Name: מתודולוגיות לימוד B. subtilis Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: למד מתודולוגיות לחקר מעכבי ביופילם בחיידק Bacillus subtilis. השיטות מספקות תובנות כמותיות ואיכותיות למנגנוני הפעולה של מולקולות קטנות המעכבות תהליכי רב-תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים נערכה ביחידה למיקרוסקופ אלקטרונים במכון ויצמן למדע, בתמיכת המרכז לדימות ננו וביו-ננו ע"ש אירווינג וצ'רנה מוסקוביץ. מחקר זה נתמך גם על ידי מענק I-CORE 152/1 של הקרן הלאומית למדע, מר וגברת דן קיין, גב' לויס רוזן, על ידי מענק מחקר של ידע-סלע, על ידי קרן הצדקה לרסון, על ידי תוכנית המלגות למדענים חדשים ע"ש רות והרמן אלברט, על ידי מענק המכון למדעי החומרים ותהודה מגנטית ע"ש אילזה כץ, על ידי מענק משרד הבריאות לשיטות מחקר אלטרנטיביות. ועל ידי תוכנית המחקר לשיתוף פעולה צרפת-ישראל - רמב"ם-ישראל. IKG זכתה בקתדרה לפיתוח קריירה ע"ש רולנד וסילביה.

למחברים אין מה לחשוף.

Subtilis Bacillus צורות חזקה מובנה מאוד biofilms הוא נוזל (pellicles) ועל בינוני מוצק (מושבות). לפיכך, היא משמשת אורגניזם מודל אידיאלי לאפיין את מצב הפעולה של מעכבי biofilm ספציפיים. על תקשורת מוצקה, תאי טופס מבנים רבים-תאי עם מאפייני בולטים שאינם ניכרים pellicles, כמו קמטים הקורנים מהמרכז לקצה. לפיכך, pellicles ומושבות הן מערכות משלימות ללמוד B. subtilis רב-תאיות. מטרת מחקר זה היא לפתח ב</e...

