טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית הדפסה ביולוגית באמצעות מערכת הפקדה רובוטית אוטומטית המשלבת רמזי הנחיה טופוגרפיים חרוטים עם תצהיר מדויק של תא הנושא דיו הידרוג'ל. התאים המודפסים מועברים ישירות לתכונות החרוטות ומסוגלים לחוש ולהתמצא איתם.

המטרה הכוללת של טכניקת חלוקה רובוטית אוטומטית זו היא ליצור משטח להנחיית תאים טופוגרפיים ולאחר מכן להעביר תאים לתכונות אלה בהתאם לדפוס מתוכנת, המאפשר שליטה על התנהגות התאים והפצתם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההנדסה הביו-רפואית, כגון כיצד טופולוגיות פני השטח יכולות להשפיע על התנהגות התאים, הן במונוקולטורה והן בתרבית משותפת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שגוזל פחות זמן לתכנת ולהדפיס דפוס הנחיית תאים בהשוואה לשיטות מבוססות יותר.

זה כולל גם שלב אספקת תאים לחלוקה מבוקרת. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבנו שתבניות דו-ממדיות של תאים המופקדים בהידרוג'לים יכולות להפיק תועלת מהנחיית פני השטח. ככזה, פיתחנו את הטכניקה הזו כדי להדפיס הידרוג'לים באופן שתואם את תכונות פני השטח.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת חלוקה רובוטית בסיוע לחץ אחורי כמדפסת ביולוגית מבוססת תחריט משטח ושחול. להכנת משטח פוליסטירן לתחריט ולהדפסה, בחרו יריעת פוליסטירן בעובי מילימטר אחד. סדינים עבים יותר ישתחוו יותר.

לאחר מכן, טפל בסדין בפלזמת חמצן. הגדר את ווסת גז החמצן לשני מוטות. לאחר מכן, הפעל את מכונת הפלזמה והפעל את משאבת הוואקום.

המשך לתכנת את המכונה ל -150 וואט ו -30 סנטימטרים מעוקבים סטנדרטיים לדקה של זרימת גז חמצן, וחשוף את הסדין לתנאים אלה למשך 10 דקות. לאחר מכן, פנה את החדר ואטום את הדלת והתחל את המחזור. לאחר מכן, טבלו את הסדין המטופל בסרום בקר עוברי טהור ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים בערבוב.

לאחר הטיפול בסרום יש לשטוף את הסדין שלוש פעמים עם 1X PBS ולעקר את הסדין. לאחר הכביסה הסופית, השאירו את הסדין בתנור של 37 מעלות צלזיוס לייבוש למשך הלילה למשך כ-12 שעות. ראשית הכינו חרט הדפסה לתחריט.

בזהירות רבה, הכנס מחט טקסטיל בקוטר 1.5 מילימטר לתוך הזרבובית של מזרק מחלק עד שהיא נתקעת ומאובטחת. כאשר מנסים לראשונה ליצור סידור מודפס ביולוגי, שרטט את התבנית הרצויה על נייר גרף עם צירים ממוספרים כדי ליצור את קואורדינטות x, y. לאחר מכן הזן את הקואורדינטות של התבנית בגיליון אלקטרוני.

לאחר מכן, בתוכנת ההדפסה, בחר תוכנית, הוסף תוכנית, ולאחר מכן ערוך, הוסף נקודה כדי להקים את התוכנית. לאחר מכן, העתק את ערכי הקואורדינטות x ו-y מהגיליון האלקטרוני לתוכנת חלוקת ההדפסה. לפני כל ריצה, כייל את גובה ה-z של הרובוט כדי להגדיר את מיקום מגע החרט.

ראשית, בחר באפשרות רובוט. לאחר מכן, לחץ על שינוי מצב והפעל את האפשרות מצב הוראה. זה מאפשר את פונקציית ה-JOG של הרובוט.

כדי להצמיד את הרובוט, תחילה שים את הרובוט במיקום ברירת המחדל שלו על ידי בחירה ברובוט, Meca Initialize. ואז, רובוט, ג'וג. לאחר מכן, בחריצי x ו-y, הזן את המרחק במילימטרים הדרושים כדי למקם את החרט בדיוק על מקור התבנית.

לאחר מכן, גם במילימטרים, הזן ערך מספרי בחריץ z כדי למקם את החרט או הזרבובית במגע עם המשטח מבלי לכופף או להכניס את פני השטח. זה מוגדר כערך ההתחלתי של z. ניתן לשנות את עומק כל חריץ באמצעות גובה z.

לדוגמה, החריצים החתוכים יכולים להיות בעומק של 40, 80 או 170 מיקרון. נדרש ריכוז והתבוננות מקרוב כדי למצוא נקודת מגע כך שאין כיפוף של העט או שקע מורגש על פני השטח. כדי להבטיח הצלחה, אנו ממליצים להכין מספר גיליונות ולהפעיל את התוכנית בגובה z שונה כדי למצוא את עמדת ההתחלה האידיאלית.

