Name: התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למדו את שיטת ההתמר-השתלה ליצירת מודלי עכבר המביעים גנים מסוימים בתאי דם. טכניקה זו מאפשרת חקר מחלות מיאלופרוליפרטיביות והמטופואזה תקינה במהירות וביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי V Foundation Scholar (AGF) וקרן המחקר MPN (AGF).

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaley%2C+GQ+%22Science%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science(New York, N.Y.)</a>. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li>
<li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li>
<li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18(2006).</li>
<li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li>
<li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+C+%22Calreticulin+mutants+in+mice+induce+an+MPL-dependent+thrombocytosis+with+frequent+progression+to+myelofibrosis%22">Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis</a>. , Blood. (2015).</li>
<li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li>
<li>Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAraki%2C+M+%22Blood%22">Blood</a>. , (2016).</li>
<li>Limón, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li>
<li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio.+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li>
<li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms%3A+JAK+of+all+grades%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li>
<li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloproliferative+neoplasm+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.+Oncol.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li>
<li>Scil animal care company GmbH. , Source: 
 <a target="_blank" href="http://www.scilvet.us/company-downloads">http://www.scilvet.us/company-downloads</a> (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך לבצע השתלות מח עצם בעכברים לשחזר מחל thrombocythemia דמוי חיונית עם התקדמות מיילופיברוזיס ראשונית עם מוטצית CALRdel52 כנהג מחלה. השתלה מוצלחת של תאי המבטאים תוצאות CALRdel52 במספר טסיות דם מוגברים, הרחבת megakaryocytes, סיסטיק מח עצם. השתלת מח עצם היא תהליך רב שלבי, חשוב להכיר שלבים שבהם ניתן להימנע טעות טכנית למנוע engraftment עניים של תאים המבטאים את הגן של עניין או אפילו מוות העכבר. <p class="jove_content" style=";text-align:right;directi...

התמר-השתלה היא שיטה שימושית מודל ממאירויות המטולוגיות בעכברים. טכניקה זו כבר יקר במיוחד ללימוד ממאירויות מיאלואידית שראשיתה ההפגנה הראשונה כי ביטוי אקטופי של BCR-ABL1 יכול בנאמנות לשחזר לוקמיה מיאלואידית כרונית בעכברים 1. טכניקה זו לאחר מכן יש להקל את המחקר המקיף של JAK2 V617F ו MPL W515K / L מוטצית מחלה מיילופרוליפרטיבית (MPN). MPN הוא קבוצה של ממאירויות המטולוגיות המאופיינת היתר של תאים מיאלואידית בוגרים סיסטיק מח עצם. מחלות אלה נובעים בדרך כלל מהרחבת המשובטים של תא גזע hematopoietic כי רכשה מוטציה סומטיים או Jak2, MPL, או CALR. התמרה-השתלת JAK2 V617F ו MPL W515K / מודלים L התערוכה המאפיינים הקליניים של פוליציטמיה ו מיילופיברוזיס ראשונית 2 - 5 &lt;/ Sup&gt;. לאחרונה, במודל של עכברים של MPN calreticulin-מוטציה גם נוצר עם שיטת התמרה-השתלת 6. עכברים אלו לפתח מחלת thrombocythemia דמוי חיוני עם טסיות מוגבר, מספר גדל של megakaryocytes, סיסטיק מח עצם. יחד, המודלים האלה לא רק ספקו את ההזדמנות כדי לקבל תובנה בפתוגנזה המולקולרית של MPN, אלא גם את היכולת לפתח וללמוד רפויים באווירה טרום קלינית. כתב יד זה מספק תיאור מפורט של המתודולוגיה התמר השתלה עם דגש על מוטצית CALRdel52. טכניקה זו כרוכה השתלה של תאים במח עצם transduced retrovirally להביע המוטציה לבנות לעכברי נמען syngeneic מוקרנים.

<table><tbody><tr><td><קווי תאים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>קורנינג</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T תאי</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>3T3 תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td><חזק>פלסמידים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, הידוע גם בשם pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>ניתן להשתמש בקווי תאי אריזה רטרו-ויראליים, כגון EcoPack 2-293, במקום הפלסמיד EcoPak ותאי 293T סטנדרטיים. פלסמידים נוספים של מעטפת &gamma;-רטרו-וירוס ואריזה זמינים מ-Addgene ואחרים.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>פלסמידים נוספים של העברה רטרו-ויראלית &גמא;-זמינים מ-Addgene ואחרים.</td></tr><tr><td><חזק>חומרים מתכלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 גרם x 1/2 אינץ' מחטים</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>קורנינג</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%)</td><td>קורנינג</td><td>MT-25-052-CI</td><td>יכול להיות PBS תוצרת בית</td></tr><tr><td></td><td>קורנינג</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ כלים</td><td>פישר</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ פישר</td><td></td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>פוליברין</td><td>פישר</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>פישר</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181; מסננות תאים m</td><td>פישר</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>פישר</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>פישר</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS</td><td>פישר</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; מסנני מזרק m</td><td>פישר</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>יכול להיות תוצרת בית</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רנטגן</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

