באמצעות אלקטרופורזה נימים לכמת חומצות אורגניות מרקמות צמח: מקרה מבחן בחינה
12 בנובמבר 2016
מאמר זה מציג שיטה איתור וכימות של חומצות אורגניות מחומר הצמח באמצעות אלקטרופורזה נימי אזורי חינם. דוגמא של יישום הפוטנציאל של שיטה זו, הקובע את ההשפעות של תסיסה משנית על רמות חומצה אורגניות זרעי קפה, מסופקת.
המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את רמות החומצות האורגניות הנמצאות ברקמות צמחים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות בביוכימיה ובפיזיולוגיה של צמחים, כגון השפעת גירויים סביבתיים על צמיחת שורשים, התפתחות גידולים ואיכות מזון או משקאות. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם הכנת דגימה מינימלית, תפוקה גבוהה, והעובדה שאלקטרופורזה נימית היא חסכונית יותר מספקטרומטריית מסות.
למרות ששיטה זו משמשת להבהרת תגובות פיזיולוגיות של צמחים, ניתן ליישמה גם במדעי המזון ובבקרת איכות מזון, שבהם לחומצות אורגניות יש השפעה מכרעת על הטעם, הבטיחות והיציבות. ראשית, יש להכין דגימות לצורך מיצוי חומצות קרבוקסיליות קצרות, או SCCA. הכינו גרם אחד של זרעי קפה בכל פעם כדי להבטיח שתישאר כמות מספיקה של דגימה לאחר העיבוד.
כדי להשיג גודל חלקיקים אחיד ליעילות מקסימלית של מיצוי SCCA, קיררו תחילה מכתש ועלי כרסם באמצעות חנקן נוזלי. הוסיפו את הדגימה לנפח קטן של חנקן נוזלי בתוך המכתש. בעזרת מצקת, הוסיפו למכתש מספיק חנקן נוזלי כדי להטביע את הדגימה לחלוטין.
הוסיפו דגימות שקשה לגרוס, כגון גרעיני קפה גולמיים, לחנקן הנוזלי. המתינו שהן יקפאו במשך 10 עד 30 שניות לפני הגריסה. פרקו את הרקמה למקטעים קטנים יותר באמצעות תנועת מעיכה אנכית.
לאחר מכן, השלימו את טחינת הרקמה באמצעות תנועת טחינה סיבובית. חזרו על שלבי ההקפאה והטחינה פעמיים נוספות, כך שהדגימות ייטחנו שלוש פעמים בסך הכל. בדרך כלל, שלושה סבבי טחינה רצופים ירדיפו את הדגימות לאבקה בעלת מרקם דמוי קמח.
העבירו את האבקה לבקבוקוני זכוכית או לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 ml. התחילו בעיבוד המשכי מיד לאחר הטחינה או אחסנו את הדגימות ב-80 degrees Celsius עד שהדגימות יהיו מוכנות להפקה. הכינו סטנדרטים אותנטיים עבור ה-SCCAs הרלוונטיים כדי ליצור תמיסות סטנדרט חיצוניות ופנימיות לשימוש בקביעת ריכוזי SCCA.
עבור דגימות קפה, כללו חומצה ציטרית, חומצה מלאית, חומצה אצטית וחומצה לקטית כחומצות העניין, וחומצה אדיפית כתקן פנימי. הכינו תמיסת מלאי בריכוז 10 mg/mL על ידי הוספת 100 mg של תקן לבקבוק מדידה בנפח 10 mL. מלאו את בקבוק המדידה עד לקו ה-10 mL במים אולטרה-טהורים כדי להמיס את החומצה.
העבר כל תמיססת מלאי לשפורורת זכוכית נקייה בנפח 15 milliliters, בעלת פקק מצופה polytetrafluoroethylene, ואטום בעזרת סרט פראפין פלסטי. ניתן לשמור תמיססות מלאי בשפורורות אטומות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius למשך שבוע אחד. הכן 50 milliliters של תמיססת המיצוי SCCA על ידי דילול תמיססת המלאי של התקן הפנימי לריכוז של 0.05 milligrams per milliliter במים אולטרה-טהורים.
