אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה
18 באוקטובר 2016
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט פנוטיפי ניתוח כמותי של מקרופאגים תושב מכליות עכברוש ידי cytometry זרימה. התאים המוכתמים וכתוצאה מכך ניתן להשתמש גם ליישומים אחרים, כוללים מיון תא, ניתוח ביטוי גנים או מחקרים פונקציונליים, ובכך מגדילים את המידע שהתקבל במודל הניסיון.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת ולאפיין מקרופאגים תושבים מכליות חולדה על ידי זרימה ציטומטרית. שיטה זו יכולה לענות על שאלת מפתח בנזילות כגון מה התרומה של כל מקרפג מסוג בפגיעה בכליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת צנתור כליות של סמני חלבון שונים. לפיכך, מגבילות את השלמות התאית של הדגמת ההליך יהיו אלנה אוליבארס, סטודנטית A.P.A.S.D.מאוניברסיטת קומפלוטנסה ומלניה גררו, סטודנטית A.P.A.S.D. מ- לזלוף וחילוץ כליות, יתחילו בצביטה של קפל עור קטן כדי לאשר שהחולדה הגיעה לרמת ההרגעה המתאימה. ולכסות את העיניים במשחה וטרינרית. הניחו את החיה על שולחן כירורגי במצב שכיבה. ולהשרות את הבטן באתנול 70%. לאחר מכן, בצע חתך מרכזי דרך עור הבטן והצפק מהערווה לכלוב הצלעות כדי לחשוף את חללי הצדר והבטן. השתמש במערכת הזלוף כדי להזריק תמיסת מלח 0.9% לאבי העורקים הבטני כדי לשטוף את הכליות. חיתוך אבי העורקים בבטן כדי לסייע בשחרור הדם. לאחר שכל הדם הוסר מהכליות, חתכו את הילום הכליה. לאחר מכן לחץ על קצה כל כליה כדי להסיר בזהירות את האיברים. והעבירו את הכליות שחולצו לטריות H.B.S.S.To ליצור תרחיף של תאי כליה בודדים, השתמשו במספריים כדי לחתוך מחצית מכליה אחת לשברים קטנים. העבירו את חתיכות הרקמה לצינור של 1.5 מ"ל והוסיפו 1 מ"ל קולגנאז טרי שהוכן לצינור למשך 30 דקות דגירה ב -37
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לאנליזה פנוטיפית וכמותית של מקרופגים תושבים מכליות של חולדות באמצעות ציטומטריה של זרימה. התאים הצבועים שמתקבלים יכולים לשמש למגוון יישומים, ובכך להעשיר את המידע המופק מהמודל הניסויי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- מאקרופגים ממלאים תפקיד מכריע בבריאות הכליות ובמחלותיהן.
- ציטומטריה של זרימה מאפשרת ניתוח מפורט של אוכלוסיות תאים.
- הבנת התנהגות המאקרופגים יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות.
- מדגמי חולדות משמשים בדרך כלל לחקר תפקודי הכליות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לבידוד ולניתוח של מקרופאגים מהכליות.
- סיוע במחקרים עתידיים על תפקודי מקרופאגים בהקשרים כלייתיים.
- אספקת משאב עבור חוקרים בתחומים קשורים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציטומטריית זרימה לאנליזה של תאים.
- טכניקות צביעה לזיהוי מקרופאגים.
- פרוטוקולים למיון תאים ולאנליזה של ביטוי גנים.
- מחקרים פונקציונליים להערכת פעילות מקרופאגים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של מקרופאגים תושבים מכליות של חולדה.
- אפיון מפורט של פנוטיפים של מקרופאגים.
- יישומים פוטנציאליים במחקרי ביטוי גנים ומחקרי תפקוד.
- הבנה משופרת של תפקידי המקרופאגים בבריאות הכליות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לניתוח מקרופאגים.
- התוצאות עשויות להוות בסיס למחקרים עתידיים על מחלות כליות.
