ה תסיסנית דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לנתח את הדיסקים והמוחות הדמיוניים של אנטנות העין של הדרוזופילה, הנושאים שיבוטים מוגדרים גנטית עם סימון פלואורסצנטי וכיצד לעבד אותם כדי לדמיין ולכמת שינויים בביטוי גנים ופולשניות לתאים. ההליכים המתוארים יכולים לעזור לספק תובנות חדשות לגבי תפקידם של גנים והתפתחות אפיתל, הומאוסטזיס או מחלה ולנתח את המנגנונים העומדים בבסיס התחרות שלהם, התפשטות מפצה או תאגיד בין-שבטי. היתרון העיקרי של המחקר הוא שאנו מספקים חבילה שלמה של פרוטוקולים המותאמים לניתוח כמותי ואיכותני מעמיק של הפסיפס הגנטי של הדרוזופילה.

בדרך כלל אנשים חדשים שעובדים עם מודל הדרוזופילה נאבקים מכיוון שהם לא יכולים לזהות את הדיסק הדמיוני של אנטנת העין מהדיסק הדמיוני השני. כדי להקל על זיהוי דיסק דמיוני הנושא שיבוטים בעלי סימון פלואורסצנטי בתוך גוף הזחל, מומלץ לבצע את החיתוכים הראשוניים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתוח פסיפס עם סמן תאים הניתן לדיכוי או MARCM מאפשר יצירת טלאים משובטים מוגדרים גנטית בהקשר פנוטיפי מסוג פראי.

FLP המונע על ידי מקדם חסר עין מזרז רקומבינציה בין שני רכיבי FRT המאגפים קלטת עצירה המסומנת בגן צהוב. לאחר שכפול ה-DNA, FLP מזרז את חילופי הכרומטידות הלא-אחיות בין הכרומוזומים ההומולוגיים המייצרים כרומטידות אחיות. האחד נושא את האלל מסוג הבר ומדכא Gal80 והשני את המוטאנט.

במיטוזה אלה נפרדים לייצור שני תאי בת, האחד הוא מוטנט הומוזיגוטי והשני סוג פראי. אובדן מדכא Gal80 מאפשר ביטוי GFP במוטנט בעוד שהתאים מסוג הבר נשארים שליליים ב-GFP. כדי להתחיל את הניסוי, קצרו זחלי פסיפס על ידי התזת PBS לתוך בקבוק הזבוב כדי לכסות את פני המזון.

לאחר מכן מרככים את השכבה העליונה בעזרת מרית ויוצקים את תמיסת המזון המכילה זחלים לתוך צלחת פטרי. קוטפים בעדינות את הזחלים ומעבירים אותם לצלחת עובר מלאה ב-PBS. אסוף לפחות 20 זחלים לצביעה חיסונית ו-80 זחלים לכימות פולשניות הגידול.

שטפו את הזחלים עם PBS כדי להסיר את כל שאריות המזון. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי בהגדלה של 8:16x, זהה והשליך את כל זחלי הנמר, שהם אלה המציגים כתמים חיוביים אקראיים של GFP בכל הגוף. מניחים את המנה המכילה את הזחלים הנותרים ב- PBS על קרח עד לדיסקציה.

כדי לנתח את הדיסק הדמיוני של אנטנת העין תחת מיקרוסקופ הסטריאו, השתמש בזוג מלקחיים אחד ותפס בעדינות את הזחל בערך ב-2/3 מאורך הגוף מאחורי הראש. עם זוג המלקחיים השני תפסו את ווי הפה של הזחל ומשכו אותם הרחק מהגוף. באמצעות מלקחיים מפרקים את ווי הפה מהציפורן המכסה ורקמות זרות כגון בלוטות הרוק וגוף השומן.

לחלופין, כדי להכין את קומפלקס המוח של דיסק אנטנות העין, תוך שמירה על חוט העצב הגחוני שלם, השתמש במלקחיים כדי לחתוך זחל במרכז הגוף. השלך את החצי האחורי. החזיקו את החצי הקדמי של גוף הזחל בקצות של זוג מלקחיים אחד, ואז הפכו את הזחל מבפנים החוצה על ידי דחיפת ווי הפה פנימה עם קצה הזוג השני וגלגול הציפורן מעליו עם זוג המלקחיים הראשון.

הסר בזהירות את כל הרקמות הזרות כולל המעיים, גוף השומן ובלוטות הרוק. משוך בעדינות את ווי הפה הרחק מהציפורן. שחרר את קומפלקס המוח של דיסק אנטנות העין המחובר לווים בפה על ידי ניתוק ההקרנות האקסונליות המשתרעות מחוט העצב הגחוני לשרירים ולאפידרמיס.

כדי להעביר את הרקמה יש לצפות תחילה קצה מיקרופיפטה P20 על ידי פיפטינג של פגרי הגוף הנותרים למעלה ולמטה מספר פעמים ולאחר מכן השתמש באותו קצה כדי להעביר את הרקמה המנותחת. כדי להעביר קומפלקסים גדולים יותר של דיסק אנטנות עין, חתוך מראש את קצה ה-P20 כדי להגדיל את הפתח. תקן את הדגימות ב-400 מיקרו-ליטר של קיבוע 4% PFA למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי אגוזים.

