוט L128</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>שיבוט LT19</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>שיבוט</td><td>GTX75599 LT19</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט</td><td>555622 2H7</td></tr><tr><td>ביוטינילציה אנטי אנושי CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>שיבוט O323</td></tr><tr><td>ביוטינילציה אנטי אנושי CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>שיבוט O323</td></tr><tr><td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>סוג B CpG</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>חלבון A של S. aureus Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>לוחות סינון MultiScreen, 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>צלחת סינון סטרילית, שקופה 96 בארות עם קרום PVDF הידרופובי</td></tr><tr><td>תמיסת BCIP / NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP / NBT מגיב יחיד, מצע פוספטאז אלקליין</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>IgG אנושי</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>IgG אנושי, שבר Fc</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 שבר של Ig אנטי-אנושי של עז (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-אנושי IgG-אלקליין פוספטאז, Fc&gamma; שבר ספציפי</td><td>ג'קסון</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-אנושי IgM-אלקליין פוספטאז, Fc&micro; ג'קסון ספציפי לשבר</td><td> ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי אנושי IgG-peroxidase, Fc&gamma; מקטע</td><td>ספציפי ג'קסון ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי אנושי IgM-peroxidase, Fc&micro; מקטע</td><td>ספציפי ג'קסון ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מצע BD ELISPOT AEC BD</td><td>Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>מנתח C.T.L. ImmunoSpot</td><td>סי.טי.אל.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים b מדם: elispot בתור readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

המאפיין העיקרי של חסינות לחות הוא ליצור ASCs התפקודית, אשר לסנתז ולהפריש Abs הספציפי לאנטיגן (Ag), כגון פתוגן, ומשמש הגנה מארחת. לקביעת כמותי של המצב התפקודי של התגובה החיסונית הלחות של אדם, הן Abs בסרום ASCs במחזור נמדדים בכינויו readouts פונקציונלי. אצל בני אדם, דם היקפיים הוא מדגם הנוחה ביותר ונגיש בקלות, שניתן להשתמש בהם לצורך קביעת התגובה החיסונית הלחות שהושרו על ידי תאי B המארח. B-cell ברור תת, כולל ASCs, ניתן לבודד ישירות מדם היקפי באמצעות בחירה עם microbeads שושלת ספציפית Ab מצומדות או באמצעות מיון תא עם cytometry זרימה. יתר על כן, תאי B נאיביים וזיכרון מטוהרים יכולים להיות מופעל בדיל לתוך ASCs בתרבות. הפעילות התפקודית של ASCs לתרום הפרשת Ab ניתן לכמת על ידי ELISPOT, המהווה assay כי מתכנס אנזיםassay immunoabsorbance -linked (ELISA) וטכנולוגיות מערביות סופג כדי לאפשר הספירה של ASCs הנפרד ברמת התא הבודד. בפועל, assay ELISPOT נעשה שימוש יותר ויותר להעריך יעילות החיסון בגלל הקלות של טיפול של מספר רב של דגימות דם. שיטות לבודד תאי B האדם מן הדם ההיקפיים, את הבידול של תאי B לתוך ASCs במבחנה, ואת העסקתם של ELISPOT כימות של IgM- סך IgG-ASCs שיתואר כאן.

PBMCs היו מתרוקנים של RBCs ותאי חסיד (שלבים 1.2 כדי 1.7). דוגמא מתמיסה בסיסית (2 x 10 6) של תאים היו נתוני ניתוח התזרים cytometric כדי להמחיש את האוכלוסיות של תאי B נאיביים, תאי B הזיכרון, PBS / מחשבים בדם היקפי (איור 1). בשנת PBMCs של תורם זה, כ -10% של לימפוציטים היו תאי CD19 + B. בתא B-cell, אחוז CD19 + CD27 - תאי B נאיבי היה בסביבות 50%. מצד השני, כ -50% מכלל תאי CD19 + B ה...

דם היקפי אנושי משמש בדרך כלל להערכת התגובה החיסונית ההומורלית. כאן, מתוארות השיטות לבידוד תאי B אנושיים מדם היקפי, התמיינות תאי B אנושיים לתאי B מפרישי נוגדנים (AB) (ASCs) בתרבית, וספירת סך ה-IgM וה-IgG-ASCs באמצעות בדיקת ELISpot.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

