הגדרת מצע ספציפי עבור מועמדי lipase ו פוספוליפאז

המטרה הכוללת של הליך זה היא להאיץ את איתור הסובסטרטים הפיזיולוגיים עבור ליפאזות ופוסופוליפאזות פוטנציאליות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנטומולוגיה, כגון כיצד פוספוליפאזות תורמות לעיצוב מחדש של שומנים בממברנות ביולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אופטימיזציה של הפעילות האנזימטית והחיפוש אחר המצע הטבעי לאנזים באופן עצמאי.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ספציפיות הסובסטרט של ליפאזות חיידקים ופוספוליפאזות, ניתן לשנות אותה גם כדי לחקור הידרולזים של כל אורגניזם מודל אחר. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר חיפשנו פעילות אנזימטית שיכולה לפגוע בשומן הממברנה הפנימית פוספטידילכולין אינוריזוביום מלילוטי. להכנת תמציות חלבון ללא תאים, הפשירו תרחיפי תאי חיידקים ואחסנו אותם על קרח.

לאחר מכן, העבירו את תרחיפי התאים שלוש פעמים דרך תא לחץ קר ב-20,000 פאונד לאינץ' מרובע. הסר את התאים הפנימיים ואת פסולת התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5, 000 פעמים גרם למשך 30 דקות, בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הכינו מינוסים של 100 ו -500 מיקרוליטר מהסופרנטנט לניתוח שלאחר מכן.

הגדר את מבחן האנזים המותאם בעבר באמצעות סכמות הפיפטינג המפורטות בפרוטוקול הטקסט. לכיסוי ראשוני של פעילויות אנזימים מובהקות, השתמש במצעים מלאכותיים המניבים תוצר צבעוני בעת הידרוליזה, כגון נגזרות פרה-ניטרופנול או PNP. עקוב אחר מסלול הזמן לעלייה בספיגה ב-405 ננומטר, עקב היווצרות PNP בספקטרופוטומטר ב-30 מעלות צלזיוס במשך תקופה של חמש דקות.

לבסוף, בצע חישובים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לתיוג רדיו של שומנים, הכינו תרבית מוקדמת למשך הלילה של אורגניזם מעניין בחמישה מיליליטר של מדיום התרבות הרצוי וגידלו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. מהתרבית המוקדמת, יש לחסן ל-20 מילימטרים של מדיום טרי בבקבוק תרבית של 100 מילימטר, כדי לקבל צפיפות אופטית ראשונית ב-620 ננומטר של 0.3 עבור התרבית.

לאחר מכן, העבירו מנה של מיליליטר אחד של התרבית לצינור תחתון עגול מפוליסטירן סטרילי בנפח 14 מיליליטר בתנאים סטריליים. הוסף מיקרוקורי אחד של 114 c אצטט לתרבית של מיליליטר אחד. לאחר מכן, דגרו את התרבות הנוזלית בתסיסה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

בתום תקופת הדגירה, העבירו את התרבית לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. השעו את הגלולה ב -100 מיקרוליטר מים. בשלב זה, אחסן את תרחיף התא במינוס 20 מעלות צלזיוס או המשך מיד במיצוי שומנים קוטביים.

כדי לבצע מיצוי של שומנים קוטביים, הוסף 375 מיקרוליטר של מתנול שניים לאחד לתמיסת כלורופורם ל-100 מיקרוליטר של תרחיף תאים מימיים. מערבל את הדגימה למשך 30 שניות לפני הדגירה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, צנטריפוגה למשך חמש דקות ב 12, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 125 מיקרוליטר כלורופורם ו -125 מיקרוליטר מים לסופרנטנט. לאחר מערבולת של 30 שניות, צנטריפוגה את הדגימה למשך דקה אחת ב-12,000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר.

העבירו את שלב הכלורופורם התחתון לצינור טרי. לאחר מכן, יבש את התמיסה בזרם גז חנקן. ממיסים את השומנים המיובשים ב -100 מיקרוליטר כלורופורם לתמיסת מתנול.