קהילות חיידקים רבות תאי לשחק תפקידים משמעותיים הסביבה טבעית אנתרופוגניים, והוא יכול להיות מועיל או מזיק ביותר. מושבות רבות התאיות אלה ידועים כמו biofilms, שבה התאים הבודדים המוטבעים מטריצת חומרים פולימריים תאיים בהפקה עצמית (EPS). EPS מאוד לדבוק התאים אל פני השטח הוא ליישב. הם לשמש כמגן נגד כוחות מכניים וכימיים וליצור קשר הדוק בין תאים שכנים, בהקלת התקשורת הסלולרית 1. Biofilm ניתן לצפות כקהילת בדיל, שבו משתמשי תאי פיקוח הדוק, מתוזמר תהליכים כדי לתאם את פעילותם בתוך הקהילה, כמו גם על פני מיני 2-5. המעבר ממצב planktonic ונטול חיים של צמיחה למצב ביופילם קשור לעתים קרובות עם תהליכים התפתחותיים. דוגמה טובה לכך היא subtilis Bacillus חיידק אדמה חיובי-גראם, ולפיכך undomeזן sticated משמש כאורגניזם מודל חזק כדי ללמוד את שלבי ההתפתחות מובילים להיווצרות ביופילם. חיידק זה, תאי ניע להתארגן מבנים רבים-תאיים בולטים מבצעות משימות מיוחדות 4. קבוצה אחת של תאים, המטריצה מפיק להפריש exopolysaccharides 6, חלבון עמילואיד טס 7,8, ואת חלבון הידרופוביות משטח BslA 9,10; שכולן להשתתף באסיפה של EPS 11-13. בהתחשב השפע של biofilms בנישות טבעיות אנתרופוגניים והניזק הקטלני המשוערת הם יכולים לגרום, יש צורך דוחק למצוא דרכים למנוע היווצרותם. מעכבי מולקולה קטנים יכולים לסייע לגילוי מסלולי רגולטוריות חדשים, אנזימים וחלבונים מבניים המעורבים ביצירת ביופילם, ובכך לקדם תובנות התהליכים המורכבים של הרכבת קהילה רבה-תאית. כב &#39; subtilis הוא מודל למד היטב עבור ביוהיווצרות סרט 14,15, זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של מעכבי ביופילם שונים. מחקר זה מתמודד עם ארבע שיטות יסוד שהן המפתח להערכת התגובה של biofilms למעכבי מולקולה קטנה. ראשית, על מנת להבטיח כי מעכבים אלה יש מטרת biofilm הספציפי, הפרדת ההשפעה על צמיחת planktonic מהשפעת על היווצרות ביופילם היא קריטית. רוב סוכני אנטיבקטריאלי למקד תאים בשלב הצמיחה planktonic שלהם, אבל מולקולות המשפיעות על אורח החיים ביופילם הם נדירים. בנוסף, כמו מולקולות שאינו משפיעות צמיחת planktonic אינן רעילות, הם יכולים להפחית את לחץ הסלקטיבי העדפת מוטציות אנטיביוטיות עמידות 16. לדוגמה, כאשר biofilms מטופלים עם חומצות אמינו D-או מולקולות מקיר מפריעים תאים אחרים מסוימים, הם גם מוטרדים או מפורקים, אבל מעכבי אלה רק במתינות להשפיע 12,17 צמיחה planktonic. לעומת זאת, אנטיביוטיקה רבה לפגוע בצמיחת planktonic דרמטית, עם little או אין השפעה על היווצרות ביופילם 17. שנית, הקמת מסגרת ניסיונית עקבית ויציב כדי לחקור את ההשפעה של המולקולות הקטנות חיונית. צפינו כי טווח הריכוז הפעיל של מעכבי מולקולה קטנים היה רגיש לתנאים מראש התרבות להגדרות הניסוי נעשו שימוש כדי לחקור את ההשפעה של מעכבי מולקולה הקטנים אלה. דיווחים שונים, במיוחד הלומדים ב subtilis, חשף וריאציות בטווח הריכוז שבו D-אמינו חומצות לדכא את היווצרות pellicles - את biofilms חיידקי צף 12,17-19. התוצאות המוצגות כאן עולות כי הגורמים הבאים להסביר את ההבדלים בטווח הריכוז הפעיל: התנאים מראש התרבות (12,17 לוגריתמים לעומת שלב מאוחר-נייח 20 צמיחה), את מדיום הגידול בשימוש המצב טרום התרבות (עשירות, undefined [מרק לוריא, LB] לעומת מוגדר [מונוסודיום גלוטמט-glycerol, MSgg]), יחס החיסון ובמיוחד הסרת המדיום מראש התרבות לפני החיסון. הטמפרטורה של צמיחה קרומית סטטי הראה תפקיד חשוב פחות בטווח הפעילות של D-לאוצין מעכב מולקולה קטנה, חומצת אמינו D-נציג השתמשו במחקר זה. לבסוף, לאחר biofilms מטופלים עם מעכבי biofilm ספציפיים, שיטות חזקות ואינפורמטיבי נדרשות לאפיין את ההשפעות של מעכבים אלה על כושר ביופילם. הנה, שתי שיטות כדי לאפיין את ההשפעה עצמאית של מעכבי מולקולה קטנים מתוארות בפירוט: (1) ההשפעה על תאים בודדים בתוך מושבה ביופילם ואת התנגדותם סוכני מיקרוביאלית. תאי biofilms הם בדרך כלל יותר עמיד לאנטיביוטיקה בהשוואת חיידקים חינם-חי 21-23. בעוד תופעה זו תלויה בכמה גורמים, היכולת של EPS כדי לצמצם את חדירת אנטיביוטיקה לעתים קרובות נחשב כהסבר מושך 24 </sup&gt;. שיטה זו מעריכה את הישרדותם של תאי biofilm שנקבע מראש לאחר חשיפה לחומרים אנטי בקטריאליים. (2) ההשפעה על אדריכלות המושבה ביופילם, מן הגדולים אל בקנה מידה קטן. מושבות Biofilm מאופיינים המבנה התלת-ממדי שלהם ואת הנוכחות של EPS. ניצול במיקרוסקופ אלקטרונים סורק, שינויים במורפולוגיה התא, מבנה המושבה ביופילם והארכיטקטורה ושפע של EPS ניתן דמיינו מן גדול (מ&quot;מ) אל בקנה מידה קטן (מיקרומטר).

