Name: בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למדו שיטה לבידוד לימפוציטים ממוריניים באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD43. הפרוטוקול מאפשר ניקוי מהיר עם מינימום מניפולציה ולחץ סביבתי על התאים לצורך מחקר אימונולוגי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי משרד החינוך, סינגפור (AcRF Tier1-RG40 / 13 ו Tier2-MOE2013-T2-2-038). כתב היד בעריכת איימי סאליבן מתקשורת Obrizus.

<ol><li>Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+important+facets+of+T-cell+repertoire+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The many important facets of T-cell repertoire diversity.</a> Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).</li>
<li>LeBien, T. W., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Brownlie, R., Zamoyska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+networks%3A+branched%2C+diversified+and+bound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).</li>
<li>Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-rel+regulates+ezh2+expression+in+activated+lymphocytes+and+malignant+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells.</a> J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+B+lymphocytes+undergo+homeostatic+proliferation+in+response+to+B+cell+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit.</a> J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Su, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+controls+B+cell+development+through+histone+h3+methylation+and+Igh+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement.</a> Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).</li>
<li>Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%CE%B4+controls+self-antigen-induced+B-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance.</a> Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).</li>
<li>Rush, J. S., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+activated+via+CD40+and+IL-4+undergo+a+division+burst+but+require+continued+stimulation+to+maintain+division%2C+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation.</a> Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).</li>
<li>Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים נוהל טיהור לימפוציטים מאיברים הלימפה. טיהור תא באמצעות מיון חרוז מגנטי היא שיטה מהירה ופשוטה מניב קיימא, תאי יעד מטוהרים. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול כדאיויות תא תשואת תא שמירה על כדאיות של תאים השושלת hematopoietic במבחנה הי...

לימפוציטים בוגרים קיימים בדרך כלל במצב מנוחה אם אין זיהום או דלקת קיימים באדם. לכן, חשוב לשמור על הסטטוס הנאיבי של לימפוציטים במהלך תהליך הבידוד לפני ביצוע בדיקות תפקודיות במבחנה או in vivo. המפתח להבטחת תוצאות עקביות וניתנות לשחזור הוא להגביל כל מניפולציה מיותרת של התאים. 
מיון תאים מגנטיים משתמש בנוגדנים ומיקרו-חרוזים כדי לתייג תאים כדי להעשיר את אוכלוסיית התאים המעניינת. בגישה זו, ישנן שתי אסטרטגיות טיהור: העשרה חיובית ודלדול שלילי. העשרה חיובית מעשירה את אוכלוסיית התאים המעניינים באמצעות נוגדן הנקשר לתאי המטרה. דלדול שלילי, לעומת זאת, מדלדל תאים שאינם מטרה, ומשאיר את אוכלוסיית התאים מעניינת. במעבדה שלנו, אנו מעדיפים דלדול שלילי על פני העשרה חיובית מכיוון שקשירת הנוגדנים לתאי המטרה עלולה לשנות את תכונות התא והתנהגותו. למעשה, סמנים מבוססים רבים על פני התא המתאימים לבידוד של אוכלוסיית תאים מסוימת הם גם קולטנים פונקציונליים. 
מיון תאים מגנטיים לא רק מניב אוכלוסיות טהורות ביותר של תאי מטרה ברי קיימא, הוא גם גוזל פחות זמן ומונע את הלחץ התאי הנגרם על ידי זרימה בלחץ גבוה המשמשת במיון תאים המופעל פלואורסצנטי (FACS). על ידי תיוג אוכלוסיות התאים הלא רצויות ודלדולן באמצעות עמודת הפרדה מגנטית, אנו מסוגלים לבצע בידוד תאים מהיר מבלי לפגוע בכדאיות של אוכלוסיית תאי היעד. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש באסטרטגיות דלדול שליליות לטיהור תאי B נאיביים או תאי T.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (ללא L-גלוטמין)</td><td>סרום</td><td></td> בקר עוברי של Gibco 31870025 <td></td></tr><tr><td>מושבת בחום&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD43 מיקרו-חרוזים מגנטיים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>ערבב היטב לפני השימוש</td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזי סטרפטווידין</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>ערבב היטב לפני השימוש</td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים נגד Annexin V</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>מערבבים היטב לפני השימוש</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96 באר U-bottom צלחת תרבית סטרילית</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96-well F-bottom צלחת תרבית סטרילית</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; רשת</td><td></td><td></td> מסננת תאים m <td>לעיקור באמצעות קרינת UV שימוש קודם</td></tr><tr><td>0.2 &mu; מ&nbsp; יחידות סינון חד פעמיות סטריליות</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>ניתנות להחלפה בכל מכשיר סינון סטרילי CellTrace</td></tr><tr><td>Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV בקיצור; חלופה ל-CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY בקיצור; חלופה ל-CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR בקיצור; חלופה ל-CFSE</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Dye eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 בקיצור; חלופה ל-CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, חלופה ל-CFSE</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>יכול להשתמש ממקורות אחרים</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>טריס-בסיס</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא אולדריץ'&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr> <tr><td>(5-(ו-6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>C-1157</td><td>מורכבות מחדש ב-DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (סידן יונופור)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק> </td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>נוגדנים וחלבון רקומביננטי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b ביוטין (שיבוט m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>CD11c ביוטין (שיבוט N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>קוקטייל דלדול תאי</td></tr><tr><td>T Gr-1 ביוטין (שיבוט RB6-8C5)</td> <td>Biolegend</td><td>108404</td><td>קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>Ter119 ביוטין (שיבוט Ter119)</td> <td>Biolegend</td><td>116204</td><td>קוקטייל דלדול תאי</td></tr><tr><td>T TCR-&gamma; &דלתא; ביוטין (שיבוט GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>CD19 ביוטין (שיבוט 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>B220 (שיבוט RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>CD49b ביוטין (שיבוט DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>CD4 ביוטין (שיבוט GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>100404 קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>CD8 ביוטין (שיבוט 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>קוקטייל דלדול תאי T</td></tr><tr><td>F(ab')2 עזים נגד עכברים IgM (מצופה צלחת)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD40 mAb (מצופה צלחת)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)</td></tr><tr><td>רקומביננטי IL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS מ-E. coli Serotype 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (שיבוט שיבוט OKT3) (מצופה צלחת)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (שיבוט שיבוט 37.51) (מצופה צלחת)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)</td></tr><tr><td>רקומביננטי IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מחלבון ביצת עוף, Ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ההפעלה של murine לימפוציטים

