Name: Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: למדו שיטת תצוגת קרום פנימי בחיידקי E. coli לסינון שברי נוגדן לקישוריות ומסיסות. טכניקה זו מאפשרת הנדסת נוגדנים תוך-תאיים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לתומר זוהר על עבודתו על בדיקות סינון ואפיון scFv. חלק מעבודה זו נתמך על ידי פרס מספר F32CA150622 מהמכון הלאומי לסרטן (ל-AJK). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+immunization+with+cytosolic+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies.</a> Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).</li>
<li>Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+antibodies+as+a+new+class+of+therapeutic+molecules+for+gene-therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy.</a> Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).</li>
<li>Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+antibody+fragments+neutralizing+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+provide+an+experimental+basis+for+the+structural+classification+of+the+DNA+polymerase+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family.</a> J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).</li>
<li>Mhashilkar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+Tat-mediated+LTR+transactivation+and+HIV-1+infection+by+anti-Tat+single+chain+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies.</a> Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).</li>
<li>Strube, R. W., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anti-cyclin+E+single-chain+Fv+antibodies+and+intrabodies+in+breast+cancer+cells%3A+enhanced+intracellular+stability+of+novel+sFv-F-c+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies.</a> J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).</li>
<li>Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+selection+of+antibodies+without+antigen+purification%3A+adaptation+of+the+protein+fragment+complementation+assay+to+select+antigen-antibody+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs.</a> J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).</li>
<li>Wörn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).</li>
<li>Knappik, A., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+turns+of+a+recombinant+antibody+improve+its+in+vivo+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding.</a> Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).</li>
<li>Martineau, P., Jones, P., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+antibody+fragment+at+high+levels+in+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm.</a> J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).</li>
<li>Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+statistics+reliably+predict+stabilizing+mutations+in+a+protein+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain.</a> J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).</li>
<li>Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+with+bacterial+display%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering with bacterial display.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 474-480 (2007).</li>
<li>Lener, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverting+a+protein+from+its+cellular+location+by+intracellular+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies.</a> Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).</li>
<li>Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+scFv+intrabody+against+the+nonamyloid+component+of+%CE%B1-synuclein+reduces+intracellular+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity.</a> J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).</li>
<li>Gai, S. A., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+for+protein+engineering+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display for protein engineering and characterization.</a> Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).</li>
<li>Kieke, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+functional+T+cell+receptor+mutants+from+a+yeast+surface-display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).</li>
<li>Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+sequences+directing+cotranslational+translocation+expand+the+range+of+proteins+amenable+to+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display.</a> Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).</li>
<li>Pugsley, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+general+secretory+pathway+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria.</a> Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).</li>
<li>Rapoza, M. P., Webster, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filamentous+bacteriophage+assembly+proteins+require+the+bacterial+SecA+protein+for+correct+localization+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane.</a> J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).</li>
<li>Karlsson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antibody+fitness+and+function+using+membrane-anchored+display+of+correctly+folded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins.</a> J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).</li>
<li>DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+quality+control+in+the+export+of+proteins+by+the+bacterial+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).</li>
<li>Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+for+protein+solubility+enabled+by+the+folding+quality+control+feature+of+the+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway.</a> Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).</li>
<li>Maynard, J., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Antibody engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 339-376 (2000).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, Fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioNumbers--the+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioNumbers--the database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Third, Elsevier/Academic Press. (2013).</li>
<li>Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+using+streptavidin+magnetic+bead-sorted+in+vivo+biotinylated+survivin+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production.</a> J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).</li>
<li>Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+inhibition+of+nucleosome+mobility+and+transcription+by+cisplatin-DNA+interstrand+crosslinks+in+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells.</a> Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).</li>
<li>Bogsch, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+component+of+a+novel+bacterial+protein+export+system+with+homologues+in+plastids+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).</li>
<li>Julian, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+affinity+and+stability+of+grafted+amyloid-motif+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies.</a> Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+rise+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies rise again.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 13 (11), 799-801 (2014).</li>
<li>Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+in+vivo+knockdown+of+protein+function+by+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies.</a> MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הנדסת נוגדנים לפעילות ציטופלסמית היא משימה קשה בשל המילייה הצמצום של הציטופלסמה, אשר מעכבת את ההיווצרות של ייצוב אג&quot;ח דיסולפיד 6,7. זה גורם לרוב נוגדנים להיות פעיל cytoplasmically אלא אם כן הם מהונדסים ליציבות מסיסה בציטופלסמה, בנוסף להיות מהונדס לכריכת זיקה. השיטות הקיימות של תצוגה הפאג, תצוגת משטח חיידקים, ושיטות תצוגה שמרים משטח כל להשתמש מסלול ההפרשה 14-16 עבור התצוגה של נוגדנים מהונדסים, אך שיטות אלו לא היו אמצעים דרושים כדי להנדס מתקפלים תאי. נוגדנים המהונדסים באמצעות תצוגה פנימי-קרום השתפרו יציבות cytoplasmic ו מסיס כי בקרת איכות קיפול של מסלול טאט מונעת טרנסלוקציה של נוגדנים מקופלים גרוע ובלתי יציב בציטופלסמה. שיטה זו מפשטת את התהליך החוזר והנשנה של נוגדנים תאיים הנדסית זיקהמסיסות nd, כמו שני הנכסים מתוכננים בצעד אחד. אמנם שיטה זו תוכננה עבור הנדסת נוגדנים עם מסיסות בסביבת תאיים הצמצום, זה יכול לחול גם על נוגדני הנדסה לתפקד בתנאים הלא צמצום, מאז החלבונים מהונדסים בשיטה זו לשמור המתקפלים שלהם בסביבת החמצון של periplasm. למרות הטכניקה הזו מפשטת את תהליך הנדסת נוגדנים עם זיקה גבוהה מסיס cytoplasmic גבוהה, מספר מגבלות חשובות שיש להביא בחשבון בעת ​​שימוש בפרוטוקול זה. כאשר מנתחים את אותות ELISA המסך המשניים לזהות מבטיח scFv וריאנטים, סף הבחנה בין הגירסות מעניינות פוטנציאל ואלה לא יכולים להפגין נאותים אנטיגן מחייב אינו צפוי להיות ברור עד לאחר מספר שיבוטים מתאפיינים נוספים. חשוב לחפש השתפר מחייב על הנוגדן האם; למרות זאת,אות גבוהה באופן חריג יכולה להיות מעידה על להיטות 29 או תופעות צבירת 30, אתגר אשר אינו ייחודית לגישת הקרנת תצוגה הפנימי-הקרום. מגבלה מפתח שיש לזכור בעת השימוש בפרוטוקול זה היא חוסר היכולת לשחזר spheroplasts לאחר צילום פנורמי, כמו שהם לא-ישימות (נתונים שלא פורסמו). זו מחייבת הגברת DNA וצעדים טרנספורמציה לשחזר את פלסמידים קידוד-נוגדן. שלבים קריטיים כמה הפרוטוקול לאפשר ההנדסה סימולטני של קיפול ומחייבת של נוגדנים. להקרנה כדי להצליח, ספריית scFv שהוקרנה חייבת להיות מבוטאת היתוך הפפטיד אות ssTorA. ללא רצף זה, נוגדנים לא להיות מופנים אל מסלול טאט וכך לא יהיה translocated אל 19 periplasm. בנוסף, קיים הכרח כי תג epitope מסוף C הוא קבע את הנוגדנים כדי לאפשר זיהוי של נוגדנים המוצגים לפחמבחני דינג. אין ספק כי א coli זן נהג לבטא את scFvs חייב גם את מכונות מסלול טאט ההכרחיות, אבל זה נכון גם לגבי א הנפוץ קולי זנים. עשיית שינויים בפרוטוקול זה ניתן לשפר את הפוטנציאל שלה לבודד נוגדנים עם התכונות הרצויות. צעד פנורמי תוסף עלול להסתיים לפני פנורמי נגד אנטיגן היעד כדי לרוקן את ספריית scFv של מרכיבים הלא רצוי. Spheroplasts הספרייה ניתן מודגרות עם חרוזים מגנטיים צופה BCCP לבד או מצופה עם חלבון שאינו רצוי, ואת spheroplasts אשר נקלט על ידי חרוזים אלה יכול להיות מושלך לפני הקרנת spheroplasts המאוגד הנותר לכריכה ליעד הרצוי. כפי שהוזכר נציג התוצאות, שיטה לשיפור הזיקה של scFv מבודדת היא לכלול מתחרה מסיס התגובה פנורמי להתחרות scFvs מוצג על spheroplasts. מכיוון comp המסיסetitor הוא פרוטאין טהור, אין DNA מוגבר ממנו, כך רצפים רק של scFvs מוצג על spheroplasts יהיו התאוששו תגובת PCR. בנוסף, שיטה זו יכולה להתארך עד הנדסת סוגים אחרים של נוגדנים או חלבונים מחייבים הלא נוגדן. א תצוגה פנימית-קרום coli הנה פלטפורמה חזקה עבור נוגדני הנדסה עם זיקה גבוהה ורמות גבוהות של מסיסויות תאיות. שיטה זו מתאימה במיוחד עבור הנדסה יעילה של נוגדנים שנועדו לתפקד בסביבה התאית. נוגדנים תאיים אלה כבר נבדקים כמו רפויים פוטנציאליים במספר התחומים, לרבות מחלות ניווניות, סרטן, זיהומים נגיפיים 31. טכניקה זו תאפשר שימוש נרחב יותר של נוגדנים תאיים ככלי מחקר ורפואה בתחומים אלה בכל תחום אחר שבו לומד יעד חלבון באתרו הוא רצוי.

