יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ'יק
17 בנובמבר 2016
מתוארים פרוטוקולים המשתמשים במחסומים אטומים לחסימת אירועי אינדוקציה בין רקמות ציר הגוף הראשי והצד בעובר הגוזל הנדרשים להיווצרות גפיים. חרוזים ספוגים באותות אינדוקטיביים מועמדים משמשים להתגברות על ההשפעה של מיקום מחסום וניתוח ביטוי גנים מאשר זאת.
מטרת התערבות כירורגית זו היא להבהיר את מנגנוני השראת הגפיים בעובר הגוזל על ידי מניעת פיזור מולקולות איתות מרקמות מדיאליות לתאים במזודרם הצלחת הצדדית וחקר השפעתו על ביטוי גנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית כגון, מהם האותות האינדוקטיביים לשליטה בהתחלת ניצני הגפיים. היתרון בטכניקה זו הוא שעובר הגוזל נגיש למניפולציה כירורגית וחזק מאוד, בנוסף, ניצן הגפה הבקרה הנגדית הלא מנותח משמש כבקרה פנימית שימושית מאוד.
סוזן ויילד תדגים את הנוהל. כדי להתחיל, חותכים חתיכה מרובעת בגודל 1 ס"מ של נייר אלומיניום בעובי 0.013 מ"מ ומעקרים אותה על ידי ניגובה באתנול 70%. לאחר מכן, הניחו את הריבוע על צלחת פטרי מפלסטיק סטרילית בגודל 6 ס"מ.
כדי למנוע היצמדות סטטית, השליכו את המכסה והכינו חדש למנה מאותו נייר כסף. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על גבי גרטיקול במה תחת מיקרוסקופ דו-עיני המוגדר בהגדלה של פי 1.6. השתמש באזמל קטן להב מספר 15 כדי לחתוך רצועות ברוחב 1.3 מ"מ של נייר הכסף באורך 2 מ"מ.
הפרד את רצועות נייר הכסף באמצעות שני זוגות מלקחיים של יצרני שעונים מספר ארבע. לאחר מכן, בצע כיפוף בזווית ישרה במרכז מחסום נייר הכסף כך שהוא דומה לציר. יישרו את המחסומים במרכז צלחת הפטרי כשצד אחד שטוח כנגד הצלחת והשני מצביע החוצה מהצלחת, הכינו 20 מחסומים או יותר לפני יום הפעולה.
הניחו את מכסה נייר הכסף מעל הכלי ואחסנו את המחסומים במקום בו הם לא יופרעו. כשהביצה שוכבת על צדה, אחזו בחוזקה בזוג מלקחיים חזקים מסוג AA והשתמשו בתנועת דקירה מבוקרת כדי לנקב את הקצה הקהה של הביצה המכילה את שק האוויר תוך החזקת הביצה ביד החופשית. וודא שקרום המעטפת הפנימי נשבר.
לאחר מכן, קחו את הביצה בשתי הידיים וסובבו אותה 180 מעלות לאורך הציר האופקי שלה. לאחר מכן, קחו חתיכת סרט שקוף, כ -5 ס"מ רבוע והדביקו אותה היטב על פני השטח העליונים של הביצה כדי למנוע מקליפת הביצה להתפורר על העובר בעת פתיחת הביצה. השתמש במספריים מעוקלים כדי לפרוץ בעדינות את הקליפה ואת קרומי התאים הפנימיים הקשורים אליה במרכז החלק העליון של הביצה.
צרו חור קטן מאוד עם להב אחד של המספריים כדי שאוויר יוכל להיכנס לביצית מעל העובר. השתמש במספריים כדי להגדיל את החור בקליפה לעיגול בקוטר של כ -1 ס"מ. מוציאים את חתיכת הקליפה הזו בגודל ביצה מהביצה.
מכסים את החור על הביצה בחתיכת סרט שקוף בגודל של כ -5 ס"מ מרובע. לחץ על הסרט כדי להדביק אותו רק בשפת החור והשאיר את הסרט שנותר חופשי. לאחר מכן ניתן לתפוס את הסרט החופשי כדי לפתוח את הביצית בקלות.