בצע זאת על ידי הוספת 250 µL של תמיסת המלאי של התקן הפנימי ל-49.75 mL של מים. לאחר מכן, הכן דגימות לעקומת כיול עבור ה-SCCAs הרלוונטיים. השתמש במינימום של חמישה נקודות עם ריכוזים בטווח התגובה הליניארי, המכסים את ריכוזי ה-SCCA הצפויים בדגימות.
דללו כל SCCA לריכוז שנקבע במבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות באמצעות מים אולטרה-טהורים לנפח של 1 ml. ודאו שכל נקודת ריכוז מכילה את כל ארבעת תקני החומצה ואת התקן הפנימי בריכוז הנכון. הוציאו את הדגימות המיועדות להפקה מהאחסון והניחו אותן על קרח.
שקלו 100 milligrams של דגימה עבור מיצוי ה-SCCA. מדדו כמות דגימה הקרובה ככל האפשר למסה המטרה, כדי להפחית שונות. לאחר שקילת כל דגימה, העבירו את הרקמה לשפרוret של מיקרו-צנטריפוגה נקי בנפח 1.5 milliliter.
עקבו אחר המסה של כל דגימה שנמדדה, שכן הכמויות של SCCAs שיגולו ינורמלו באמצעות מסת הדגימה. לאחר שקילת כל הדגימות, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסות מיצוי לכל אחת מהבחוליות של הדגימות. שמרו על יחס קבוע בין תמיסת המיצוי למסת הרקמה בכל אחת מהמיצויים.
ערבבו היטב באמצעות וורטקס למשך 10 שניות. המתינו שעה אחת כאשר הדגימות נמצאות בטמפרטורת החדר. במהלך שעה זו, ערבבו כל מבחנה מדי 15 דקות באמצעות וורטקס למשך 10 שניות.
לאחר שעה של מיצוי, ערבבו את הדגימות פעם אחרונה והעבירו את מבחנות הדגימה למיקרו-צנטריפוגה. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C, ב-10,000 ×g למשך 10 דקות, כדי להשקיע את החומר המוצק. לצורך סינון הדגימות, הכינו מסנני דיסק המורכבים על מזרק, תוך וידוא שכל מסנן מחובר כראוי למזרק.
הכינו מזרק אחד המצויד במסנן דיסקה עבור כל דגימה שתיסמר, כולל דגימות עקומת הסטנדרט. סננו את העל-נוזלים (supernatants) ישירות לתוך מבחנה נקייה למיקרו-צנטריפוגה. לאחר הסינון, סגרו את המבחנה המכילה את התסנין והשליכו את מערכת הסינון של המזרק.
העבירו מיליליטר אחד של דגימה לכל מבחנה לאלקטרופורזה נימית (CE), תוך הקפדה להימנע מהתזת הדגימה אל צוואר המבחנה. לאחר העברת הדגימה, הניחו פקק CE על כל מבחנה. הגדירו את הרצת הגילוי של ה-SCCA כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
העבירו את המבחנות המכילות את נקודות עקומת הסטנדרט ואת המבחנות המכילות את הדגימות לבדיקה למגש הדגימות של הכניסה, כפי שמתואר בהוראות היצרן. רשמו את מיקומה של כל מבחנה לצורך תכנות הדגמי-האוטומטי (auto-sampler). לאחר ביצוע הה conditioning כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, התחילו את הפרדת הדגימות על ידי פתיחת תפריט הבקרה (Control) בתוכנה ובחירה ב-Run Sequence.
נטרו את מערך הפוטודיודות, או את מגשי ה-PDA, כדי להבטיח הפרדה נאותה. בחנו את העקבה הראשונה וודאו כי קו הבסיס שלה שטוח, וכי שיאי החומצה האינדיבידואליים נפתרים בצורה נקייה. לצורך אינטגרציה של שיאי הדגימה, פתחו את הקובץ הראשון והגדירו את שלבי האינטגרציה האוטומטית כך ששלוש הדקות הראשונות של ההרצה יוחרגו.