נוגדנים המסוגלים קיפול מתפקדים בסביבה התאית הם כלים מבטיחים הוא במחקר והן יישומים רפואיים. יש להם את היכולת לווסת את פעילות חלבונים באמצעות קשירה לחלבון יעד בתוך תאים על מנת למנוע אינטראקציות בין חלבונים, לשבש אינטראקציות חומצת חלבון גרעין, או למנוע גישת מצע אנזימי 1-5. אמנם יש נוגדני פוטנציאל רב עבור יישומים תאיים, ההנדסה להם לקיפול נכון מסיס בסביבת תאיים תוך שמירה על היכולת להיקשר אנטיגן יעד היא מאתגר. סביבת ציטופלסמית הצמצום מונעת ההיווצרות של אג&quot;ח דיסולפיד בדרך כלל נדרש עבור הקיפול היציב של נוגדנים באורך מלא ושברי נוגדן, כוללים שבר משתנה יחיד שרשרת (scFv) נוגדנים 6,7. מספר גישות אבולוציה מכוונת להיות מועסק להנדס נוגדנים עם hזיקות igh עבור היעד אנטיגנים 8-10. גישות אלה להשתמש תצוגה הפאג נפוצות, תצוגה משטחת שמרים, או תצוגת משטח חיידקי למסך ספריות גדולות של נוגדנים 11-13. שיטות אלה הם חזקים ויעילים לזיהוי נוגדנים הנקשרים מטרות, ובכל זאת הם תלויים מסלול הפרשה להובלת חלבונים אשר יוצג 14-16. מסלול הפרשה translocates חלבונים פרש מן הציטופלסמה צמצום לתוך לומן reticulum endoplasmic בשמרים או לתוך periplasm בחיידקים. החלבונים ואז לקפל בתנאי חמצון והם מוצגים על פני התא או ארוזים לחלקיקים הפאג למסך מחייב זיקת 17,18. כתוצאה מכך, נוגדנים המבודדים באמצעות טכניקות אלה לא בהכרח לקפל גם בציטופלסמה, מסיס תאי לעתים קרובות חייב להיות מהונדס בנפרד אם הנוגדנים לשמש ביישומים תאיים. לשפראת היעילות של נוגדנים הנדסה כי מקופלות גם בציטופלסמה, אנו שדווחנו בעבר להצלחה-TRAP MAD (תצוגת מעוגני קרום להכרה מבוססת טאט של חלבוני שיוך), שיטה לסינון ספריית נוגדן scFv באמצעות Escherichia coli inner- תצוגת קרום 19. תצוגה פנימית-קרום חיידקים מסתמכת על טרנסלוקציה התאום ארגינין (Tat) המסלול להובלת נוגדנים מוצגים, בניגוד לשיטות להציג משותף אחרים המשתמשות מסלול ההפרשה. מסלול טאט מכיל מנגנון בקרת איכות שרק מאפשר מסיסים, חלבונים מקופלים כראוי להיות מועברים מן E. הציטופלסמה coli, דרך הממברנה הפנימית, ולתוך 20,21 periplasm. מצעי overexpressed טאט (כלומר., חלבונים ממוקדים מסלול טאט עם פיוז&#39;ן N-terminal כדי הפפטיד אות טאט ssTorA) כי מקופלים גם בציטופלסמה יוצרים טרנסלוקציה חיים ארוך ביניים עם הסופית- N in בציטופלסמה ואת C- הסופית של 19 periplasm. זה מאפשר תצוגה של מצעים טאט מקופלים כהלכה, כוללים שברי נוגדנים, על פן periplasmic של E. הקרום הפנימי coli. לאחר הסרת הקרום החיצוני על ידי עיכול אנזימטי ליצור spheroplasts, נוגדנים נחשפים למרחב התאי (איור 1). זה מאפשר מצעי טאט מוצגים על הקרום הפנימי שיוקרו עבור מחייב יעד ספציפי. חשוב לציין, רתימת מסלול טאט לתצוגה על פני קרום תא מבטיחה כי רק את הנוגדנים בספרייה כי מקופלות גם בציטופלסמה ייחקרו לכריכה, המאפשר הנדסה סימולטני של מחייב זיקה וקיפול תאי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד להציג ספריית scFv על E. הקרום הפנימי coli, במחבת את הספרייה נגד אנטיגן היעד, ולבצע מסך משני כדי לזהות את המרכיבים המבטיחים ביותר של הספרייה. בעוד אנו מתמקדים<html> הפרוטוקול על scFvs, השיטה יכולה להיות מיושמת על הנדסת חלבון כלשהו שבקשתו דורשת קיפול מחייב תאי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> באיור 1. תצוגה פנימי-קרום טאט. בתוך א &#39; coli, נוגדנים scFv המתבטאים כמיזוג לרצף אות ssTorA ושילב כראוי בציטופלסמה מועברים דרך הממברנה הפנימית. טרנסלוקציה צורות ביניים, שבו scFvs מעוגנים בקרום הפנימי עם הסופית- N בציטופלסמה ואת C- הסופית של periplasm. .ה הממברנה חיצונית coli מתעכלת enzymatically לגבש spheroplasts, ובכך לחשוף את הנוגדנים המעוגנים במרחב התאי ולהפוך אותם לזמינים עבור זיהוי באמצעות נוגדן אשר נקשר תג epitope C- סופנים התמזג על הנוגדן המוצג.עומס / 54,583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