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

לתאי B ו-T, עם רפרטואר קולטני האנטיגן-קולטני המגוון ביותר שלהם, יש את היכולת להרכיב תגובות חיסוניות ספציפיות כמעט נגד כל פתוגן פולש1,2. מובן שיכולות מורכבות כאלה נשלטות על ידי מספר רב של מולקולות המעורבות בתהליכים תאיים שונים כדי להבטיח תגובות חיסוניות בזמן ובוויסות מרחבי3. כאן, אנו מתארים הליכים ניסיוניים המאפשרים בידוד מהיר של לימפוציטים עכבריים מטוהרים מאוד באמצעות טכנולוגיית מיון תאים מגנטיים. לאחר מכן ניתן לעבור את הלימפוציטים המטוהרים המתקבלים לבדיקות תפקודיות שונות במבחנה או in vivo, כגון קביעת יכולת האיתות של הלימפוציטים בעת גירוי על ידי אימונובלוטינג4 וחקירת יכולות שגשוג על ידי שילוב 3H-thymidine או תיוג carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)5-7. בנוסף להשוואת היכולות התפקודיות של בקרה ולימפוציטים מהונדסים גנטית, אנו יכולים גם לקבוע את יכולת הגירוי של תאי T של תאים מציגי אנטיגן (APCs) in vivo, כפי שמוצג בתוצאות המייצגות שלנו באמצעות תאי OT-I T מושתלים המסומנים ב-CFSE.

טיהור תא מגנטית של לימפוציטים מאפשרת למשתמשים לטהר אוכלוסיית תא המטרה בסכום זמן קצר יחסית. שימוש בפרוטוקול הדלדול שלנו, הצלחנו להגדיל את אחוז תאי CD8 T (OT-I-הפעלת רקומבינציה גן-1 (RAG-1) עכברי -deficient) מ 72.8% (טיהור לפני כן) 94.2% (לאחר טיהור; 4,5 איור 1A). לימפוציטים המטוהרים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מבחנים פונקציונליים במורד לקבוע תמרת התפשטות אות הלימפוציטים 4,5. לדוגמה, אנו יכולים ללמוד את קיבולת...