<table><tbody><tr><td>מרק לוריא, לנוקס</td><td>דיפקו</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>דיפקו</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונובסיסי&nbsp;</td><td>סיגמא, 136.09 גרם/מול</td><td>P0662-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174.18 גרם/מול</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) חומצה פרופנסולפונית</td><td>פישר סיינטיפיק, 209.27 גרם/מול</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט&nbsp;</td><td>Merck, 203.30 גרם/מול&nbsp;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי נטול מים</td><td>J.T. בייקר, 110.98 גרם/מול</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>מנגן (II) כלוריד טטרהידרט</td><td>סיגמא, 197.91 גרם/מול</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>ברזל(III) כלוריד הקסהידרט&nbsp;</td><td>סיגמא, 270.30 גר' לחודש)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>אבץ כלוריד נטול מים&nbsp;</td><td>Acros Organics, 136.29 גרם/מול</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא, 337.27 גרם/מול</td><td>T1270-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>L-טריפטופן</td><td>פישר סיינטיפיק, 204.1 גרם/מול</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-פנילאלנין</td><td>סיגמא, 165.19 גרם/מול</td><td>P5482-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>L-תראונין</td><td>סיגמא, 119.12 גרם/מול</td><td>T8625-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול נטול מים</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>מלחי מונוסודיום חומצה L-גלוטמית הידרט&nbsp;</td><td>סיגמא, 169.11 גרם/מול</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-לאוצין</td><td>סיגמא, 169.11 גרם/מול</td><td>855448-10 גרם</td><td></td></tr><tr><td>אתנול נטול מים</td><td></td> סכין גילוח 830000054 <td></td><td>גדות אדיסון</td></tr><tr><td></td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ניירות סינון תאית עגולה</td><td>Whatman, 90 מ"מ</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד</td><td>EMS (מדע מיקוסקופיה אלקטרונית), 25% במים</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>EMS, 16% במים</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קקודילאט</td><td>Merck, 214.05 גרם/מול&nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי 2-הידרט</td><td>מרק, 147.02 גרם/מול&nbsp;</td><td></td><td></td>1172113</tr><tr><td>תושבת אלומיניום</td><td>EMS, ראש מחורץ</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>סרט דבק פחמן</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>שייקר 37 &deg; C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf צנטריפוגה שולחנית 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>סוניפייר דיגיטלי, דגם 250, בשימוש עם חממת Microtip ברנסון NA</td><td></td><td></td><td></td>30</tr><tr><td>& deg; C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 23 &deg; </td> מערכת סינון C <td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>, 500 מ"ל, פוליסטירן</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Sputter Coater&nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 מייבש נקודה קריטית</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה סביבתית</td><td>XL30 ESEM FEG פיליפס (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

מתודולוגיות לימוד<em&gt; b. subtilis</em&gt; biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה biofilm מעכבי

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

עבודה זו מעריכה מתודולוגיות שונות לחקר ההשפעה של מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות, כגון חומצות אמינו D, על ההתפתחות והעמידות של ביופילמים של Bacillus subtilis. ראשית, מוצגות שיטות הבוחרות מעכבי מולקולות קטנות עם מטרות ספציפיות לביופילם על מנת להפריד בין השפעת מעכבי המולקולות הקטנות על צמיחת הפלנקטון מהשפעתם על היווצרות ביופילם. לאחר מכן, אנו מתמקדים באופן שבו תנאי החיסון משפיעים על הרגישות של תרביות B. subtilis רב-תאיות צפות למעכבי מולקולות קטנות. התוצאות מצביעות על כך שאי התאמות בהשפעות המדווחות של מעכבים כאלה כגון חומצות אמינו D נובעות מתנאים לא עקביים לפני התרבית. יתר על כן, מתואר פרוטוקול שפותח לאחרונה להערכת התרומה של טיפולים במולקולות קטנות לעמידות ביופילם לחומרים אנטיבקטריאליים. לבסוף, טכניקות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) מוצגות כדי לנתח את הסידור המרחבי התלת מימדי של תאים והמטריצה החוץ-תאית הסובבת אותם בביופילם B. subtilis. SEM מאפשר תובנה לגבי ארכיטקטורת הביופילם התלת מימדית ומרקם המטריצה. שילוב של השיטות המתוארות כאן יכול לסייע מאוד בחקר התפתחות הביופילם בנוכחות ובהיעדר מעכבי ביופילם, ולשפוך אור על מנגנון הפעולה של מעכבים אלה.