<table><tbody><tr><td>ספריית scFv</td><td>משתנה</td><td></td><td>יש להשיג ספריית scFv מתאימה ממקור מסחרי או אקדמי.</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli תאים</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6152</td><td>תאים צריכים להיות מוכשרים כימית או אלקטרו-מיומנים, בהתאם לשיטת הטרנספורמציה שנבחרה.</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>דיפקו מדיית תרבית מיובשת LB מרק, מילר (לוריא-ברטני)</td> <td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול (Cm)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט, דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-ביוטין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (חומר ניקוי לליזיס תאים)</td> <td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3,000&nbsp; daltons</td><td>GE מדעי הבריאות</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>אנטיגן יעד</td><td>משתנה</td><td>N/A</td><td>ניתן לרכוש או לייצר/לטהר אנטיגן מטרה מטוהר .</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>מגנט Dynamag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>מסובב צינור</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים IDT</td><td></td><td>N/A</td><td>רצפי פריימר הם כמתואר בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase מאגר תגובה</td> ניו <td>אינגלנד BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucelotide kinase (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>ודא שמאגר T4 ligase המשמש בתגובת זרחון הפריימר מכיל 1 מ"מ ATP.&nbsp;</td></tr><tr><td>חבילת חיץ 5x Phusion HF</td> תערובת תמיסות דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) של <td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>, 10 מ"מ כל אחת dNTP</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA פולימראז ניו</td><td>אינגלנד BioLabs</td><td>M0530S</td><td>פולימראזים אחרים בעלי נאמנות גבוהה עשויים לשמש כחלופה, אך יש לכוונן את טמפרטורת החישול בטבלה <חזקה>3</חזקה>.</td></tr><tr><td>C1000 Touch תרמי מחזורי עם מודול תגובה מהירה כפול 48/48</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>מיקרודיאליזה מסנן ממברנה</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות פוליסטירן עגול תחתון צלחות תרבית תאים</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar מכסי צלחות פוליסטירן כללי</td><td>קורנינג</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>שייקר צלחות מיקרוטיטר</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 באר EIA / RIA קל לשטוף שקוף שטוח תחתון פוליסטירן גבוה כריכה מיקרופלייט</td><td>קורנינג</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>בל-בלוטר פוליקרבונט 96 בארות כלי שכפול</td><td>בל-ארט מוצרי</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>חלב יבש מיידי ללא שומן</td><td>איכות ביולוגית</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20 (פוליסורבט 20)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>מגיב PopCulture (חומר ניקוי מרוכז לליזיס תאים)</td> <td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) המיוצר בעכבר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית (H2SO4), 10&nbsp; N פתרון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>ריינולדס לעטוף רדיד אלומיניום</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Epoch ספקטרופוטומטר מיקרופלייט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