קחו עובר שלב 15 מהאינקובטור והניחו את הביצה על משענת ביצה תחת מיקרוסקופ דו-עיני המכוון להגדלה של פי 3.2 ומעלה. לאחר מכן, הסר את השכבה העליונה של סרט שקוף. בעזרת סכין מיקרו מפלדה, בצע חתך דרך קרום הוויטלין והניח לרוחב מזודרם בסמוך לסומיטים 26-32 בצד ימין של העובר.
הרם את המחסום עם מיקרו מלקחיים מספר 5 בקצה אחד וסובב את המחסום כדי להכניס את הקצה החופשי לתוך החתך. בהקדם האפשרי, אטמו את הביצה בעזרת סרט שקוף והחזירו אותה לחממה. אם יש להכניס חרוז בשילוב עם מחסום, ראשית, הכינו חרוזים ספוגים בחומצה רטינואית כמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.
לאחר מכן, קח את החרוז וזוג מיקרו מלקחיים מספר 5 והכנס אותו לפנים החתוכות של המזודרם הצדדי בצד הדיסטלי של החתך. לאחר מכן, הכנס את המחסום לתוך החתך הפרוקסימלי לחרוז. אוטמים את הביצה ומחזירים אותה מיד לחממה.
אם יש להכניס חרוז או חרוזים ללא מחסום, אל תבצע את החתך הארוך. במקום זאת, בצע חתך קטן דרך קרום הוויטלין ולתוך המזודרם של הצלחת הצדדית במיקום שבו יש למקם את החרוז. לאחר מכן, קח את החרוז ומלקחיים מיקרו מספר 5 והכנס אותו לחור במזודרם הצלחת הרוחבית.
דחף אותו עוד קצת עם הקצוות הסגורים של המלקחיים. קח עובר שלב 10 עם חלון מהאינקובטור והנח את הביצה על משענת ביצה תחת מיקרוסקופ דו-עיני המוגדר להגדלה של פי 3.2 ומעלה אם אתה מעדיף. לאחר מכן, בעזרת סכין מיקרו מפלדה, בצע חתך דרך קרום הוויטלין והמזודרם של הצלחת הרוחבית, לרוחב הפס הפרימיטיבי בקצה הזנב של העובר בקו אחד עם הסומיטים, באורך של כשישה אורכי סומיטים.
לאחר מכן, הרם את המחסום עם זוג מלקחיים מיקרו מספר 5, בקצה בולט מצלחת הפטרי וסובב את היד כדי להכניס את הקצה החופשי של המחסום לתוך החתך. בהקדם האפשרי, אטמו את הביצה בעזרת סרט שקוף והחזירו אותה לחממה. אם יש להחדיר חרוז ללא מחסום, בצע חתך קטן דרך קרום הוויטלין ולתוך המזודרם של הצלחת הצדדית במיקום שבו יש למקם את החרוז.
לאחר מכן, קח את החרוז וזוג מיקרו מלקחיים מספר 5 והכניס אותו לחור במזודרם הצלחת הרוחבית. לבסוף, דחפו אותו פנימה עוד קצת עם הקצוות הסגורים של המלקחיים. מוצג כאן מיקום המחסום ברמת הרגל המשוערת של סומיטים 26-32 בעובר שלב 15.
מחסום זה מוביל לכך שביטוי Fhf10 ו-Fhf8 נעדר באזור ניצני הרגליים בצד המנותח וקיים בצד שמאל שאינו מנותח. עם זאת, ביטוי Tbx4 נצפה הן בשלב 19 והן בשלב 23 בצד המנותח. זה מרמז שביטוי Tbx4 לבדו אינו מספיק כדי ליזום צמיחה של הגפה האחורית מה-lpm.
כאשר חרוזים ספוגים בחומצה רטינואית ממוקמים רחוק למחסום בשלב 15, Tbx4, Fgf10 ו-Fgf8 מתבטאים כולם בצד המופעל מכיוון שהם בצד הבקרה השמאלי. לפיכך, בהתפתחות תקינה, חומצה רטינואית מהסומיטים חיונית לפני שניתן להתחיל צמיחת ניצני גפיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במחסומים אטומים ובחרוזים ספוגים מועמדים כדי לחקור כיצד אותות אינדוקטיביים מווסתים את התחלת ניצני הגפיים בעובר הגוזל.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר התערבות כירורגית לחקר מנגנוני אינדוקציה של גפיים בעובר תרנגולת על ידי חסימת דיפוזיה של מולקולות איתות. השימוש במחסומים בלתי חדירים ואיתותים אינדוקטיביים דרך חרוזים מפורט, יחד עם ניתוח ביטוי גנים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- עובריוּת
- העברת אותות
רקע
- הבנת היווצרות הגפיים היא מכרעת בביולוגיה התפתחותית.