את assay הקרומית היא אחת שיטות כדי לחקור את תהליכי פיקוח הדוק והדינמיים של B. subtilis רב-תאיות. מלבד זאת, assay הקרומית מתאימה לבדוק מגוון של תנאים או טרום פתיחה או ריכוזי מולקולה קטנים בצלחת multidish תא-תרבות אחת בניסוי אחד. עם זאת, ב &#39; ההיווצרות קרומית subtilis רגישה לתנאים מראש התרבות (למשל, מדיום גידול של התרבות טרום שלב הצמיחה שלה), יחס החיסון והסרת המדיום מראש התרבות. לפיכך, אנו הוקרן לראשונה עבור התקנה ניסיונית שאפשר לנו לשחזר עיכוב...

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

ביופילמים חיידקיים הם בעלי חשיבות רבה לבריאות האדם, שכן הם מגנים על החיידקים השוכנים בהם מפני פגיעות סביבתיות ומסמנים אנטי-מיקרוביאליים. מטרתו של הליך זה הייתה לפתח מערכת מודל להערכת ההשפעות של מעכבים ממולקולות קטנות על היווצרות ביופילמים. שיטות אלו יכולות לסייע בביסוס מערך כלים חיוני לתחום הביופילמים לצורך בחירת מעכבים ממולקולות קטנות המכוונים באופן ספציפי להיווצרות ביופילמים.היתרון המרכזי של מתודולוגיות אלו הוא שהן מבוססות על מסגרת ניסויית עקבית וחזקה, ומספקות תובנות כמותיות ואיכותיות לגבי מנגנון הפעולה של מעכבים ספציפיים לביופילם. אף ששיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי ביופילמים של Bacillus subtilis, ניתן להחיל אותן גם על חיידקים אחרים היוצרים ביופילם, כגון Pseudomonas aeruginosa או הפתוגן הצמחי Xanthomonas citri. מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת עשויה להיות חיונית לניתוח ההשפעה של מולקולות קטנות על היווצרות ביופילם, מכיוון שהיא מאפשרת תצפית על המטריצה החוץ-תאית ומספקת רזולוציה של תא בודד.כדי להתחיל, בחר תחילה מושבה בודדת מתאימה, והעבר אותה לתוך 3 mL של מרק LB. הנח תרבית התנעה זו באינקובטור שוקר למשך ארבע שעות ב-37 °C. לאחר הדגירה, קח 1.5 mL מתרבית ההתנעה, וסבב אותה בצנטריפוגה למשך ארבע דקות.הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן השהה מחדש את המשקע ב-1.5 milliliters של מצע MSgg. להצמחת פליקולס (pellicles), הכן פלטת תרבית תאים בעלת 12 בארות על ידי הוספת שלושה milliliters של MSgg לכל בארה. לחלק מהבארות הללו, הוסף MSgg עם מעכב מולקולרי קטן בטווח ריכוזים, תוך פיזור מיקומי הריכוזים השונים על פני הפלטה, כדי למנוע אפקטי שוליים.מדדו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של תרבית ההתנעה שנש suspension-הההחזרה. הצפיפות של התרבית צריכה להיות בין 0.6 ל-1. שלב זה קריטי עבור חוסנו של המערכת.החדירו לכל באר בצלחת התרבית 3 µL של תרבית ההתחלה שהושעתה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 23 °C למשך שלושה ימים בתנאים סטטיים. לאחר מכן, הוציאו את הצלחת מהמדגור ותצפיתו בפליקלות (pellicles).כדי לגדל ביופילמים, השתמשו בתבנית והניחו באופן סימטרי ארבע טיפות נפרדות של 1.5 µL של תרבית התנעה שאינה שטופה על צלחת 1.5% Agar MSgg יבשה בקוטר 8.5 cm. המתינו עד שהטיפות ייספגו במצע לפני הזזת הצלחת. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה ימים.באמצעות מיקרוסקופ בינוקולרי עם חשיפה אחידה לתאורה, ודאו כי התפתחו מושבות של ביופילם והיוו מבנה מקומט תלת-ממדי. ראשית, קחו להב תער נקי וחלקו את מושבות הביופילם לשני חלקים שווים בעזרת התבנית. הרימו בזהירות מחצית אחת מהמושבה באמצעות שפכטל נקי, והעבירו אותה למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5-milliliter, המכילה 500 µL של PBS.קחו את החצי השני של המושבה והעבירו אותו למבחנה למיקרו-צנטריפוגה המכילה 500 µL של 50% ethanol. אלו ישמשו להערכת העמידות לחומרי עיקור. לאחר מכן, קחו באופן דומה את החצי הראשון של המושבה שטופלה ב-D-lysine, והניחו אותו ב-PBS.לאחר מכן, קחו את החצי השני של מושבה זו והעבירו אותו לאתנול. דגרו את כל המבחנות המכילות את חצאי הביופילם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סובבו אותם בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-18,000 ×g.בעזרת פ pipette, הסר בזהירות את העל-נוזל (supernatant). הוסף 300 µL של PBS, ולאחר מכן בצע סוניקציה לתאים בהגדרה נמוכה, באמצעות סוניקטור עם מיקרו-טיפ. הוסף 700 µL נוספים של PBS כדי להגיע לנפח סופי של 1 mL.