נוגדנים המהונדסים לתפקוד תוך-תאי חייבים לא רק להיות בעלי זיקה לאנטיגן המטרה שלהם, אלא גם להיות מסיסים ומקופלים כהלכה בציטופלזמה. שיטות נפוצות לתצוגה וסינון של ספריות נוגדנים רקומביננטיות אינן משלבות בקרת איכות של קיפול חלבון תוך תאי, ולכן, יכולת קשירת האנטיגן והקיפול הציטופלזמי והמסיסות של נוגדנים מהונדסים בשיטות אלה חייבות לעתים קרובות להיות מהונדסות בנפרד. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינון ספרייה רקומביננטית של נוגדנים למקטע משתנה חד-שרשרת (scFv) לקשירת אנטיגן וקיפול ציטופלזמי תקין בו זמנית. השיטה רותמת את מנגנון בקרת איכות הקיפול התוך-תאי הפנימי של מסלול הטרנסלוקציה התאומה-ארגינין (Tat) של Escherichia coli כדי להציג ספריית scFv על הממברנה הפנימית של E. coli. מסלול ה-Tat מבטיח שרק חלבונים מסיסים ומקופלים היטב מועברים החוצה מהציטופלזמה ומוצגים על הממברנה הפנימית, ובכך מבטלים scFvs מקופלים בצורה גרועה לפני החקירה לקשירת אנטיגן. לאחר הסרת הממברנה החיצונית, ה-scFvs המוצגים על הממברנה הפנימית מופנים כנגד אנטיגן מטרה המשותק על חרוזים מגנטיים כדי לבודד scFvs הנקשרים לאנטיגן המטרה. מסך משני מבוסס בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA) משמש לזיהוי ה-scFvs המבטיחים ביותר לאפיון נוסף. ניתן לשפר את קשירת האנטיגן והמסיסות הציטופלזמית עם סבבים עוקבים של מוטגנזה וסינון כדי להנדס נוגדנים בעלי זיקה גבוהה ומסיסות ציטופלזמית גבוהה ליישומים תוך-תאיים.