באותו תפריט, הגדירו את קריטריוני בחירת הפסגות לרוחב פסגה מינימלי של 50 units, ושטח פסגה של 100 units, כדי לספק רמה בינונית-גבוהה של סלקטיביות, המפרידה בין פסגות חומצה לרעש הרקע בעקבה. בצעו ניתוח נתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצג כאן השוואה של עקבות PDA המדגישה דגימה בעומס יתר.
ככל שריכוז האנליט עולה, הגיאומטריה של שיאים בודדים עשויה להתחיל להפוך לאסימטרית. בריכוז של 0.05 milligrams per milliliter, חומצה אצטית מציגה שיא סימטרי דו-צדדי מוגדר היטב. כאשר ריכוז חומצה האצטית עולה ל-0.07 או 0.10 milligrams per milliliter, השיא הופך לאסימטרי, ונוצר זנב לשיא.
זנב זה של הפיק מהווה אינדיקציה טובה לכך שהמדגם עמוס מדי. מוצגים כאן עקומות PDA לדוגמה המראות חומצות אורגניות במדגמי קפה ירוק. מדגמי הקפה הירוק דוללו ביחס של 1:10 לפני ההעמסה למבחנות CE.
החומצות המעניינות כוללות חומצה אצטית, חומצה ציטרית, חומצה לקטית, חומצה מלית, והסטנדרט הפנימי, חומצה אדיפית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לטחון את הדגימות לעקביות אחידה, ולפפיט את הדגימות בזהירות, כדי למקסם את השחזוריות ולמזער שגיאות ניסיוניות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת חומצות אורגניות מדגימות צמחים באמצעות אלקטרופורזה נימית, או CE. אתם תהיו מסוגלים לטחון דגימות צמחים, למצות חומצות אורגניות, ולהכין תמציות צמחים לניתוח CE המשכי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לזיהוי וכימות של חומצות אורגניות בחומרי צמחים באמצעות אלקטרופורזה נימיות באזור חופשי (free zonal capillary electrophoresis). השיטה מודגמת באמצעות יישומה לקביעת ההשפעות של תסיסה שניונית על רמות החומצות האורגניות בגרעיני קפה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביוכימיה של צמחים
- מדע המזון
- כימיה אנליטית
רקע
- חומצות אורגניות ממלאות תפקיד קריטי בפיזיולוגיה של צמחים ובאיכות מזון.
- אלקטרופורזה נימיית מהווה חלופה חסכונית לספקטרומטריית מסות.
- הבנת רמות החומצות האורגניות יכולה לסייע בשיפור פרקטיקות חקלאיות וייצור מזון.
- שיטה זו דורשת הכנת דגימות מינימלית.
מטרת המחקר
- לכימות חומצות אורגניות ברקמות צמחים.
- לחקירת השפעתם של גורמים סביבתיים על צמיחת צמחים והתפתחותם.
- להערכת איכותם של מזונות ומשקאות באמצעות ניתוח חומצות אורגניות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- אלקטרופורזה נימיות באזור חופשי (Free zonal capillary electrophoresis) לזיהוי חומצות אורגניות.
- הכנת דגימות הכוללת מיצוי של חומצות קרבוקסיליות קצרות שרשרת.
- עיבוד של גרם אחד של דגימות פולי קפה בכל פעם.
- ניתוח בתפוקה גבוהה לשיפור היעילות.
תוצאות עיקריות
- השיטה מכמתת בהצלחה חומצות אורגניות בחומרי צמחים.
- הודגמה יישום של השיטה בניתוח השפעות התסבס של גרעיני קפה.
- הושגה תפוקה גבוהה ודרישה מינימלית להכנה.
- הודגשה כדאיות כלכלית בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- שיטה זו יעילה לחקר תגובות פיזיולוגיות של צמחים.