המטרה הכללית של מתודולוגיית ELISpot זו היא לאפשר את הכמות של תאי B מפרישי נוגדנים אנושיים מתוך הדם. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביו-רפואי בנוגע לאימונולוגיה של תאי B ולמחקר ואקצינים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי ומדידה של תאי B מפרישי נוגדנים ברמת התא הבודד.את הפרוצדורה ידגים Tsung-Chih Tseng, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. מיד לאחר השגת דגימת דם של 10 ml מווריד המדיאן קוביטלי אל תוך מבחנה של 15 ml המכילה EDTA מועשר בקוטסיום, הפכו את המבחנה מספר פעמים כדי למנוע היווצרות קרישים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 35 ml של באפר להמסה של תאי דם אדומים שעבר אוטוקלב, להדגרה של חמש דקות בטמפרטורת החדר.כאשר ניתן להבחין באור העובר דרך המבחנה, סנטריפוג את הדם ואשש את נוכחותו של משקע לבן. הסר את שאריות באפר הליזה באמצעות 10 ml של PBS שעבר אוטוקלאב, ותלה את המשקע מחדש ב-10 ml של מצע RPMI 1640. זרע את התאים בצלחת תרבית של 10 cm להדגרה של 30 דקות ב-37 degrees celsius וחמישה אחוזים carbon dioxide.לאחר מכן, סובבו בעדינות את צלחת התרבית מספר פעמים והעבירו את התאים הצפים לשפופרת קונית מפלסטיק בנפח 15 ml. לאחר שני שטיפות באמצעות סנטריפוגציה, השהו מחדש את המשקע ב-200 micro liters של בופר PBS קר, בריכוז של פי 5 עד 10 מהריכוז של 10⁶ תאים למל, והוסיפו 5 micro liters של תערובת נוגדנים biotinylated anti-human ספציפיים לתאי דם עבור כל 10⁶ תאים. לאחר דגירה של 30 דקות על קרח, שטפו את התאים בנפח עודף של פי 10 של PBS סטרילי והשהו מחדש את המשקע ב-5 micro liters של מיקרו-בידס המצומדים ל-streptavidin עבור כל 10⁶ תאים, לדגירה של 30 דקות על קרח.בסיום הדגירה, הוסף 2 ml של באפר PBS לתאים והנח את המבחנה על מעמד מגנטי למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. כאשר המיקרו-בידס (micro beads) נצמדים לדופן המבחנה, העבר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה קונית חדשה והוסף 2 ml נוספים של באפר PBS לתאים. לאחר איסוף הנוזל העליון השני, אסוף את כלל התאים על ידי צנטריפוגציה והעבר את התאים למבחנת פוליסטירן של 5 ml ולבאפר PBS טרי בריכוז של עשירית (1/10) מריכוז של 7 תאים ל-ml.לאחר ביצוע חסימה לא ספציפית, הוסף מיקרוגרם אחד של כל נוגדן נבחר לכל עשירית ממיליון תאים לשפופרה בערבוב עדין, לדגירה של 30 דקות על קרח. בחמש הדקות האחרונות של הדגירה, הוסף 5 µL של 7-AAD לתאים. לאחר מכן, הוסף 2 mL של PBS רענן לתאים ובצע ערבוב במכשיר vortex לפני הסנטריפוגציה.שחזר את המשקע בבופר מיון טרי בריכוז של 1-5 × 10⁵ תאים למיליליטר, וסנן את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון אל תוך מבחנה חדשה של 5 מיליליטר מפוליסטירן. לאחר מכן, בצע מיון של התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה לשלוש מבחנות של 15 מ"ל המכילות 5 מ"ל של מצע RPMI טרי, על מנת לאסוף תאי B נאיביים, תאי B זיכרון ותאי פלסמבלסט/פלסמה. לאחר איסוף כל התאים, זרע את תתי-האוכלוסיות לבארים בודדות בפלטת תרבית תאים של 12 בארים בריכוז של 1-10 × 10⁵ תאים למיליליטר במצע RPMI טרי.לאחר מכן, הפעילו את תאי ה-B באמצעות 5 µg של CPG ODN 2006 לכל 1×10⁶ תאים ל-mL לכל באר, במדגרה לתרביות תאים למשך חמישה ימים. בסיום ההפעלה, הוסיפו 30 µL של 35% ethanol ומים מזוקקים לכל באר בלוחות ה-ELISpot למשך 30 שניות. לאחר מכן, החליפו את האתנול בכל באר ב-150 µL של מים מזוקקים כפולה שעברו אוטוקלאב, והדגרימו את הלוחות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי להסיר את שאריות האתנול.בצעו שטיפה ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL של הפרגמנט הפוליקלונלי FAB2 של anti-human IG לכל באר. שטפו את הפלטות פעמיים ב-PBS כפי שהודגם זה עתה. חסמו את הקישור הבלתי ספציפי בכל באר באמצעות 200 µL של PBS טרי עם BSA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר סדרת שטיפות נוספת ב-PBS, דגרו את הבארים ב-100 µL של מצע RPMI 1640 טרי בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, החליפו את המצע בכל באר ELISpot במספר המתאים של תאי B מופעלים. השלימו את הנפח הסופי של כל באר ל-150 µL באמצעות מצע RPMI טרי, והחזירו את פלטת ה-ELISpot למדגרת תרבית התאים למשך 8 עד 14 שעות.בסיום תקופת הדגירה, יש להסיר את המצע ולשטוף את הבארים עם 200 µL של PBS plus tween20 בחמישה שלבי שטיפה, כל אחד למשך שלוש דקות. לאחר השטיפה האחרונה, יש להוסיף את נוגדני הגילוי המתאימים לבארים הרלוונטיות ולהדגיר את הפלטות למשך שעתיים בחושך. לאחר סדרת שטיפות נוספת ב-PBS, יש להוסיף 50 µL של תסבך BCIPMBT לכל באר למשך 5 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר.כאשר מופיעים כתמים סגולים, יש לעצור את התגובה באמצעות 100 µL של מים מזוקקים פעמיים לכל באער ולשטוף את הפלטה במי ברז זורמים. לאחר מכן, יש לייבש את ממברון ה-ELISpot באוויר תוך הגנה מאור. במדגם PBMC של תורם זה, לאחר ליזיס של כדוריות דם אדומות והסרה של תאים דבקים, כ-10 אחוזים מהלימפוציטים היו תאי B חיוביים ל-CD19.במדגם תאי ה-B, כ-50 אחוזים מהתאים היו תאי B נאיביים שליליים ל-CD27, ו-50 אחוזים היו תאי B של זיכרון המבטאים CD27. טיפול ב-CPG של תאי B אנושיים מופרשים ו-CD19+CD27+ למשך חמישה ימים, כפי שהודגם זה עתה, מוביל בדרך כלל להיווצרות של 50 עד 200 תאים מפרישי נוגדני IgM ו-10 עד 50 תאים מפרישי נוגדני IgG מתוך $1 \times 10^4$ תאי B מופעלים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את טכניקת ה-ELISpot הזו בשלוש שעות אם היא מבוצעת כהלכה.לפני תחילת הליך זה, חשוב לזכור לסמן את המקום עם ריאגנטים מתאימים ללכידה לצורך זיהוי התאים המפרישים נוגדנים. לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הוואקצינולוגיה לבחון את יעילות החיסונים בניסויים רחבי היקף ובמעקבים ארוכי טווח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מטהרים תאי B אנושיים מהדם.הפרידו תאי B נאיביים ותאי B זיכרון לצורך בידולם ובצעו בדיקת ELISpot להערכת תאים מפרישי נוגדנים. זכרו כי עבודה עם דם אנושי עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