בשלב הבא, בצעו דילול סדרתי של 10 בחזקת מינוס שבע ב-PBS. קחו 100 µL מאחד מהדילולים, והזריעו אותם על צלחת LB Agar בריכוז 1.5%. חזרו על שלב זה עבור שני דילולים נוספים לכל דגימה.פזרו את התרבית הראשונית באמצעות חרוזי זכוכית, ולאחר מכן דגרו את הצלחות באופן לילה בטמפרטורה של 30 °C. בחנו את הצלחות וספרו את היחידות יוצרות המושבות, או CFU. לאחר חישוב ערך ה-CFU למיליליטר, חשבו את אחוז השורדים בטיפולי ה-PBS לעומת האתנול.כדי להתחיל בקיבוע הדגימות, הכינו תחילה תמיסת קיבוע טרייה בכמות המספיקה למספר מושבות הביופילם הרצוי. הוסיפו בזהירות 5 mL של חומר מקבע לכל צלחת פטרי, והימנעו מפיפוט ישירות על המושבות. המושבות יתחילו להיפרד מהאגר ולצוף.אטמו בזהירות את הפלטות באמצעות parafilm, והדגירו במנער סיבובי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. העבירו את הפלטות לאחסון בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. הסירו בעדינות את נוזל הקיבוע באמצעות פיפט פסטור המחוברת לוואקום.הוסיפו 10 milliliters של בופר sodium cacodylate בריכוז 100 nanomolar ו-calcium chloride בריכוז five millimolar כדי לשטוף את הביופילם, והדגירו למשך חמש דקות. הפרידו בזהירות את מרכז מושבת הביופילם מלוח ה-Agar באמצעות פיפטת Pasteur. לייבוש המושבות באוויר, גזרו נייר מסנן תאית לרבעים, ואז טבלו חלק אחד ב-100% ethanol.העבירו בזהירות מושבה אחת של ביופילם צף אל הנייר. הניחו את הנייר בתוך צלח פטרי המרופד בנייר מסנן יבש. לאחר מכן, כסו את הצלח והשאירו אותו במנדף כימי לייבוש למשך הלילה.על מנת לשמר את המורפולוגיה של מושבת הביופילם, חשוב להניח את נייר הסלולוז כך שיכסה לחלוטין את הביופילם הצף. לאחר הנחתו על הנייר, לא ניתן יהיה לסדר מחדש את הביופילם. כסו תומך למיקרוסקופ אלקטרוני בסרט פחמן, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה כדי להעביר בזהירות את מושבות הביופילם אל התומך.לאחר חיבור כל מושבה לבסיס (stub), באמצעות הוספת גשר דק של סרט פחמן, יש לאחסן את הבסיסים בדסיקטור למשך 24 שעות או עד למועד השימוש. שלב זה דורש יד יציבה ומדויקת, מכיוון שבשלב זה הביופילמים שבירים מאוד ונוטים להיסדק בקלות. האתגר הוא להצמיד חלק משמעותי מהביופילם ללא סדקים.ביום הבדיקה, הכניסו את המושבות למכשיר ציפוי בשיטת התזה של זהב-פלדיום (gold-palladium sputter coater). צפו את הדגימות במשך שתי דקות בזווית של 60 מעלות. חזרו על שלב זה פעמיים, תוך סיבוב הדגימות ב-120 מעלות בין פעם אחת לשנייה.לבסוף, צפו את הדגימות פעם אחת למשך שלוש דקות מלמעלה. הדגימות מוכנות כעת לדימות ב-SEM. תמונות אלו מראות היווצרות פליקל (pellicle) של B.subtilis שגודלו במצע MSgg המעודד היווצרות ביופילם.בעזרת הוספה של המעכב מולקולה קטנה D-lysine, התפתחות הפליקל (pellicle) פוחתת. וככל שריכוז המעכב עולה, נצפית ירידה מתואמת ביצירת הפליקל. גרף זה מראה את השפעת החשיפה לאתנול על הישרדות תאים בתוך מושבות ביופילם, שטופלו במעכב D-lysine, או שלא טופלו.מושבות שטופלו ב-D-lysine ונחשפו ל-50% ethanol למשך 10 דקות, הראו ירידה דרמטית בהישרדות בהשוואה לחלק שלא טופל. תמונות בינוקולריות מלמעלה מראות כי מושבות שגדלו בנוכחות D-lysine היו קטנות יותר באופן כללי, ויצרו קמטוטים פחות בולטים מאלו שלא טופלו. תמונות ממיקרוסקופ אלקטרוני סורק של מושבות ביופילם שעברו ייבוש בנקודה קריטית חושפות עוד יותר את ההתפתחות השינוית של הביופילם.מטריצת החומרים פולימריים חוץ-תאיים, או EPS, נראתה יותר כמו קורי עכביש בדגימות שלא טופלו, בעוד שבדגימות המטופלות נצפתה ארגון מועט יותר. לבסוף, בדיקה ברזולוציה של תאי חיידקים בודדים מראה כי התאים המטופלים הם מוארכים במראם, מכוסים פחות ב-EPS, ואינם מחוברים באופן הדוק לשכניהם כפי שקורה בתאים שלא טופלו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי קביעת מסגרת עקבית לבחינת מעכבי ביופילם חיונית לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.ברגע שהשיטה נלמדה, ניתן לבצע סריקה של מולקולות קטנות לעיכוב ביופילם בפחות משבוע, אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון חקירה של ביטוי גנים בתאי ביופילם בודדים, כדי להשיג תובנות נוספות לגבי המטרה של המולקולה הקטנה המעכבת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנתח את ההשפעה הכוללת של מעכבי ביופילם ספציפיים על התפתחות הביופילם ועל עמידות לאנטיביוטיקה.

