Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לרתום את בקרת איכות הקיפול של מסלול הטרנסלוקציה התאומה-ארגינין כדי להנדס קשירת שברי נוגדנים וקיפול תוך תאי בשלב אחד שיהיו לו יישומים בהנדסת נוגדנים לתפקוד תוך תאי. שיטה זו יכולה לסייע להתגבר על אתגרים מרכזיים בתחום הנדסת הנוגדנים כגון התגברות על הקושי בהנדסת נוגדנים להתקפל ולתפקד כראוי בסביבה הציטופלזמית המצמצמת. רק נוגדנים המתקפלים היטב בציטופלזמה מוצגים ונבדקים לקשירה.

מתן יתרון על פני תצוגת שמרים ופאג'ים המסתמכים על מסלולי הפרשה לתצוגה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול שלנו במחלות ניווניות, סרטן וזיהומים נגיפיים מכיוון שמחלות אלה כרוכות בפתוגנזה תוך-תאית שיכולה להיות ממוקדת על ידי נוגדנים. הדגמה ויסאלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שההבנה כיצד לייצר ולעבוד עם ספרופלסטים היא מאתגרת.

לאחר מיזוג ספריית scFv לרצף האותות ssTorA והגדלתו ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול במשך שלוש שעות, אפשר ביטוי של ספריית scFv ב-20 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך הלילה למשך 15 עד 22 שעות. לאחר הדגירה, השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. לאחר מכן צנטריפוגה את הנפח המחושב של תרבית מושרית בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ב-12,000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט והשתמש ב-100 מיקרוליטר של מאגר פיצול קר כקרח או fB כדי להשעות מחדש את הכדורים. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב 12, 000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר הסרת הסופרנטנט, השתמש ב-350 מיקרוליטר של fB קר כקרח בתוספת 3.5 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר ליזוזים כדי להשעות מחדש את הכדורים.

לאחר מכן, תוך כדי מערבולת איטית של הצינורות, הוסף טיפה של 700 מיקרוליטר של 1 מילימולר EDTA ואז דגר את הצינורות על מסובב צינור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לערבב את הדגימות. הסר את הצינורות מהמסובב. הוסף 50 מיקרוליטר של MgCl2 קר כקרח לכל צינור ודגר אותם על קרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב -11, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כעת, בעזרת מיקרופיפטה וקצה מיליליטר אחד, משוך לאט לאט חלק מהגלולה. לאחר מכן, תוך כדי החזקת הצינור, בזווית עם הפתח ישירות מעל צינור חדש של 1.5 מיליליטר, הרם לאט את קצה הפיפטה מהסופרנטנט והחלק את הגלולה לתוך הצינור החדש.

לאחר הסרת עודפי סופרנטנט, השתמש במיליליטר אחד של PBS קר כקרח כדי להשעות מחדש את הספרופלסטים. יש להשעות מחדש לחלוטין את הספרופלסטים לפני הגלילה מכיוון ש-scFvs לא מחייבים הקיימים באגרגטים יובילו לתוצאות חיוביות כוזבות מהגלילה. לאחר ביוטיניליזציה של אנטיגן המטרה על פי פרוטוקול הטקסט, השעו מחדש חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין בבקבוקון המקורי שלהם.

לאחר מכן העבירו שבע עד 10 פעמים 10 לחרוזים התשיעי לצינור של 1.5 מיליליטר. הנח את צינור החרוזים על המדף המגנטי למשך שתי דקות כדי לאסוף את החרוזים בצד הצינור ופיפטה כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט. הסר את הצינור מהמגנט והשתמש ב-PBS כדי להשעות מחדש את החרוזים מבלי ליצור בועות.

לאחר מכן החזר את הצינור למגנט והסר את המאגר לפני שטיפת החרוזים פעמיים נוספות עם PBS. הוסף מיליליטר אחד של ליזאט המכיל את האנטיגן הביוטיניל לחרוזים ודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב עדין. לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS עם 1% BSA כדי לשטוף את החרוזים חמש פעמים.

לאחר מכן השתמש ב-PBS עם 1%BSA כדי להשעות מחדש את החרוזים. כדי לסנן את ספריית scFv, התחל בהוספת ארבע פעמים 10 לספרופלסט התשיעי ושמונה כפול 10 לחרוזים השמיני לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. הוסף PBS אחד עם 1% BSA כדי להביא את הנפח הכולל לארבעה מיליליטר.

לאחר מכן יש להכניס את התמיסה לארבעה צינורות של 1.5 מיליליטר כל אחד ולדגור את התגובות בארבע מעלות צלזיוס על ידי סיבוב עדין במשך חמש שעות. כדי להכין את הספרופלסטים הקשורים בחרוזים ל-PCR, הנח את צינורות תגובת הפאנינג על המגנט למשך שלוש דקות. הסר את הסופרנטנט ושטוף את החרוזים עם PBS אחד עם 1% BSA ארבע פעמים כמו קודם.

