הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

המטרה הכוללת של מתודולוגיית ELISpot זו היא לאפשר כימות של תאי B המפרישים נוגדנים אנושיים מהדם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-רפואי על האימונולוגיה של תאי B ומחקר חיסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי ומדידה של תאי B המפרישים נוגדנים ברמת התא הבודד.

מי שידגים את ההליך יהיה צונג-צ'י צנג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. מיד לאחר קבלת דגימת דם של 10 מ"ל מהווריד הקוביטלי החציוני לתוך שפופרת של 15 מ"ל המכילה אשלגן בתוספת EDTA, הפוך את הצינור מספר פעמים כדי למנוע היווצרות קרישים. לאחר מכן הוסף 35 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים אוטוקלאב לתאים למשך חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר.

כאשר ניתן לצפות באור דרך הצינור, צנטריפוגה את הדם ואשר נוכחות של כדור לבן. הסר את מאגר הליזיס השיורי עם 10 מ"ל של PBS שעבר חיטוי והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מדיום RPMI 1640. צלחת את התאים בתבנית תרבית של 10 ס"מ למשך 30 דקות דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני.

לאחר מכן סובבו בעדינות את צלחת התרבות כמה פעמים והעבירו את התאים הצפים לצינור חרוטי מפלסטיק של 15 מ"ל. לאחר שתי שטיפות על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה בחמש עד 10 פעמים עשירית מריכוז ששת התאים למ"ל ב-200 מיקרו ליטר של מאגר PBS קר והוסיפו 5 מיקרו ליטר של קוקטייל נוגדנים אנטי-אנושיים ביוטיניל ספציפי לתאי דם לכל אחד כפול עשירית מהתאים השישיים. לאחר דגירה של 30 דקות על קרח, שטפו את התאים בנפח עודף פי 10 של PBS סטרילי והשעו מחדש את הגלולה בחמישה מיקרו ליטר של מיקרו חרוזי מיקרו מצומדים של סטרפטווידין לכל עשירית מששת התאים למשך 30 דקות דגירה על קרח.

בתום הדגירה הוסיפו שני מ"ל של מאגר PBS לתאים והניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. כאשר חרוזי המיקרו נצמדו לדופן הצינור, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לתוך צינור חרוטי חדש והוסיפו עוד 2 מ"ל של מאגר PBS לתאים. לאחר איסוף הסופרנטנט השני, אסוף את התאים שנאגרו על ידי צנטריפוגה והעביר את התאים לצינור פוליסטירן של חמישה מ"ל ומאגר PBS טרי בריכוז אחד כפול עשירית משבעת התאים למ"ל.

לאחר ביצוע חסימה לא ספציפית, הוסף מיקרוגרם אחד מכל נוגדן בחירה לכל אחד כפול עשירית מששת התאים לצינור עם ערבוב עדין למשך 30 דקות דגירה על קרח. במהלך חמש הדקות האחרונות של הדגירה הוסיפו חמישה מיקרו ליטרים של 7-AAD לתאים. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר PBS טרי לתאים ולמערבולת לפני הצנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה במאגר מיון טרי בריכוז של 1 עד 5 פעמים עשירית משבעת התאים למיליליטר וסננו את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור פוליסטירן חדש של חמישה מיליליטר. לאחר מכן מיין את התאים לפי זרימה ציטומטרית לשלושה צינורות של 15 מ"ל המכילים 5 מ"ל של מדיום RPI טרי כדי לאסוף את תאי B הנאיביים, תאי זיכרון B ותאי פלזמה פלזמבלסט. לאחר שכל התאים נקצרו, זרעו את תת-הקבוצות לבארות בודדות של צלחת תרבית תאים של 12 בארות בריכוז של 1 עד 10 פעמים עשירית מהתאים החמישיים למיליליטר ריכוז במדיום RPMI טרי.

לאחר מכן הפעל את תאי B עם חמישה מיקרוגרם של CPG ODN 2006 לאחד כפול עשירית מהתאים השישיים לליטר לבאר בחממת תרבית התאים למשך חמישה ימים. בתום ההפעלה יש להוסיף 30 מיקרו ליטר של 35% אתנול ומים מזוקקים לכל באר של צלחות ELISpot למשך 30 שניות. לאחר מכן החליפו את האתנול בכל באר ב-150 מיקרו ליטר מים מזוקקים כפולים ודגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי להסיר את שאריות האתנול

בצע שטיפת PBS ואחריה תוספת של 50 מיקרו ליטר של שבר FAB2 הפוליקלונלי של IG אנטי אנושי לכל באר. שטפו את הצלחות פעמיים עם PBS כפי שהודגם זה עתה. חסום את הכריכה הלא ספציפית בכל באר עם 200 מיקרו ליטר PBS טרי עם BSA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

לאחר סדרת שטיפה נוספת של PBS, דגרו את הבארות ב-100 מיקרו ליטר RPMI 1640 בינוני טרי ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן החלף את המדיום בכל באר ELISpot במספר המתאים של תאי B פעילים. הביאו את הנפח הסופי של כל באר ל-150 מיקרו ליטר עם מדיום RPMI טרי ואז החזירו את צלחת ELISpot לחממת תרבית התאים למשך שמונה עד 14 שעות.

בתום תקופת הדגירה, השליכו את המדיום ושטפו את הבארות עם 200 מיקרו ליטר PBS בתוספת tween20 למשך חמש, שלוש דקות. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף את נוגדני הזיהוי המתאימים לבארות המתאימות להם ודגר את הצלחות למשך שעתיים בחושך. לאחר סדרת כביסה נוספת של PBS, הוסף 50 מיקרו ליטר של מצע BCIPMBT לכל באר למשך חמש עד 15 דקות בטמפרטורת החדר.

כאשר מופיעים כתמים סגולים, עצרו את התגובה עם 100 מיקרו ליטר מים מזוקקים כפולים לבאר ושטפו את הצלחת במי ברז זורמים. לאחר מכן יבש באוויר את קרום ELISpot מוגן מפני אור. בדגימת PBMC זו של תורם, לאחר ליזה של תאי דם אדומים ודלדול תאים דבקים, כ-10 אחוזים מהלימפוציטים היו תאי B חיוביים ל-CD19.

בתא תאי B כ-50 אחוז מהתאים היו תאי B נאיביים שליליים CD27 ו-50 אחוז היו CD27 המבטאים תאי זיכרון B. טיפול ב-CPG בתאי B אנושיים מטוהרים ו-CD19+CD27+, למשך חמישה ימים, כפי שהודגם זה עתה, מביא בדרך כלל ליצירת תאי הפרשה של 50 עד 200 IgM ו-10 עד 50 תאי IgG המפרישים מ-10 עד 4 תאי B המופעלים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקת ELISpot זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

לפני שמתחילים בהליך זה, חשוב לזכור לקודד את המקום עם סוכני לכידה מתאימים לזיהוי התאים המפרישים נוגדנים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום החיסונים לחקור את יעילות החיסון בניסויים בקנה מידה גדול ובמעקבים אורכיים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר תאי B אנושיים מהדם.

הפרד תאים נאיביים ותאי זיכרון B לצורך התמיינותם ובצע חיבור ELISpot כדי להכשיר תאים מפרישי נוגדנים. אל תשכח שעבודה עם דם אנושי עלולה להיות מסוכנת וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.