- ניתן ליישמה לשיפור איכות המזון ובטיחותו.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים רחבים יותר במדעי החקלאות והמזון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של חומצות קרבוקסיליות קצרות שרשרת (SCCAs) ברקמות צמחים באמצעות אלקטרופורזה נימיית (CE) נותן מענה לצורך בפרופיל מטבולי מהיר, הדיר וחסכוני בשלבי גילוי מוקדמים ובמו"פ של איכות מזון. תהליך עבודה זה מאפשר הערכה בקיבולת גבוהה של סמנים מטבוליים הרלוונטיים לפיזיולוגיה של צמחים, פיתוח גידולים ואפיון מוצרי מזון, ובכך תומך בקבלת החלטות מבוססות נתונים בנקודות מפתח בקו הרצף שבין הגילוי לפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של מסלולים מטבוליים באמצעות כימות SCCAs כמדדים תפקודיים של נשימה תאית ותגובה למעמד (stress response).
- תומכת בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור לגבי רמות מטבוליטים תחת תנאים סביבתיים או ניסויים משתנים.
- מסייעת בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מטרות על ידי קישור שינויים מטבוליים לתוצאות פנוטיפיות במערכות צמחים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין תמציות מאושרות של רקמות צמחים לצורך סריקה רב-תכליתית (high-throughput screening) של מודולטורים מטבוליים או השפעות סביבתיות.
- מספק תוצרים כמותיים וסטנדרטיים עם ספי רגישות נמוכים (0.005 mg/ml) לפיתוח בדיקות (assays) אמינות.
- מאפשר שחזור ויכולת הרחבה (scalability) באמצעות הכנת דגימות מינימלית ותהליכי עבודה אוטומטיים של CE.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם בין פרופיל מטבולי לבין אסטרטגיות של סממנים ביולוגיים תרגומיים (translational biomarkers) באמצעות כימות של SCCAs הרלוונטיים לאיכות מזון ולבריאות הצמח.
- תומך ברצף מהשלב של גילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למדידה עקבית של נקודות קצה מטבוליות לאורך מחקרים שונים.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית עבור פורטפוליו של מדעי החקלאות והמזון על ידי הבהרת ההשפעה של התערבויות על מסלולים מטבוליים מרכזיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת כימות ה-SCCA המבוססת על CE זו משתלבת בקו התגליות, החל מפרופיל מטבולי מוקדם, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר תרגומי בהקשרי מדעי הצמחים והמזון.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות למדידה מדויקת של רמות חומצות אורגניות בתגובה למשתנים ניסויים.
- סריקה: מספק תמציות הניתנות לבדיקה ה 즉מיות וניתנות לשחזור, ונתונים כמותיים לסריקת תרכובות או תנאים.
- אנליטיקה: מייצר תוצאי קריאה כמותיים ואמינים ופלט סטטיסטי להשוואות בין תנאים שונים ולקבלת החלטות מבוססות נתונים.
- מחקר תרגומי: מקדם התאמה של סמנים ביולוגיים והמשכיות פרה-קלינית על ידי סטנדרטיזציה של מדידת נקודות קצה מטבוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר לאפיון מטבולי במגוון מטריצות מבוססות צמחים ובשאלות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בניתוח מסלולים מטבוליים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, הניתנים לשחזור ובעלי יכולת הרחבה, עם הכנה מינימלית של דגימות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן אפשרות לפרופיל מטבולי מהיר ובעל תפוקה גבוהה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של פרויקטי גילוי ופרויקטים תרגומיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביוכימיה של צמחים, כימיה אנליטית ומכשור CE.
- נדרשת גישה למערכות אלקטרופורזה נימיות ולתשתית גילוי באמצעות מערך פוטודיודות (PDA).
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאימה למטריצות שונות של צמחים ומזון, תוך מתן תשומת לב ליעילות המיצוי ולהשפעות המטריצה.
- יש לנטר העמסה יתר של דגימות ואסימטריה של שיאים כדי לשמור על דיוק כמותי.
