Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום

המטרה הכוללת של בדיקה זו, המבוססת על מעקב תאים פלואורסצנטי, היא לנטר ולאפיין אוכלוסיות תאים ספציפיות בעלות עניין בעת נדידתן מהעור אל קשרי הלימפה המנקזים לאחר זיהום של כרית כף הרגל ב-Bacille Calmette-Guerin, או BCG. השתמשנו בטכניקה זו כדי לזהות את אוכלוסיית התאים הדנדריטיים הנודדים לקשרי הלימפה המנקזים לאחר זיהום של העור ב-BCG. טכניקה זו אפשרה לחקור את נדידת התאים באמצעות הזרקת הגידולים במהלך חלון זמן מוגדר של 24 שעות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי ההזרקה לכרית כף הרגל והבידוד של קשרי הלימפה קשים ללימוד מטקסט. עבור הזרקת microbacterium Bovus BCG, לאחר אישור רמת הסדציה המתאימה באמצעות צביטה בבוהן, השתמש במזרק המצויד במחט 29-gauge באורך 1/2 inch כדי להחדיר לכרית כף הרגל האחורית של עכבר בן שמונה עד 12 שבועות 1×10⁶ colony-forming units של החיידקים ב-30 µL של PBS. מזריקו לכרית כף הרגל של קבוצות הביקורת PBS בלבד.

לאחר מכן, יש להשגיח על בעלי החיים עד שיהיו שוכבים לחלוטין ומסוגלים להעמיס משקל על כרית כף הרגל שזורקה. עבור הזרקת CFSE, בנקודת הזמן המתאימה לאחר הזרקת BCG, יש לדלל מבחנה של CFSE בריכוז five millimolar בטמפרטורת החדר פי עשרה ב-PBS, תוך הקפדה על סספנסיה מלאה של התמיסה. לאחר מכן, יש למלא את המזרק ב-CFSE המדולל ולהזריק 20 microliters לאותה כרית כף רגל אחורית שקיבלה את ההזרקה הראשונה.

24 שעות לאחר הזרקת CFSE, בצעו בזהירות חתך אנכי בירך האחורית, והסירו את שומן השריר. לאחר מכן, השתמשו במספריים ובפינצטה כדי לחשוף ולהוציא את קשרי הלימפה הפופליטאיים (Popliteal Lymph Node), הממוקמים עמוק בתוך כיס השומן בגומחת הברך. העבירו את קשרי הלימפה ל-0.5 milliliters של PBS סטרילי על קרח, והומוגניזו את קשרי הלימפה דרך מסננת תאים של 70 micron בתוך באער אחת של פלטת שש באערים המכילה five milliliters של PBS, באמצעות החלק האחורי של מזרק של three milliliters.

שטפו את המסננת עם 5 milliliters נוספים של בופר, והעבירו את תמיסת התאים למבחנה של 15 milliliter. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה ושחזרו את המשקע בנפח מספיק של בופר. כדי לסמן את התאים עבור ציטומטריית זרימה, אני אעביר 10⁶ עד 10⁷ תאים למבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה בנפח 5 milliliter ואשטוף את התאים בבופר FACS טרי.

יש להחזיר את המשקעים לתליה ב-50 עד 100 µL של תערובת הנוגדנים המתאימה, המכילה anti-mouse CD16 CD32 לחסימת אינטראקציות לא ספציפיות המתווכות על ידי FC, בבאפר FACS על קרח, תוך הגנה מאור. לאחר 30 עד 45 דקות, יש לשטוף את התאים בבאפר FACS ולהחזיר את המשקעים לתליה ב-50 עד 100 µL של באפר FACS טרי. מרבית סימוני ה-CFSE בבלוטת הלימפה הפופליטיאלית נצפים בתאים עם ביטוי גבוה של MHC-II וביטוי נמוך חיובי של CD11c, דבר העולה בקנה אחד עם תאי דנדריטיים של העור הנודדים לבלוטות לימפה המנקזות את העור.

הן התדירות והן המספר הכולל של תאים מסומנים אלו מופיעים במספרים מוגברים בקשרי לימפה פופליטאיים (popliteal lymph nodes) מעכברים שהודבקו ב-BCG, בהשוואה לבקרה שהוזרקה ב-PBS, מה שמרמז כי BCG מגביר את הניוד של תאים אלו לקשרי הלימפה המנקזים. תאי דנדריטיים של העור ממשיכים להיכנס למערכת הלימפה המנקזת עד חמישה ימים לאחר ההדבקה, ובכך מאריכים את נדידת התאים הדנדריטיים במודל הנוכחי הרבה מעבר לציר הזמן של ההפעלה הראשונית של תאי T חיוביים ל-CD4 ספציפיים לאנטיגן בקשרי הלימפה הפופליטאיים. יתרה מכך, תאים דנדריטיים נודדים של העור מבטאים רמות מוגברות של מולקולות קו-סטימולטוריות (co-stimulatory molecules), דבר התומך בתפיסה שמרבית התאים הדנדריטיים הנודדים הללו הם תאים מופעלים.

חשוב לציין כי הן תאים דנדריטיים מסוג mono-cytoid והן תאים דנדריטיים מסוג plasma-cytoid העמידים בקשרי לימפה, אשר נכנסים לקשרי לימפה דלקתיים דרך ורידי endothelial venules גבוהים, ולא דרך צינורות לימפה אפרנטים, הם שליליים ל-CFSE, מה שמאמת עוד יותר כי סימון ה-CFSE מתרחש בעיקר בכרית כף הרגל. יתרה מכך, ניתוח פלוו-ציטומטרי נוסף מגלה כי תת-אוכלוסייה של תאים עם ביטוי נמוך של EpCAM וביטוי גבוה של CD11b היא תת-האוכלוסייה העיקרית של תאים דנדריטיים נודדים מהעור המנקזים לקשר הלימפה הפופליטאי בתגובה לזיהום ב-BCG. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצעה תוך חמש דקות אם היא מבוצעת כראוי.

במהלך ביצוע תהליך זה, חשוב להקפיד על אתר ההזרקה ועל נפח ההזרקה; יש לנקוט משנה זהירות כדי לא לפגוע בבלוטת הלימפה המנקזת במהלך הניתוח. לאחר הפרוצדורה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלית, לצורך ניתוח מעמיק יותר של ביטוי מיקרו-תאי ספציפי לתת-אוכלוסיות. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים לעקוב אחר תאים מהעור אל בלוטת הלימפה המנקזת, בטווח של 24 שעות, בתגובה לזיהום או לחיסון.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ביצוע הזרקות לכרית כף הרגל, וכן באופן איתור ובידוד קשרי הלימפה המנקזים לצורך מעקב ואפיון של אוכלוסיות תאי דנדריטיים נדדים הרלוונטיים למחקר.