השלב הבא הוא להגדיר את הוראות ההדפסה עבור כל אחת מנקודות הקואורדינטות. השתמש ב-Start of Line Dispense כדי להגדיר את הנקודה הראשונה ואת התחלת ההדפסה. השתמש במעבר קו כדי לייעד את נקודות הביניים, ולבסוף, השתמש בחלוקת סוף קו כדי לאותת לרובוט לסיים את ריצת ההדפסה.

כדי להעביר את התוכנית לרובוט, בחר רובוט, שלח נתוני C&T. לאחר מכן, התחל את הריצה על ידי בחירת רובוט, שינוי מצב, החלף מצב הפעלה והחלפת ההגדרה להפעלה. לבסוף, התחל את ההדפסה.

כדי לייצר את הדיו הביולוגי, יש להמיס 2% ג'לטין ב-Alpha MEM בתוספת 10% FBS ו-2% אנטי-פטרייה. מניחים את המדיום על 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר לג'לטין להתמוסס במדיום. תרבית התאים לדיו הביולוגי למפגש של 70% בכלים של 10 סנטימטרים.

ניתן להשתמש בכל תאים המגיבים לתכונות הנחיית פני השטח ועליהם לבטא תווית פלואורסצנטית כדי שניתן יהיה לראותם במהלך תהליך ההטבעה. שחרר את התאים המחוברים לתוך התרחיף על ידי הסרת המדיום, שטיפת התאים ב-PBS וציפוי התאים בתמיסת 1X Trypsin-EDTA למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר נטרול הטריפסין עם מדיום, אספו את התאים בתרחיף וגלו אותם ב-1,000 גרם למשך חמש דקות.

תאר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-0.5 מיליליטר של תווך. לאחר מדידת צפיפות התאים, מערבבים את התרחיף בתמיסת הדיו הביולוגית המקוררת ליצירת תמיסה עם חמישה מיליון תאים למילימטר. לאחר מכן, שפכו את הדיו הביולוגי הנושא את התא למזרק הדפסה מוכן שנחסם על ידי מכסה פיתוי.

מצננים את המזרק הטעון לארבע מעלות צלזיוס על מנת להשיג צמיגות הניתנת להדפסה. לאחר מכן, הוצא את המזרק הטעון והמצונן החוצה, הסר את מכסה המזרק והצמד את פיית ההדפסה. לאחר מכן, חבר את המזרק הטעון למערכת החלוקה וחבר אותו לקווי לחץ האוויר.

על מנת להדפיס את הדיו הביולוגי על התבנית שתוכננה מראש, הקצוות והקווים צריכים להיות ברורים. הדפסה מדויקת מתקבלת למעשה על ידי אופטימיזציה של הלחץ האחורי של המתקן ומד המחט של פיית ההדפסה. הגדר את הלחץ האחורי של המתקן ל-0.05 מגה-פסקל עבור מזרק של 10 מיליליטר עם מחט מחודדת בגודל 34.

לאחר מכן, בתוכנה, הגדר את מהירות הכתיבה לחמישה מילימטרים לשנייה על משטח סרט פוליסטירן. כעת, בעקבות התבנית המתוכנתת, הפקידו את הדיו הביולוגי הסלולרי על החריצים החרוטים מראש. לאחר הפקדת התאים, הניחו לסדין לדגור למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

מאוחר יותר, כסו את פיגומי התאים המודפסים במצע הגידול המתאים ודגרו על התאים למשך 24 שעות כך שהתאים יתחברו לפני ניסויים נוספים. תאי גזע שנזרעו על ידי הדפסה ביולוגית בתוך הדיו הביולוגי שקעו בסופו של דבר אל פני השטח וחשו והתארכו לאורך כיוון הקווים החרוטים בדיסקרטיות. תאים שנזרעו במדיום תרבית ללא הדפסה ביולוגית מיושרים גם לכיוון התכונות.

עם זאת, הם גם כיסו את כל פני השטח, וכך, הדיו הביולוגי הגביל את התאים לעקבות המודפסים. כאשר נזרעו על יריעות ללא התכונות החרוטות, התאים לא הראו כיוון או יישור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחרוט במדויק חריצים על יריעת הפוליסטירן ולאחר מכן במדויק תאי ביו-פרינט לתוך החריצים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים-שלוש. זה מאוד שימושי לחוקרים בתחום הביו-הנדסה לחשוף אינטראקציות פני תא במודלים שבהם נדרשת אניזוטרופיה ומיקום תאים. אל תשכח שהדיו הביולוגי מכיל תאים חיים וחשוב מאוד להשתמש בטכניקה סטרילית בעת הדפסת הגיליונות.