- עוברי תרנגולת נגישים למניפולציה כירורגית.
- איתותים אינדוקטיביים ממלאים תפקיד מרכזי בהתחלת ניצן הגפיים.
- ניתוח ביטוי גנים עוזר להבהיר תהליכי התפתחות.
מטרת המחקר
- לחקור את תפקיד מולקולות האיתות בהשראת גפיים.
- להעריך את ההשפעות של מחסומים על ביטוי גנים בעובר תרנגולת.
- לזהות את האיתותים האינדוקטיביים הנחוצים להיווצרות ניצן הגפיים.
שיטות ששימשו
- הכנת מחסומי נייר אלומיניום להתערבות כירורגית.
- הכנסת חרוזים ספוגים בחומצה רטינואית לחקר ביטוי גנים.
- חתכים שנעשו בקרום הז'יטלין ובמזודרם הלוע הצדדי.
- ניתוח ביטוי גנים של Tbx4, Fgf10, ו-Fgf8 בעובר שעברו ניתוח.
תוצאות עיקריות
- המחסומים מונעים את הביטוי של Fgf10 ו-Fgf8 בניצן הגפיים שעברו ניתוח.
- ביטוי Tbx4 קיים בשני הצדדים שעברו ניתוח ולא עברו ניתוח.
- חומצה רטינואית חיונית להתחלת צמיחת ניצן הגפיים.
- השיטה מאפשרת מחקרים מבוקרים של התפתחות הגפיים.
מסקנות
- הטכניקה הכירורגית מבודדת ביעילות נתיבי איתות בהשראת גפיים.
- תוצאות ביטוי הגנים מדגישות את חשיבותה של חומצה רטינואית.
- גישה זו מספקת תובנות לגבי מנגנונים התפתחותיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Dissecting inductive signaling in vertebrate development is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The impermeable barrier and candidate factor bead approach in chick embryos enables precise isolation of signaling pathways, supporting predictive confidence in pathway assignment. This method informs portfolio decisions by clarifying the causal role of candidate signals in tissue induction and organogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of candidate signaling pathways in a manipulable vertebrate model.
- Supports functional validation of pathway involvement in tissue induction and organogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating the effects of specific factors such as retinoic acid.
- Provides internal controls via contralateral unoperated tissue for robust comparative analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream gene expression analysis.
- Enables reproducible manipulation of signaling environments for quantitative readouts.
- Supports assay standardization by controlling for spatial and temporal delivery of candidate factors.
- Prepares the system for reliable evaluation of pathway modulators or inhibitors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental pathway interrogation with disease-relevant tissue induction models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of signaling targets.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying pathway necessity and sufficiency in organogenesis.
- Supports translational biomarker identification through gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the early discovery and target validation stage, bridging hypothesis testing and preclinical model development for tissue induction pathways.
- Discovery Biology: Isolates and tests the necessity of candidate signals in tissue induction, supporting pathway clarification.
- Screening: Provides a reproducible system for quantitative gene expression analysis following pathway manipulation.
- Analytics: Enables direct measurement of gene expression changes (e.g., Tbx4, Fgf10, Fgf8) in response to pathway perturbation.
- Translational Research: Connects developmental pathway findings to organogenesis and potential disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for interrogating diverse inductive cues across multiple tissues and developmental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathway assignment and target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable manipulation of signaling environments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic requirements for tissue induction.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of signaling targets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological microsurgery and gene expression analysis.
- Needs access to stereomicroscopy, microdissection tools, and in situ hybridization infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for barrier placement and bead delivery.
- Adaptable to other accessible embryonic tissues and developmental stages.
- Limited to systems where spatial separation of tissues is feasible and gene expression can be robustly measured.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Create Barriers from Aluminum Foil
2:08
'Window' the Incubated Chicken Eggs
3:35
Barrier to Prevent Leg Bud Initiation and Bead Operations at Stage 15
5:20
Barrier to Prevent Leg Bud Induction and Initiation at Stage 10
6:34
Results: Retinoic Acid from the Somites Is Essential for Limb Bud Outgrowth
7:36
Conclusion