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: טיי, ס. ב. ואחרים. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה לכימות ביומסה ביופילמית בחיידק פתוגני, תוך השוואת מערכות ביקורת לא מטופלות לדגימות שטופלו באנזים שמדביר קווארום. האנזים משבש את איתות החיידקים במהלך הדגירה המוקדמת, ומפחית את ההיצמדות של התא. לאחר שטיפה והמשך דגירות, בארות הבקרה יוצרות ביופילמים צפופים, בעוד שבארות מטופלות מראות היווצרות מופחתת. צבע קטיוני משמש לצביעת הביופילם, ונמדד ספיגה להערכת...

כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

מקור: טיי, ס. ב., et.al. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים את תהליך עיכוב היווצרות ביופילם על ידי הכנסת אנזים שמפריע לאיתות תאי חיידקים. האנזים מונע מהחיידקים לייצר חומרים פולימריים חוץ-תאיים, ובכך מפחית את התפתחות הביופילם על מיקרודיסה עם תחתית זכוכית. לבסוף, מבנה הביופילם מוצג באמצעות לקטין פלואורסצנטי ומיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי.

הערכה מיקרוסקופית של עיכוב היווצרות ביופילם בתיווך אנזימים

מקור: בוכר, ט. ואחרים. שיטות לחקר ביופילמים של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים בדיקת יצירת פליקלים באמצעות Bacillus subtilis להערכת מעכבי מולקולות קטנות שמפריעים לסינתזת מטריצה ולהתפתחות ביופילם, ומספק מודל לסינון תרכובות שמעכבות באופן סלקטיבי צמיחה קשורה למשטח מבלי להשפיע על תאים צפים חופשיים.