מנגנון בקרת איכות קיפול חלבונים התאי של מסלול טאט ב E. coli מגביל הובלה על פני קרום התא הפנימי לחלבונים כי מקופלים היטב בסביבת ציטופלסמית הצמצום. על ידי overexpressing שילוב של scFv לרצף אות ssTorA (רצף האות מן החלבון טורה, אשר מועבר באופן טבעי על ידי נתיב טאט 20), טרנסלוקציה תקועה, וכתוצאה מכך התצוגה של scFvs על הקרום הפנימי 19. לאחר הפרעה אנזימטית של הממברנה החיצונית, הנוגדנים המוצגים נעשים זמינים לסינון לפעילות מחייב אנטיגן. היכולת לנצל את מסלול טאט לתצוגה scFv הוצגה על ידי קרלסון et al. 19 (איור 6). הנוגדנים scFv scFv13 ו scFv13.R4 היו התמזגו או רצף יליד ssTorA או ssTorA שונה כי חסרה את צמד שאריות ארגינין-ארגינין מוכר על ידימסלול טאט. scFv13.R4 תוכנן על ידי מרטינו et al. מן scFv13 באמצעות ארבעה סיבובים של אבולוציה מכוונת, והוא ידוע לקפל גם בציטופלסמה 9. ScFv זה הוצג על הקרום הפנימי, אבל רק כאשר מבוטא היתוך רצף האות ssTorA הילידים (איור 6). מנגד, scFv13 אינו מקופל היטב cytoplasmically 9, ולכן הוא אינו מוצג היטב על הקרום הפנימי, ללא קשר רצף האות שאליו הוא התמזג. בנוסף, אם scFvs התבטא תאים חסרי חלבון TatC, מרכיב חיוני של מכונות טאט 20,28, תצוגה לא נצפתה ומראה את הקשר החשוב בין תצוגה פנימית-קרום ואת מסלול טאט. תוצאות אלו מראות כי חלבונים רק המכילים הפפטיד האות טאט וכי מקופלים כראוי בציטופלסמה מוצגים על הקרום הפנימי, מה שמאפשר הובלה דרך מסלול טאט לתפקד כמסך עבור fol התאי<html> דינג. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> איור 6. איתור של scFvs מוצג על הקרום הפנימי. Cytometry זרימה הניתוח בוצע כדי לזהות את התצוגה של scFv13 מקופל היטב היטב מקופל scFv13.R4 על הקרום הפנימי. scFvs היו התמזגו יליד ssTorA או ssTorA (KK), שבו זוג Arg-Arg ברצף ssTorA שונה כדי ליס-ליס. תגיות epitope FLAG בטרמינל C-על scFvs התגלו עם isothiocyanate והעמסת (FITC), מצומדות נוגדן אנטי הדגל. תאים ללא חלבון TatC (ΔtatC) ו ssTorA-scFv13 ללא תג FLAG נבחנו כקבוצת ביקורת. M מצביע על ערך הקרינה החציוני. הודפס מחדש בהפניה 19 באישורו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> o: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; תצוגה פנימית-קרום יכול לבודד נוגדנים scFv בהצלחה עם רמות גבוהות של זיקה חלבון היעד ורמות גבוהות של מסיסות cytoplasmic. בנוסף, הסיבובים הבאים של אבולוציה מכוונת באמצעות תצוגה פנימי-קרום לשפר מאפייני נוגדן 19. כדי להמחיש זאת, ספריית PCR מועדת לטעויות מבוסס על scFv13, אשר יש רמה נמוכה של מחייב זיקה β-galactosidase, היה panned נגד-galactosidase β אנטיגן היעד באמצעות תצוגת פנורמי השיטה המתוארת בפרוטוקול. scFv 1-4 היה מבודד אחרי סיבוב אחד של mutagenesis פנורמי, והציג זיקה מחייבת גבוהה יותר בטא galactosidase מ scFv13 (איור 7 א) ועל רמה גבוהה יותר של מסיסות cytoplasmic (איור 7). ספרייה חדשה, המבוססת על scFv 1-4, נעשתה באמצעות מועדת לטעויות PCR, פנורמי של ספרייה דור שני זה נגדβ-galactosidase נעשה באמצעות שינוי של הפרוטוקול המתואר. פנורמי נגד β-galactosidase לסיבוב השני של אבולוציה נעשה בנוכחות המטוהר, מסיס scFv 14 כמתחרה לשפר את הסיכוי של בידוד שיבוטים עם זיקה חזקה יותר מאשר scFv 1-4. לאחר סיבוב שני זה של mutagenesis פנורמי, scFv 2-1 ו scFv 2-3 בודדו באמצעות ההקרנה משני המבוססת ELISA. scFvs אלה לא הוצגו רק זיקה מחייבת גבוהה עבור β-galactosidase מ scFv13, אלא גם הציג יותר מחייב מאשר שיבוט בסיבוב הראשון scFv 1-4. scFv 2-1 הציג-galactosidase β מחייב להשוותו לזה של scFv13.R4 (איור 7 א). scFv 2-3 גם מראה עלייה נוספת מסיסות ציטופלסמית לעומת scFv 14, המדגיש את ההנדסה סימולטני של מסיסות אנטיגן מחייב. מאז זיקה וביטוי מסיס של scFvs מוקרנים על זמנית, זה אפשרי כי שנבחר scFv מלון מודמסיסות erate אבל versa מחייב או סגן גבוה. לדוגמא, scFv 2-1 יש ביטוי מסיס נמוך יותר scFv 2-3, אבל הוא מפגין זיקה מחייבת גבוהה יותר בטא galactosidase. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> איור 7. יעד מחייב וביטוי cytoplasmic של scFv גרסאות מבודדים באמצעות התצוגה הפנימית-קרום. (א) scFvs התבטאו בציטופלסמה של E. קולי תאים (למשל., ללא רצף האות ssTorA) עם hexahistidine (6 × הזדרז) תג מטוהרים באמצעות עמודות ספין חומצה nitrilotriacetic ניקל. את הכריכה של scFvs מטוהרים בטא galactosidase נמדדה עם ELISA. scFvs המטוהר הועמס צלחות ELISA מצופה β-galactosidase, ואת scFvs כבול התגלה עם נוגדן אנטי 6 × הזדרז. הנתונים הם ממוצעים של שישה משכפל, ובר השגיאה מראה סטיית התקן של הממוצע.(ב) שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים של lysates תא מתאי המבטא את scFvs cytoplasmically נותחו על ידי כתם המערבי ומישש עם נוגדן אנטי 6 × הזדרז. ריכוז חלבון סה&quot;כ שמש לנרמל את הטעינה של הדגימות. הודפס מחדש (א) ומותאמת (B) בהפניה 19 באישורו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מספקים שיטה לסינון בו-זמנית של ספרייה של שברי נוגדנים לזיקה קשירה ומסיסות ציטופלזמית על ידי שימוש במסלול הטרנסלוקציה של Escherichia coli Twin-arginine, שיש לו מנגנון בקרת איכות מובנה לקיפול חלבון תוך תאי, כדי להציג את שברי הנוגדנים על הממברנה הפנימית.