לאחר מכן הסר את הקיבוע ושטוף את הדגימות עם PBST שלוש פעמים למשך 10 דקות עם אגוזים. לאחר מכן, החלף את ה-PBST ב-500 מיקרו-ליטר של תמיסת צביעה DAPI והשתמש במשך 15 דקות בחושך. שטפו את הטישו פעם אחת למשך 10 דקות עם PBST.

כדי להשלים את הנתיחה השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר את הרקמה בחזרה לכלי זכוכית מלא PBS. שימוש בשני זוגות מלקחיים מפריד בין המוחות שישמשו לכימות פולשניות מהדיסקים של אנטנות העין על ידי חיתוך הגבעולים האופטיים. שחרר את דיסקי אנטנות העין על ידי חיתוך אותם מווים בפה.

הניחו טיפה של מדיום הרכבה על מגלשה חטופה ובעזרת מלקחיים מחלקים את הנוזל לשכבה דקה. כדי לכמת את הפולשנות, הניחו לפחות 80 מוחות קבועים שלמים עבור כל גנוטיפ על שקופית אחת. יישר ומקם את הרקמה כרצונך.

גע בעדינות בקצה אחד של כיסוי למדיום והורד אותו לאט בעזרת מלקחיים כדי למנוע יצירת בועות. השתמש במגבון מעבדה כדי לספוג עודף אמצעי הרכבה בקצוות. כעת ניתן לבחון את הרקמה באמצעות הדמיה קונפוקלית.

בקש מגורם ניטרלי להפוך את השקופיות לאנונימיות כדי שהניקוד יהיה לא מוטה. ויש שקופיות המוערכות באופן עצמאי על ידי שני חוקרים לפחות. לחשוף גנוטיפים רק לאחר השלמת הניקוד.

הערך את מידת הממאירות תחת מיקרוסקופ סטריאו פלורסנט המצויד בסט מסנני GFP. שימוש בסמן תווית מוחות שכבר נצפו כדי למנוע ספירה כפולה. תמונות קונפוקליות פלואורסצנטיות מראות מוחות שנותחו מזחלים הנושאים RAS V12 ממאיר שרבט גידולים משובטים מוטנטיים עם תווית GFP מוכתמים ב-DAPI.

הפאנלים מייצגים את ארבע הדרגות השונות של פולשניות הגידול. כימות בלתי מוטה גילה כי עיכוב של איתות JNK ו-RAS V12 שרבט שיבוט אחד דיכא את פולשניות הגידול. בדיסקים של אנטנות עין בקרה, מדווח TRE-DsRED הרגיש ל-JNK מסמן רק פס צר של תאים העוברים מהאנטנה לחלק העין.

לעומת זאת, פעילות TRE-DsRED השתפרה באופן ניכר בגידולים משובטים ממאירים חיוביים ל-GFP. ביום השמיני תאי הגידול גדלו על דיסקי אנטנות העין והתפשטו לחוט העצב הגחוני. תאי הגידול הפולשים הראו גם פעילות מוגברת של JNK בהשוואה לרקמה הסובבת.

בעוד שחסימת JNK הפחיתה בבירור את פעילות ה-TRE-DsRED בשיבוטי הגידול, הגדלת עוצמת הלייזר חשפה שיפור בתאי האפיתל הסמוכים לשיבוטים. בנוסף, מדווח המולקטין דלתא DsRED הראה כי בניגוד לכמה אשכולות המוציטים שנמצאו בחריצים של אפיתל העין של הבקרה, המוציטים שהצטברו באנטנות העין וברקמת המוח המורכבת מגידולים ממאירים. עם עיכוב JNK מספר תאי החיסון הקשורים ירד באופן דרמטי.

הפולשניות המוגברת של הגידול, פעילות JNK וחדירת ההמוציטים לוו בוויסות משמעותי של MMP1 mNRA כפי שנקבע על ידי QRTPCR באמצעות סך RNA שבודד מדיסקים של אנטנות עיניים פסיפס מנותחים. לאחר השליטה ניתן לנתח למעלה מ-60 זוגות דיסקים ומוחות בעיניים תוך 30 דקות. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לייצר מספר מספיק של זחלים של הגנוטיפים הרצויים.

היו מהירים אך מדויקים בזמן הניתוח כדי לשמור על דגימות המיועדות לבידוד RNA RNS נקיות. לאחר הליך הדיסקציה ניתן להשתמש בכתם מערבי כחלופה לצביעה חיסונית כדי להעריך שינויים בביטוי החלבון בין גנוטיפים שונים. יצירת פסיפסים גנטיים וניתוחם עם ההליכים המתוארים מאפשרת מחקר על מוטציות קטלניות אחרת ועל מנגנונים של תאגיד אונקוגן ולאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח רקמות פסיפס של דיסק אנטנות העין ומוחות מזחלי כוכב שלישי וכיצד לעבד אותם לצביעה חיסונית, הדמיה של פעילות טרנסגנית ונמל, מיצוי RNA וכימות הפולשניות.

יש לזכור כי PFA כמו גם פנול-כלורופורם ו-DAPI רעילים מאוד וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות מגן וביגוד בזמן העבודה עם חומרים אלה.