הערכת השפעות המעכבים על היווצרות פליקלים ב-Bacillus subtilis

מקור: בוכר, ט. ואחרים. שיטות לחקר ביופילמים של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp. (2016).הסרטון הזה מדגים כיצד שלמות מטריצת הביופילם משפיעה על עמידות חיידקים לאתנול על ידי השוואת יחידות יוצרות מושבות בביופילמים לא מטופלים ומופרעים על ידי מעכבים. הפחתת CFU בדגימות שטופלו במעכבים מראה כי מטריצת החוץ-תאית חיונית להגנה על תאים מוטמעים בביופילם מפני לחץ אנטימיקרוביאלי.

בדיקת עמידות לאתנול להערכת שלמות מטריצת הביופילם

מקור: Bucher, T., ואחרים, מתודולוגיות לחקר Biofilms של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp.(2016)הסרטון הזה מדגים את הכנת מושבות ביופילם חיידקיות בוגרות להדמיה ברזולוציה גבוהה. הוא עוסק בשלבי קיבוע, ייבוש, התקנה וציפוי מתכת לשימור והדגשת מורפולוגיית ביופילם.

הכנת מושבות ביופילם חיידקיות לניתוח מורפולוגי

אנזימים מרווה מניין הם אפשרויות אנטי-אלימות ואנטי-בקטריאליות שיכולות להפחית פתוגנזה ללא סיכון ליצירת עמידות, על ידי מניעת ביטוי של גורמי אלימות וגנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות ביופילם. במחקר זה, אנו מדווחים על שיטה המדגימה את יעילותם של אנזימים מרווים מניין בשיבוש ביופילם חיידקי.

שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה

רוב הזיהומים החיידקיים מייצרים ביופילם. מתוקף הסביבה שלהם, חיידקים הקשורים לביופילם הם לעתים קרובות עמידים לתרופות פנוטיפיות. מולקולות אנטיבקטריאליות חדשות שהורגות חיידקים בביופילמים נמצאות אפוא בעדיפות גבוהה. אנו מקימים בדיקה לסינון מהיר של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות היעילות בהדברת ביופילמים.

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

זיהומי ביופילם מראים סבילות גבוהה לכימותרפיה. אין בדיקה אחת שתופסת את המורכבות של ביופילמים. במקום זאת, יש צורך בבדיקות משלימות. אנו מציגים פלטפורמת סינון (שפותחה עבור S. aureus) המשלבת מבחני כדאיות, ביומסה ומטריצת ביופילם. זה מאפשר גילוי תרופות אנטי-ביופילם, כולל הערכה של השפעות כימותרפיות ארוכות טווח.

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

מוצרים טבעיים מייצגים נקודות התחלה מבטיחות לפיתוח תרופות חדשות וסוכנים טיפוליים. עם זאת, בשל המגוון הכימי הגבוה, מציאת תרכובות טיפוליות חדשות מצמחים היא משימה מאתגרת וגוזלת זמן. אנו מתארים גישה פשוטה לזיהוי מולקולות מיקרוביאלית ואנטיביופילם מתמציות צמחים ושברים.

גישה שיטתית לזיהוי מולקולות אנטי-מיקרוביאליות ואנטיביופילם חדשניות מתמציות ושברים של צמחים למניעת עששת שיניים

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לביצוע צמיחת ביופילם ומדידות ביומסה באמצעות התקני לוח PCR עמוקים בהרכבה עצמית עבור הקרנת ביופילם סטטית של מכסה 96-היטב.

ייצור ביופילם ביומסה חיידקית גדולה יותר באמצעות מכשירי מיקרופלאט עמוק באר עמוקה צלחת PCR

פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.

הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות

למד מתודולוגיות לחקר מעכבי ביופילם בחיידק Bacillus subtilis. השיטות מספקות תובנות כמותיות ואיכותיות למנגנוני הפעולה של מולקולות קטנות המעכבות תהליכי רב-תאיות.

מתודולוגיות לימוד

גלה סרטונים נוספים