- ניתן להרחיב את המחקר ליישומים אחרים מעבר לציטומטריה זורמת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אפיון פנוטיפי מדויק של תתי-סוגי מקרופאגים במודלים של מחלות כליה הוא קריטי להפחתת סיכונים באישוש מטרות בפתולוגיות של כליות המונעות על ידי דלקת. פרוטוקול פלוו-ציטומטריה זה מאפשר הבחנה כמותית בין פנוטיפים של מקרופאגים פרו-דלקתיים (M1) למקרופאגים רגולטוריים-חיסוניים (M2) בכליות של חולדה, ובכך מספק תובנה מכניסטית לגבי פיברוזיס ומודולציה חיסונית. באמצעות אספקת שיטה מהימנה להערכת תרומת המקרופאגים לפגיעה כלייתית, גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי בבחירת מטרות ובבדיקת מסלולים שלבים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות יחסי מקרופאגים M1/M2 במודלים של פגיעה בכליות.
- ערך תפעולי: משתמש בסינון (gating) כפול של CD45/CD68 יחד עם צביעת שטח של CD86/CD163 להגדרת פנוטיפים של מקרופאגים בסגוליות גבוהה.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות על ידי קישור מצבי קיטוב של מקרופאגים למסלולי פיברוזיס וויסות חיסונית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים של ציטומטריית זרימה עבור שכיחות מקפגים וביטוי סמנים.
- שחזוריות: מדגים תמותה תאית נמוכה ושמירה על שלמות התאים, המאפשרים קריאות פנוטיפיות עקביות בין ניסויים.
- תועלת לשלבים הבאים: מקפגים מבודדים נותרים חיים לצורך מיון תאים, ניתוח mRNA וחלבונים, ובכך תומכים במחקרי המשך מולטי-אומיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי באופן ישיר למודלים של מחלות כליות דלקתיות שבהם פנוטיפים של מקרופאגים מניעים את הפתוגנזה.
- המשכיות תרגומית: נתונים פנוטיפיים ממקרופאגים ממוינים יכולים לסייע בגילוי סממנים ביולוגיים ובתיקוף תפקודי במחקרים פרה-קליניים.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר הערכה אובייקטיבית של השפעות תרכובות אימונומודולטוריות על קיטוב מקרופאגים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ומספקת מדדים אימונולוגיים המכוונים את אופטימיזציית המולקולות המובילות ומחקרי מנגנון הפעולה במודלים של מחלות כליה.
- ביולוגיה גילויית: מאפשרת בדיקת השערות על נתיבים המונעים על ידי מקרופאגים בפגיעה כלייתית באמצעות כימות פנוטיפי.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור על מקרופאגים, המתאימים לתיקוף בדיקות ומסעות סריקה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות פלוו-ציטומטריה רב-פרמטריות (CD45+/CD68+/CD86+ עבור M1; CD45+/CD68+/CD163+ עבור M2) המאפשרות ניתוח השוואתי של קבוצות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פנוטיפ של מקרופאגים לבדיקות תפקודיות במורד הזרם ואפיון ביטוי גנים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה סטנדרטית של אימונופנוטיפ, ישימה על פני מודלים מרובים של מחלות כליה ותחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בפגיעה בכליות המתווכת על ידי מקרופאגים, על ידי מתן אפשרות להבחנה פנוטיפית מדויקת.
- ערך תפעולי: מספק בידוד וצביעה סטנדרטיים של מקרופאגים עם שונות נמוכה, התואמים למעבדות מרכזיות של ציטומטריית זרימה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור בין מודולציה של מטרה לשינויים מדידים בקיטוב של המקרופאגים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לאימונומודולציה, בהתבסס על מודולציה של פנוטיפ מקרופאגים במודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפיצוי (compensation) של ציטומטריה זורמת, אסטרטגיית gating ותיקוף של סממני מקרופאגים.
- תלוי בגישה לציוד לעיכול בקולגנאזה ולתשתית סטרילית לעיבוד תאים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פאנלים של נוגדנים ובקרות פלואורסצנציה בין אתרים שונים לצורך כימות M1/M2 הדיר.
- התאמה לרקמות אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של אנזימי הדיסוציאציה ושל פאנלי הסממנים.
- מוגבל על ידי זמינותם של סממני מקרופאגים ספציפיים לחולדה (CD86, CD163) בהשוואה למאגרי הסממנים הנרחבים יותר בעכברים.