להפרדת שומנים קוטביים ניטרליים על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה, יש למרוח שלוש עליות מיקרוליטר של דגימות השומנים, על יריעת אלומיניום סיליקה ג'ל כרומטוגרפיה בשכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים, החל משני סנטימטרים מקצוות הצלחת. אם מספר דגימות מנותחות בכרומטוגרפיה חד מימדית, שמור על מרחק של לפחות 1.5 סנטימטרים בין נקודות יישום הדגימה השונות. העבר את השלב הנייד לתא פיתוח TLC, מצופה פנימית בנייר כרומטוגרפיה.

מכסים בצלחת זכוכית כדי לתת לתא להרוות למשך 30 דקות. העבר את יריעת האלומיניום HPTLC סיליקה ג'ל עם דגימות השומנים המיובשות לתא. הניחו לצלחת להתפתח במשך 30 דקות בתא סגור לפני הסרת הצלחת.

לאחר מכן, הניחו לממיסים להתייבש במכסה המנוע למשך שעתיים. לאחר שגיליון ה-TLC שפותח יבש, דגרו אותו עם מסך זוהר הניתן לפוטוסטימולציה בקלטת סגורה למשך שלושה ימים. לאחר מכן, חשוף את המסך המודגר לסורק PSL ורכוש תמונה וירטואלית של השומנים המופרדים עם תוויות רדיו.

כדי לקבוע את פעילות הליפאאז דיאצילגליצרול, או DAG, הוסף תחילה 5,000 CPM של 14 DAG עם תווית C לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כמו כן, הוסף תמיסה של Triton X-100 לצינור וערבב לפי מערבולת. יבש את התמיסה מתחת לזרם חנקן.

לבדיקה סופית של 100 מיקרוליטר, הוסף מאגר Tris-HCl, תמיסת נתרן כלורי ומים מזוקקים דו-מזוקקים. מערבולת למשך חמש שניות. התחל את התגובה על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של אנזים לתמיסה.

דגרו את התמיסה בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. עצור את התגובה על ידי תוספת של 250 מיקרוליטר מתנול ו-125 מיקרוליטר כלורופורם, לפני מיצוי שומנים כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. המשך לנתח שומנים קוטביים ניטרליים על ידי 1DTLC והדמיית PSL שלאחר מכן כמו קודם.

למרות שהפוסופוליפאז החזוי SMc01003 מראה פעילות עם אסטרי אציל פרה-ניטרופנול מלאכותיים, הפעילות היא רק כפולה או משולשת מפעילות הרקע הקיימת בתמציות נטולות תאים של Escherichia coli, בהן לא התבטא גן זר. זה מצביע על כך שאסטרי אציל פרה-ניטרופניל אינם נראים כסובסטרטים טובים ל-SMc01003. בעוד שתמציות נטולות תאים של E.Coli אינן יכולות לפרק דיאצילגליצרול, תמציות של זנים שבהם התבטא הפוספוליפאז החזוי, SMc01003, גרמו לפירוק של דיאצילגליצרול.

למרות ש-SMc01003 נחזה להיות פוספוליפאז, זהו למעשה דיאצילגליצרול ליפאז שמפרק דיאצילגליצרול למונואציל גליצרול וחומצת שומן אחת. לאחר מכן הוא מפרק מונואציל גליצרול עוד יותר לגליצרול ולחומצת שומן אחרת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שבועות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייעל את פעילות האנזימים של ליפאזות ופוספוליפאזות, וכיצד להמשיך בחיפוש אחר המצעים הפיזיולוגיים שלהם. יתרון מכריע של הליך זה הוא שניתן להפריד את האופטימיזציה של פעילות האנזים מהחיפוש אחר מצע האנזים הטבעי. אל תשכח שעבודה עם ממיסים אורגניים או חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות הנדרשים בעת ביצוע הליך זה.