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לרתום את בקרת האיכות של קיפול החלבונים במסלול ה-twin-arginine translocation כדי להנדס קישור של פרגמנטים של נוגדנים וקיפול תוך-תאי בשלב אחד, אשר יהיו לו יישומים בהנדסת נוגדנים לתפקוד תוך-תאי. שיטה זו יכולה לסייע בהתגברות על אתגרים מרכזיים בתחום הנדסת הנוגדנים, כגון הקושי בהנדסת נוגדנים המתקפלים ומתפקדים כראוי בסביבה הציטופלזמית המרדיחה. רק נוגדנים המתקפלים היטב בציטופלזמה מוצגים ונבדקים לבדיקת קישור.שיטה זו מספקת יתרון על פני תצוגת שמרים ופאג'ים, המסתמכות על מסלולים הפרתיים לצורך התצוגה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול במחלות נוירודגנרטיביות, סרטן וזיהומים נגיפיים, כיוון שמחלות אלו כרוכות בפתוגנזה תוך-תאית שניתן להכווין אליה נוגדנים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהבנת האופן שבו מייצרים ועובדים עם ספרופלסטים היא מאתגרת.לאחר היתוך ספריית ה-scFv לרצף האות ssTorA וגידולה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך שלוש שעות, יש לאפשר ביטוי של ספריית ה-scFv בטמפרטורה של 20 °C ובמהירות של 225 rpm למשך לילה, בין 15 ל-22 שעות. לאחר האינקובציה, השתמש בספקטרופוטומטר למדידת הצפיפות האופטית ב-600 nm. לאחר מכן, סבב בנפח המחושב של התרבית המושרה בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL במהירות של 12,000 ×g ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.הסיר את הנוזל העליון והשתמש ב-100 µL של תמיסת הפרדה (fractionation buffer או fB) קרה במיוחד כדי לסבב מחדש את המשקעים. לאחר מכן, סבב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 ×g בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר הסרת הנוזל העליון, השתמש ב-350 µL של fB קר במיוחד, בתוספת של 3.5 µL של ליזוזים בריכוז 10 mg/mL, כדי לסבב מחדש את המשקעים.בשלב הבא, תוך כדי ערבוב איטי במכשיר וורטקס (vortex), הוסיפו בטפטוף 700 µL של EDTA בריכוז 1 mM, ולאחר מכן דגרו את המבחנות במכשיר סיבוב מבחנות (tube rotator) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לערבב את הדגימות. הוציאו את המבחנות מהמסובב. הוסיפו 50 µL של MgCl2 בריכוז 0.5 M קר (מקרר בקרח) לכל מבחנה ודגרו אותן על קרח למשך 10 דקות.לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-11,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כעת, בעזרת מיקרופיפט עם טיפ של מיליליטר אחד, שאבו באיטיות חלק מהמשקע. לאחר מכן, תוך כדי החזקת המבחנה בזווית כך שהפתח יהיה ישירות מעל מבחנה חדשה של 1.5 מיליליטר, הרימו באיטיות את טיפ הפיפט מהנוזל העליון והחליקו את המשקע לתוך המבחנה החדשה.לאחר הסרת עודפי הנוזל העליון (supernatant), השתמשו ב-1 mL של PBS קר בקרח כדי לתלות מחדש את הספרופלסטים. יש לתלות את הספרופלסטים באופן מלא לפני תהליך ה-panning, מכיוון ש-scFvs שאינם נקשרים ונוכחים בצברים (aggregates) יובילו לתוצאות חיוביות שגויות מה-panning. לאחר ביוטיניליציה של האנטיגן מטרה לפי הפרוטוקול הכתוב, תלו מחדש חרוזי מגנט מצופים בסטראפטווידין בבקבוקון המקורי שלהם.לאחר מכן, העבירו שבעה עד 10 כפול 10⁹ חרוזיים למבחנה של 1.5 מיליליטר. הניחו את מבחנת החרוזים על מעמד מגנטי למשך שתי דקות כדי לרכז את החרוזים בצד המבחנה, ושאבו בזהירות את הנוזל העליון. הוציאו את המבחנה מהמגנט והשתמשו ב-PBS כדי לתליות מחדש את החרוזים באופן שאינו יוצר בועות.לאחר מכן, החזיר את המבחנה למגנט והסר את הבופר לפני שטיפת החרוצים פעמיים נוספות עם PBS. הוסף למספר החרוצים מיליליטר אחד של ליזאט המכיל את האנטיגן הביוטיניליביס והדגריט בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך סיבוב עדין. לאחר ההדגרה, השתמש ב-PBS עם 1% BSA כדי לשטוף את החרוצים חמש פעמים.לאחר מכן, השתמש ב-PBS עם 1% BSA כדי לתלה מחדש את החרוזים. כדי לסרוק את ספריית ה-scFv, התחל בהוספה של 4×10⁹ ספרופלסטים ו-8×10⁸ חרוזים למבחנה סטרילית של 15 מיליליטר. הוסף 1x PBS עם 1% BSA כדי להביא את הנפח הכולל לארבעה מיליליטרים.לאחר מכן, חלק את התמיסה לארבעה מבחנות של 1.5 מיליליטר, 1 מיליליטר בכל אחת, והדגר את התגובות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך כדי סיבוב עדין למשך חמש שעות. כדי להכין את הספרופלסטים הקשורים לחרוזים עבור PCR, הנח את מבחנות תגובת ה-panning על המגנט למשך שלוש דקות. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את החרוזים עם 1x PBS עם 1% BSA ארבע פעמים כפי שנעשה קודם לכן.