מתודולוגיות לימוד B. subtilis Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

ביופילמים של חיידקים חשובים לבריאות האדם, ומגנים על תושבי החיידקים שלהם מפני עלבונות סביבתיים וגורמים אנטי-מיקרוביאליים. מטרת הליך זה הייתה לפתח מערכת מודל להערכת ההשפעות של מעכבי מולקולות קטנות על היווצרות ביופילם. שיטות אלה יכולות לסייע בהקמת סט כלים חיוני לשדה הביופילם לבחירת מעכבי מולקולות קטנות המכוונים ספציפית להיווצרות ביופילם.

היתרון העיקרי של מתודולוגיות אלה הוא שהן מתחילות ממסגרת ניסויית עקבית וחזקה, ונותנות תובנות כמותיות ואיכותיות לגבי מנגנון הפעולה של מעכבים ספציפיים לביופילם. למרות ששיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי ביופילמים של Bacillus subtilis, ניתן ליישם אותן גם על חיידקים אחרים היוצרים ביופילם, כגון Pseudomonas aeruginosa או הפתוגן הצמחי Xanthomonas citri. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק יכול להיות חיוני לניתוח ההשפעה של מולקולות קטנות על היווצרות ביופילם, מכיוון שהוא מאפשר תצפית על המטריצה החוץ-תאית, ונותן רזולוציה של תא בודד.

כדי להתחיל, בחר תחילה מושבה אחת מתאימה, והעביר אותה לשלושה מיליליטר מרק LB. הכניסו את תרבית המתנע הזו לאינקובטור רועד למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, קח 1.5 מיליליטר מתרבית המתנע, וצנטריפוגה למשך ארבע דקות.

הסר בזהירות את הסופרנטנט ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב -1.5 מיליליטר של מדיום MSgg. כדי לגדל פליקלים, הכינו צלחת תרבית תאים של 12 בארות על ידי הוספת שלושה מיליליטר MSgg לכל באר. לחלק מהבארות הללו, הוסף MSgg עם מעכב מולקולה קטן בטווח ריכוז, תוך פיזור המיקום של ריכוזים שונים סביב הצלחת, כדי למנוע השפעות קצה.

מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של תרבית המתנע המושעה מחדש. התרבות צריכה להיות בין 0.6 לאחד. זה קריטי לחוסנה של המערכת.

יש לחסן כל באר של צלחת התרבות עם 3 מיקרוליטר של תרבית המתנע המושעה מחדש. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים בתנאים סטטיים. לאחר מכן, הוציאו את הצלחת מהאינקובטור, והתבוננו בפליקלים.

כדי לגדל ביופילמים, השתמש בתבנית ואתר באופן סימטרי ארבע טיפות נפרדות של 1.5 מיקרוליטר של תרבית התחלה לא שטופה על צלחת מיובשת של 8.5 סנטימטר 1.5% אגר MSgg. הניחו לטיפות להיספג במדיום לפני הזזת הצלחת. דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.

באמצעות משקפת עם חשיפה הומוגנית של תאורה, בדוק שמושבות הביופילם התפתחו ויצרו מבנה מקומט תלת מימדי. ראשית, קחו סכין גילוח נקי וחתכו את מושבות הביופילם לשני חלקים שווים בעזרת התבנית. הרם בזהירות מחצית מהמושבה בעזרת מרית נקייה, והעביר אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, המכיל 500 מיקרוליטר PBS.

קחו את המחצית השנייה של המושבה, והעבירו אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 500 מיקרוליטר של 50% אתנול. אלה ישמשו להערכת עמידות בפני חומרי עיקור. לאחר מכן, קחו באופן דומה את המחצית הראשונה של המושבה שטופלה ב-D-ליזין, והניחו אותה ב-PBS.

לאחר מכן, קחו את החצי השני של המושבה הזו, והעבירו אותה לאתנול. דגרו על כל הצינורות המכילים את חצאי הביופילם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, צנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב 18, 000 פעמים גרם.

בעזרת פיפטה, הסר בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 300 מיקרוליטר PBS, ולאחר מכן סוניקטור את התאים בהגדרה נמוכה, עם סוניקטור מיקרוטיפ. הוסף עוד 700 מיקרוליטר PBS לנפח סופי של מיליליטר אחד.

לאחר מכן, בצע דילול סדרתי של 10 ל-7 השלילי ב-PBS. קח 100 מיקרוליטר מאחד הדילול, וחסן צלחת LB של 1.5%. חזור על שלב זה עבור שני דילולים נוספים לכל דגימה.

מורחים את האינקולום בעזרת חרוזי זכוכית, ואז דוגרים את הצלחות למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס. בחנו את הלוחות וספרו את היחידות היוצרות מושבה, או CFU. לאחר חישוב ה-CFU לערך מיליליטר, חשב את אחוז השורדים בטיפולי PBS לעומת אתנול.