זיהוי מטרות מיקרוביאלי של חסינות אדפטיבית במחלות אידיופטית ניתן להשיג על ידי שימוש assay האנזים צמוד immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של תאי B מדם היקפי אנושי באמצעות נוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לתאים שאינם מסוג B ומיקרו-כדוריות מגנטיות מצומדות סטרפטווידין.

בידוד וטיהור תאי B מדם היקפי אנושי

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול למיון מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי B נאיביים, תאי זיכרון B ותת-אוכלוסיות של תאי פלזמה פלסמה פלסמבלאסטים מתאי דם היקפיים אנושיים מסוג B. ניתן להבחין בין תת-האוכלוסיות השונות של תאי B בהתבסס על קשירת נוגדנים מבוססי פלואורופור לקולטני CD19, CD27 ו-CD38 המבוטאים על פני השטח של תאי B, ולאחר מכן מיון תאים.

מיון תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה עבור אוכלוסיות שונות של תאי B במחזור הדם

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת ELISpot כדי להעריך את תפקודם של תאי B מפרישי נוגדנים, ASC. הנוגדנים המופרשים על ידי ASCs אינטראקציה עם מקטעי נוגדנים רב-שבטיים הקשורים לקרום, אשר מזוהים על ידי נוגדני IgG או IgM מצומדים אנזים. הכתם הצבעוני שנוצר בכל באר מעיד על נוכחות איזוטיפ של הנוגדן הספציפי, אשר נמצא בקורלציה עם פעילות ההפרשה של תאי B.

הערכה תפקודית של תאי B מפרישי נוגדנים באמצעות בדיקת ELISpot

דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

שיטה פשוטה אך יעילה המעסיקה חלקיקים מגנטיים כדי לזהות ולהעשיר תאי B-reactive אנטיגן לניתוח פונקציונלי פנוטיפי מתואר.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

בדיקות חיסוניות מבוססות דם מלא מספקות כלי קל וחסכוני במשאבים לניתוח חסינות ספציפית לאנטיגן למטרות אבחון ומחקר. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי מבוסס דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח מקיף של חסינות המאכסן לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים, כולל גרסה בנפח נמוך עבור חולים ילדים ובעלי חיים קטנים.

בדיקת דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח ספציפי לאנטיגן של חסינות המארח לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים

למדו לכמת תאי B מפרישי נוגדנים מדם אנושי באמצעות שיטת ELISpot. שיטה זו מאפשרת זיהוי ומדידה ברמת התא הבודד, ומסייעת במחקר חיסונים וביולוגיה של תאי B.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

גלה סרטונים נוספים