לאחר מכן, השתמשו ב-25 µL של ddH2O לכל פרוביטה כדי להמיס מחדש את החרו지를. כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, בצעו PCR של הפלסמיד המלא כדי להגביר את הגנים עבור scFvs הקשורים לחרוזים, ולאחר מכן סגרו שוב את הפלסמיד למבנה מעגלי מתוצר ה-PCR. טרנספורמציה של התגובה כולה לתאי MC4100 משוכללים (equalized cells) בהתאם לפרוטוקול הכתוב.על מנת לזהות שיבולים באמצעות ELISA, הפשיר מבחנה אחת של תת-הספרייה שעברה מיון (panned sublibrary) וזראה על צלחות LB agar. הוסף 200 microliters של LB עם 20 micrograms per milliliter של chloramphenicol לכל באר של פלטת תרבית בעלת 96 בארים עם תחתית עגולה. בעזרת טיפ של פיפטה, בחר מושבה בודדת מצעת האגר.לאחר מכן, הכניסו את הקצה לבאר הראשונה של פלטת 96 הבארים וערבבו בעדינות כדי לבצע את ההחדרה. המשיכו להחדיר מושבה אחת לכל באר. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 24 שעות על מנער מיקרופלטות.לאחר הכנת תמיסת ציפוי של אנטיגן מטרה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 50 µL מהתמיסה לכל באר בלוח ELISA עשוי פוליסטירן שקוף בעל קישוריות גבוהה עם 96 בארות. הדגרימו את הלוחות בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. לאחר מכן, העבירו את המושבות מלוחי תרבית ה-96 בארות לצלחות אגר בהתאם לפרוטוקול הכתוב.לאחר מכן, רוקנו את תמיסת הציפוי מלוחיות ה-ELISA והוסיפו 100 microliters של תמיסת חסימה שהוכנה לפי פרוטוקול הטקסט לכל באר. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות או ב-4 degrees Celsius למשך הלילה. הוסיפו 20 microliters של דטרגנט מרוכז לליזיס תאים לכל באר בלוחית תרבית בעלת תחתית עגולה, והדגירו את לוחית התרבית על מנער מיקרו-לוחיות בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות.רוקנו את תמיסת החסימה מלוחיות ה-ELISA ושטפו את הבארות ארבע פעמים עם 200 µL של בופר שטיפה שהוכן לפי הפרוטוקול הכתוב. לאחר הסרת השטיפה האחרונה, העבירו 50 µL מכל בארה של לוח ליזיס התאים לבארה התואמת בלוחית ה-ELISA. דגרו את הלוחיות בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים.רוקנו את הדגימות מלוח ה-ELISA ושטפו את הבארות ארבע פעמים. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הנוגדנים לזיהוי scFvs בהתאם לפרוטוקול הכתוב. הוסיפו 50 µL מהנוגדן לכל בארה והדגירו למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר.יש לשטוף את פלטות ה-ELISA ארבע פעמים עם תמיסת שטיפה לפני הוספת 200 µL לכל באר של סובסטרט HRP שהוכן לפי פרוטוקול היצרן. יש להדגיר את הפלטות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. כדי לעצור את התגובה, יש להוסיף 50 µL של H2SO4 בריכוז 3 M לכל באר ולערבב בעדינות באמצעות פיפטה.לבסוף, מדדו את הבליעה באמצעות קריאת פלטה באורך גל של 492 ננומטר. בניסוי זה, נוגדני scFv13 ו-scFv13.R4 מהסוג scFv חוברו למסלול רצף ה-ssTorA הטבעי או ל-ssTorA משוער שאינו מזוהה על ידי נתיב הובלה של תאומת ארגינין, הנקרא גם נתיב ה-Tat.ScFv.R4 מתקפל היטב ומבוטא על ממבאר הפנימית כאשר הוא מחובר ל-ssTorA טבעי. ScFv13 אינו מתקפל היטב ואינו מוצג על ממבאר הפנימית, ללא קשר לפפטיד האות של Tat אליו הוא מחובר. תוצאות אלו מוכיחות כי רק חלבונים המכילים את פפטיד האות של Tat והמתקפלים בצורה נכונה בציטופלזמה מוצגים על ממבאר הפנימית, מה שמאפשר למסלול ה-Tat לתפקד כמסך סינון לקיפול תוך-תאי.בניסוי זה, ספריית PCR בעלת סבירות גבוהה לשגיאות המבוססת על scFv13, אשר הראתה רמת זיקה נמוכה לקישור לבטא-גלקטוזידאז, עברה סינון (panning) כנגד בטא-גל. scFv 1-4 בודד והפגין זיקת קישור גבוהה יותר לבטא-גל מאשר scFv13, וכן רמה גבוהה יותר של מסיסות ציטופלזמית. תוך שימוש ב-scFv 1-4 כמתחרה כנגד ספריית scFv 1-4 מהדור השני, בודדו scFv 2-1 ו-2-3 אשר הדגימו זיקות קישור גבוהות עוד יותר לבטא-גל מאשר scFv13 1-4, מה שמדגיש הנדסה סימולטנית של מסיסות וקישור לאנטיגן.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA באמצעות ליזאט מופרש כדי לאמת את הספציפיות לאנטיגן ולקבוע את זיקת הקשירה של קלונים מבודדים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להבין כיצד לסרוק נוגדן הפועל על ידי קישור לאנטיגן רצוי, תוך שימוש במסלול ה-Tat להצגת הספריה ובדיגום של חרוזי מגנט (magnetic bead panning) להעשרה ובידוד של קושרים לאנטיגן. זכרו כי עבודה עם חומצה גופרית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ונדרש שימוש בציוד מגן אישי מתאים.