לאחר מכן השתמש ב-25 מיקרוליטר של ddH20 לכל צינור כדי להשעות מחדש את החרוזים. כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בצע PCR שלם של פלסמיד כדי להגביר את הגנים עבור scFvs הקשורים לחרוזים ולאחר מכן להקיף מחדש את הפלסמיד מתוצר ה-PCR. הפוך את התגובה כולה לתאים משווים MC4100 על פי פרוטוקול הטקסט.

כדי לזהות שיבוטים באמצעות ELISA, הפשירו צינור אחד של תת-הספרייה והצלחת הפנורמית על לוחות אגר LB. הוסף 200 מיקרוליטר LB עם 20 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול לכל באר של צלחת תרבית תחתונה עגולה של 96 בארות. בעזרת קצה פיפטה, בחר מושבה בודדת מצלחת האגר.

לאחר מכן מניחים את הקצה בבאר הראשונה של צלחת 96 הבאר ומערבבים בעדינות לחיסון. המשך לחסן מושבה אחת לכל באר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 24 שעות על שייקר מיקרופלייט.

לאחר הכנת תמיסת ציפוי אנטיגן יעד על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 50 מיקרוליטר מהתמיסה לכל באר של פלטת פוליסטירן ELISA שקופה בעלת 96 בארות. דגרו את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, שכפל את המושבות מ-96 צלחות תרבית הבאר על צלחות אגר על פי פרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, רוקנו את תמיסת הציפוי מלוחות ELISA והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה שהוכנה על פי פרוטוקול הטקסט לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסף 20 מיקרוליטר של חומר ניקוי ליזה תאים מרוכז לכל באר של צלחת התרבות התחתונה העגולה ודגר את צלחת התרבות על שייקר מיקרופלייט בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות.

רוקנו את תמיסת החסימה מלוחות ELISA ושטפו את הבארות ארבע פעמים עם 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפה שהוכן על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר הסרת הכביסה הסופית, העבירו 50 מיקרוליטר מכל באר של צלחת הליזיס של התאים לבאר המתאימה של צלחת ELISA. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים.

המשך לרוקן את הדגימות מצלחת ELISA ולשטוף את הבארות ארבע פעמים. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הנוגדנים לאיתור scFvs על פי פרוטוקול הטקסט. מוסיפים 50 מיקרוליטר של הנוגדן לכל באר ודוגרים במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר.

שטפו את צלחות ELISA ארבע פעמים עם מאגר כביסה לפני הוספת 200 מיקרוליטר לבאר של מצע HRP שהוכן על פי פרוטוקול היצרן. דגרו את הצלחות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. כדי להרוות את התגובה, הוסף 50 מיקרוליטר של שלושה H2SO4 טוחנת לכל באר ופיפטה בעדינות כדי לערבב את התמיסה.

לבסוף, מדוד את הספיגה באמצעות קריאת צלחת ב-492 ננומטר. בניסוי זה, נוגדנים scFv scFv13 ו-scFv13. R4 התמזגו לרצף ssTorA המקורי או ל-ssTorA שונה שאינו מזוהה על ידי מסלול הטרנסלוקציה התאום-ארגינין, הנקרא גם מסלול Tat.ScFv.

R4 מתקפל היטב ומתבטא על הממברנה הפנימית כאשר הוא מוזרק ל-ssTorA מקורי. ScFv13 אינו מתקפל היטב ואינו מוצג על הממברנה הפנימית ללא קשר לאיזה פפטיד אות Tat הוא מתמזג. תוצאות אלה מדגימות כי רק חלבונים המכילים את פפטיד אות Tat ומקופלים כהלכה בציטופלזמה מוצגים על הממברנה הפנימית, מה שמאפשר למסלול Tat לתפקד כמסך לקיפול תוך תאי.

בניסוי זה, ספריית PCR מועדת לשגיאות המבוססת על scFv13, שיש לה רמה נמוכה של זיקה מחייבת לבטא-גלקטוזידאז הופעלה כנגד בטא-גל. ScFv 1-4 בודד והפגין זיקה קשירה גבוהה יותר לבטא-גל מאשר scFv13, כמו גם רמה גבוהה יותר של מסיסות ציטופלזמית. באמצעות scFv 1-4 כמתחרה מול ספריית scFv 1-4 מהדור השני, scFv 2-1 ו-2-3 בודדו והפגינו זיקות קשירה גבוהות עוד יותר לבטא-גל מאשר scFv13 1-4, מה שמדגיש את ההנדסה בו-זמנית של מסיסות וקשירת אנטיגן.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA המשתמשות בליזאט מטוהר על מנת לאמת את ספציפיות האנטיגן ולקבוע את זיקת הקישור של שיבוטים מבודדים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין כיצד לסנן נוגדן שיפעל לקשירה לאנטיגן מעניין על ידי שימוש במסלול Tat כדי להציג את הספרייה הזו והזזת חרוזים מגנטיים כדי להעשיר ולבודד קלסרי אנטיגן. אל תשכח שעבודה עם חומצה גופרתית עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש צורך בלבישת ציוד מגן אישי מתאים.