כדי להתחיל בקיבוע הדגימה, הכינו תחילה מספיק תמיסת קיבוע טרייה למספר הרצוי של מושבות ביופילם. הוסיפו בזהירות חמישה מיליליטר של קיבוע לכל צלחת פטרי, והימנעו מפיפטינג ישירות על מושבות. מושבות יתחילו להתנתק מהאגר ולצוף.

אוטמים בזהירות את הצלחות בעזרת פרפילם, ודוגרים על שייקר סיבובי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. מעבירים את הצלחות לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר בעדינות את הנוזל המקבע בעזרת פיפטה פסטר, המחוברת לוואקום.

הוסף 10 מיליליטר של 100 ננו-מולרי נתרן קקודילאט, מאגר סידן כלורי של חמישה מילי-מולרי כדי לשטוף את הביופילם, ודגירה למשך חמש דקות. נתק בזהירות את מרכז מושבת הביופילם מצלחת האגר בעזרת פיפטת פסטר. כדי לייבש מושבות באוויר, חותכים נייר סינון תאית לרבעים, ואז טובלים קטע אחד באתנול 100%.

העבירו בזהירות מושבת ביופילם צפה אחת על הנייר. מניחים את הנייר בצלחת פטרי מרופדת בנייר פילטר יבש. לאחר מכן, מכסים את הכלי ומשאירים אותו במכסה מנוע כימי לייבוש למשך הלילה.

על מנת לשמר את המורפולוגיה של מושבת הביופילם, חשוב להניח את הביופילם הצף לחלוטין עם נייר התאית. ברגע שהביופילם מופיע על הנייר, לא ניתן לכוונן אותו מחדש. מצפים בדל מיקרוסקופ אלקטרונים בסרט פחמן, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה כדי להעביר בזהירות את מושבות הביופילם אל הבדל.

לאחר חיבור כל מושבה לבדל, על ידי הוספת גשר דק של סרט פחמן, אחסן את הבדים בחומר ייבוש למשך 24 שעות או עד הצורך. שלב זה דורש יד יציבה ומדויקת, מכיוון שבשלב זה הביופילמים שבירים מאוד ונשברים בקלות. האתגר הוא להרכיב חלק ניכר מהביופילם ללא סדקים.

ביום הבדיקה, הניחו את המושבות בציפוי זהב-פלדיום. מצפים את הדגימות במשך שתי דקות בזווית של 60 מעלות. חזור על שלב זה פעמיים, סובב דגימות 120 מעלות בין לבין.

לבסוף, מצפים את הדגימות פעם אחת למשך שלוש דקות מלמעלה. הדגימות מוכנות כעת להדמיה ב-SEM. תמונות אלה מראות היווצרות פליקלית של B.subtilis הגדל במדיום MSgg המעורר ביופילם.

עם תוספת של מעכב המולקולה הקטנה D-ליזין, התפתחות הפליקל מופחתת. וככל שריכוז המעכב עולה, היווצרות הפליקל מראה ירידה בקורלציה. גרף זה מראה את השפעת החשיפה לאתנול על הישרדותם של תאים בתוך מושבות ביופילם, שטופלו במעכב D-ליזין או שנותרו ללא טיפול.

מושבות שטופלו ב-D-ליזין, ונחשפו ל-50% אתנול במשך 10 דקות, הראו ירידה דרמטית בהישרדות בהשוואה לחלק הלא מטופל. תמונות דו-עיניות מלמעלה למטה מראות כי מושבות שגדלו בנוכחות D-ליזין היו קטנות יותר באופן כללי, ויצרו קמטים פחות בולטים מאלה שנותרו ללא טיפול. סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של מושבות ביופילם מיובשות בנקודה קריטית חושפות עוד יותר את התפתחות הביופילם שהשתנתה.

מטריצת החומרים הפולימריים החוץ-תאיים, או EPS, נראתה יותר כמו קורי עכביש בדגימות לא מטופלות, כאשר דגימות שטופלו הראו פחות ארגון. לבסוף, בחינה ברזולוציה של תאי חיידקים בודדים מראה כי התאים המטופלים מוארכים במראה, פחות מכוסים ב-EPS, ואינם מחוברים באופן הדוק לשכניהם כמו התאים הלא מטופלים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי קביעת מסגרת עקבית לחקר מעכבי ביופילם חיונית לתוצאות הניתנות לשחזור.

לאחר השליטה, ניתן לבצע בדיקת מולקולה קטנה לעיכוב ביופילם תוך פחות משבוע אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון חקירת ביטוי גנים בתאי ביופילם בודדים, על מנת לקבל תובנות נוספות לגבי המטרה של מעכב המולקולה הקטנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לנתח את ההשפעה הכוללת של מעכבי ביופילם ספציפיים על התפתחות ביופילם ועמידות לאנטיביוטיקה.