bacterial-inner-membrane-display-for-screening-library-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטה מתוארת בליווי חזותי לניהול בחירות להרחבה, תפוקה גבוהות מספריות נוגדן סינתטיות קומבינטורית-מוצג הפאג נגד מאות אנטיגנים בו-זמנית. שימוש בגישה זו במקביל, יש לנו מבודד שברי נוגדן שמפגינים זיקה גבוהה וספציפיות לאנטיגנים שונים כי הם פונקציונליים בimmunoassays הסטנדרטי.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

כאן, המחברים מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל להגדרת אפיטופ אנטיגני ליניארי באמצעות נוגדן חד שבטי מטוהר וסריקת פפטידים באמצעות הכלאה של כתמי נקודות. לאחר מכן ניתן להשתמש באפיטופ שזוהה ביישומים טיפוליים ואבחנתיים.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

הפרוטוקולים תיאר מאפשרים אפיון ובניה, מבחר (נגד המטרה של הבחירה) ספרייה "domainome" גרם מכל מקור ה-DNA. זו מושגת על ידי צינור מחקר המשלב טכנולוגיות שונות: phage התצוגה, כתב מתקפלים, רצף הדור הבא עם כלי אינטרנט לניתוח נתונים.

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

כאן אנו מציגים שיטה לבחור עבור גרסאות הרומן של E. coli biotin-חלבון ליגאז בירה כי הביוטיטים מטרה מסוימת פפטיד. הפרוטוקול מתאר את בניית הפלסמיד לתצוגה החיידקית של פפטיד היעד, הדור של ספריית בירה, בחירה ואפיון של משתני בירה.

התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לביצוע קמפיינים לבחירת פני השטח של שמרים להעשרת וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן מעניין.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של נוגדן טיפולי מערכת ביטוי יונקת. השיטות שתוארו כוללות הכנת DNA וקטור, transfection היציבה והתאמת סרום ללא של קו תא 293 כליות עוברי אנושי, להקים תרבויות בקנה מידה גדולות טיהור באמצעות כרומטוגרפיה זיקה.

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

למדו שיטת תצוגת קרום פנימי בחיידקי E. coli לסינון שברי נוגדן לקישוריות ומסיסות. טכניקה זו מאפשרת הנדסת נוגדנים תוך-תאיים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות וסרטן.

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

גלה סרטונים נוספים