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את היכולות התפקודיות של לימפוציטים עכבריים מטוהרים באמצעות מבחני תפקוד שונים in vitro ו-in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה המולקולרית, כגון חקירת התפקוד של חלבון מסוים בלימפוציטים עם חסר גנטי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לטהר לימפוציטים במהירות עם מינימום מניפולציות ועקה סביבתית. כדי לטהר תאי B, השהו מחדש עד 1×10⁸ תאי טחול שלמים שעברו ליזיס של תאי דם אדומים ב-300 µL של תמיסת מלח מאוזנת (BSS) המועשרת ב-FBS. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של מיקרו-חרוזי מגנט anti-CD43.כדי להסיר את התאים המתים, יש להוסיף 30 µL של חרוזי מגנט Annexin five למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. יש לנער בעדינות (flick) את תרחיף התאים במרווחים של 15 דקות כדי להבטיח סימון אחיד של התאים. בתום האינקובציה, יש לשטוף את התאים המסומנים עם 14 mL של BSS מועשר ב-FBS.לאחר הצנטריפוגציה, הסרו את הנוזל העליון, נקשו על השפופרת והשעיו מחדש את המשקע ב-1 עד 3 מיליליטר של BSS בטמפרטורת החדר, מועשר ב-FBS. במהלך הצנטריפוגציה, טענו עמודה להפרדה על גבי מעמד מגנטי וחברו מחט סטרילי במידה של 21 gauge לקצה העמודה כדי להפחית את קצב הזרימה. שווו את העמודה באמצעות 2 מיליליטר של BSS בטמפרטורת החדר.לאחר תלייה מחדש של המשקע ב-1 עד 3 מיליליטר של BSS בטמפרטורת החדר, מקמו את מבחנת האיסוף מתחת למחט, ולאחר מכן טענו את התאים המסומנים ב-B לעמודה שעברה שיווי משקל. אספו את הנוזל שעבר (flow through) למבחנה קונית של 15 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את העמודה ב-1 מיליליטר של BSS טרי בתוספת FBS.לאחר איחוד השטיפה עם התאים המטרה שנאספו, טען מחדש את העמודה עם האלואט המכיל את תאי המטרה, ואסוף את השבירה (flow through) לאותה מבחנה של 15 milliter. שטוף את העמודה שלוש פעמים עם one milliliter של BSS מועשר ב-FBS, תוך המשך איחוד השטיפות עם תרחיף תאי המטרה. לאחר השטיפה השלישית, הסר את העמודה מהמגנט וטען אותה עם five milliliters של BSS מועשר ב-FBS.השתמש בבוכנה של העמודה כדי לשטוף את התאים שאינם תאי מטרה, המסומנים מגנטית, לתוך מבחנה חדשה של 15 milliliter. לאחר מכן, בדוק את טוהר התאים שהופרדו באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי להשתמש שוב בעמודת הפרדה, לאחר שטיפת התאים המסומנים בחרוזים מגנטיים, שטוף את העמודה שלוש פעמים מלמעלה עם 5 milliliter של PBS בכל שטיפה, ושלוש פעמים עם 5 milliliter של מים מזוקקים בכל שטיפה.בשלב הבא, שטפו את העמודה עם 5 mL של אתנול 70% באותו אופן, והשתמשו בברז אוויר כדי לייבש את העמודה לחלוטין לפני האחסון. כדי להשתמש בעמודה שוב בניסוי טהרה חדש, שטפו שוב את העמודה מלמטה למעלה עם 5 mL של אתנול 70%, ולאחר מכן עם שתי שטיפות של 5 mL PBS. לאחר מכן, טענו לחלק העליון של העמודה 5 mL של PBS לשטיפה סופית אחת.יש להשתוות את העמודה באמצעות 2 mL של BSS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ניתן להעמיס על העמודה את אוכלוסיית התאים הניסיונית. כדי לסמן את התאים שטוהרו באמצעות B ב-CFSE, יש לשטוף את התאים פעמיים עם תמיסת סימון שהוכנה טרי, בתוך מבחנה קונית של 15 mL.יש להשעות מחדש את המשקע השני בריכוז של 2×10⁷ תאים למילליליטר בתמיסת סימון טרייה בטמפרטורה של 37 °C. בכל פעם, יש לצנטריפוג את הדגימות, להסיר את העלייה (supernatant) ולנער את המבחנות. לאחר מכן, יש לסמן את התאים ביחס של חלק אחד של ת suspension תאים לחלק אחד של תמיסת CFSE בריכוז 10 µM שהוכנה טרי, בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C.יש להפוך את המבחנה בכל שתי דקות כדי להבטיח פיזור אחיד של הצבע. יש לנקוט משנה זהירות כדי לוודא שמשקע התאים תלוי באופן מלא בתמיסת הסימון. התגבשות של תאים עלולה להשפיע על הומוגניות הסימון ב-CFSE.בסיום הדגירה, הוסיפו מצע RPMI כדי לעצור את תגובת ה-CFSE ושטפו את התאים פעמיים בכמה נפחים של מצע RPMI מלא קר מאוד (בטמפרטורת קרח). אם התאים סומנו בהצלחה, המשקע יהיה בצבע צהוב. לאחר מכן, שטפו פעמיים ב-PBS פלטת 96 בארות בעלת תחתית שטוחה המצופה במעורר המתאים.עבור תאי B מסומנים ב-CFSE, השהה מחדש בריכוז של 3×10⁶ תאי B למיליליטר של מצע RPMI מלא, וזריע 100 µL של תאי B לכל באר בלוח המצופה, בשלוש חזרות, למשך 72 שעות. באמצעות שיטה זו של דה-פלציה (depletion), ניתן להעלות את רמת הטוהר של תאי OT1-CD8 T שבודדו באמצעות חרוצים מ-72.8% ל-94.2%. לאחר מכן ניתן לסמן את התאים ב-CFSE כפי שהודגם זה עתה, ולהעבירם באופן אדופטיבי לבעלי חיים מקבלים לצורך ניתוח של השכפול שלהם in-vivo.בנוסף, ניתן להשתמש בסימון באמצעות נוגדן anti-CD45.1 כדי לאשש עוד יותר את זהות התאים המבטאים CFSE כתאי OT1-CD8 T תורמים חיוביים ל-CD-45.1 שהועברו באופן אדופטיבי לאיברי הלימפה של עכברי המקלטים. לחלופין, ניתן לעורר את תאי ה-T המזוקקים in vitro ולהעריך את השכפול שלהם באמצעותt הכנסת תימידין טריטיומי (tritiated Thymidine). בשיטה זו מושגת גם עלייה משמעותית בטוהר תאי ה-B בספלנום.הדבר מאפשר הזדמנויות דומות לניתוח תפקודי בשלבים הבאים של תאי B המנוקים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה תוך שעתיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד על שמירת תרחיף ה-CI על קרח בכל עת, למעט במהלך הניקוי וסימון ה-CFSE.ניתן להשתמש בלימפוקיטים מטוהרים גם בבדיקות תפקודיות אחרות, כגון אימונו-בלוטינג (immunoblotting), כדי לבחון את יכולת האיתות של לימפוקיטים שעברו שינוי גנטי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה יותר לגבי אופן טיהור תאי B ותאי T וכיצד להשתמש בתאים אלו למגוון בדיקות תפקודיות in vitro ו-in vivo.

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

אנו מציגים פרוטוקול לייצר אנטיגן ספציפי עכבר מתאי T באמצעות התמרה...

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

דרך יעילה לבודד את הלימפוציטים מדרכי מין עכבר מתוארת. שיטה זו מנצלת עיכול אנזים והפרדת השיפוע Percoll לאפשר בידוד יעיל. טכניקה זו היא גם להתאמה לשימוש במינים...

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

בידוד של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה הוא הליך רב-שלבי הכולל עיכול אנזימטי ופירוק מכני להשגת תאי רשתית פיברובלסטיים, תאי לימפה ותאי אנדותל בדם. בהליך המתואר, עיכול קצר משולב עם פירוק מכני אוטומטי כדי למזער את פירוק סמני פני השטח של תאי סטרומה של בלוטות לימפה קיימות.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

למדו שיטה לבידוד לימפוציטים ממוריניים באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD43. הפרוטוקול מאפשר ניקוי מהיר עם מינימום מניפולציה ולחץ סביבתי על התאים לצורך מחקר אימונולוגי מתקדם.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

גלה סרטונים נוספים