השתלת טרנסדוקציה היא דרך מהירה ויעילה לדגמן ממאירויות המטולוגיות אנושיות בעכברים. טכניקה זו מביאה לביטוי של הגן המעניין בתאים המטופויאטיים וניתן להשתמש בה כדי לחקור את תפקיד הגן בהמטופואיזיס נורמלי ו/או ממאיר. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט כיצד לבצע השתלת טרנסדוקציה באמצעות מוטציות קלרטיקולין (CALR) שזוהו לאחרונה בניאופלזמה מיאלופרוליפרטיבית (MPN) כדוגמה. בפרוטוקול זה, תאי מח עצם שלמים מעכברים תורמים שטופלו ב-5-flurouracil (5-FU) מועברים עם רטרו-וירוס המקודד CALR מוטנטי ומושתלים במארחים סינגניים מוקרנים קטלניים. תאי תורם המבטאים CALR מוטנטי מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). עכברים מושתלים מפתחים פנוטיפ MPN הכולל טסיות גבוהות בדם ההיקפי, התרחבות של מגקריוציטים במח העצם ופיברוזיס במח העצם. אנו מספקים תיאור שלב אחר שלב כיצד ליצור רטרו-וירוס, לחשב טיטר נגיפי, להמיר תאי מח עצם שלמים ולהשתיל בעכברים מושתלים מוקרנים.

הטכניקה התמר-השתלת תוצאת הכינון מחדש hematopoietic של עכברי הנמען עם תאים המבטאים את הגן של עניין. איור 1 מציג סקירה של מודל העכבר התמר-השתלת calreticulin מוטצית MPN. בקצרה, רטרו-וירוס להביע CALRwt או CALRdel52 משמש להדביק תאים BM מתוך עכבר התורם C57B / 6. תאי transduced מושתלים לתוך engraftment עכבר התא תורם למקבל C57B / 6 מוקרן מתרחש במשך החודש שלאחר ההשתלה הראשונה. עדות פנוטיפ המחלה הופכת 3 לכאורה חודשים לאחר ההשתלה שבו נמצאת תצ...

כתב יד זה מספק תיאור של המתודולוגיה המשמשת להקמת מודלים של עכברי התמרה-השתלה. ניתן תיאור מפורט של טעויות טכניות שיש להימנע מהן בעת ביצוע השתלות מח עצם. יש להשיג הבנה ברורה של החשיבות של טיטר ויראלי גבוה, טרנספקציה/התמרה והקרנה.

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק עכברים המבטאים את הגן המדובר בתאים המטופויים באמצעות שיטת התעתוק-השתלה (transduction-transplantation). בפרק זמן קצר, שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלה האם הגן המדובר גורם לממאירות המטולוגית. המשמעויות של טכניקה זו חולות על טיפול או אבחון של ממאירות המטולוגיות, וזאת בשל הפיתוח המהיר של מודלי עכברים המאפשרים לבחון תרופיהות פוטנציאליות.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ממאירות המטולוגית, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור את תפקידו של גן מסוים בהמטופוייזה תקינה. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בניסוי זה עשויים להתקשות, שכן הוא דורש מספר שלבים. כמו כן, יצירת נגיף בטר (titer) גבוה היא קריטית להצלחת ניסוי זה.הדגמה חזותית של פרוצדורה זו היא חשובה, מאחר שעבודה עם עכברים עלולה להיות קשה ודורשת תרגול. לאחר הרדמת העכבר, ובדיקת עומק ההרדמה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו את העכבר על צדו, ובאמצעות האגודל והאצבע, קבעו את החיה כך שהעין תבלוט מעט מהראש. להזרקת 150 milligrams per kilogram של 5-flurouracil, או 5-FU, באמצעות הזרקה רטרו-אורביטלית, הכניסו מחט במידה 27-gauge ובאורך half-inch בזווית של 45 מעלות כאשר הפיה פונה כלפי מעלה ובכיוון מדיאלי, ועצרו כאשר המחט מוחדרת עד מחציתה.הזריקו את התמיסה באיטיות, ולאחר מכן הוציאו את המחט בזהירות. בדקו את העכבר לאיתור סימני פגיעה, כגון נפיחות או דימום, וודאו שהעכבר התאושש והחל ללכת. חמישה ימים לאחר מכן, לאחר הקרבת בעל החיים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-70% ethanol כדי לעקר את העכבר על ידי ריסוס נדיב עד שהפרווה תהיה רטובה.בעזרת מספרי ניתוח, בצעו חתך בעור והפרידו את הפסציה (facia) משרירי הרגליים. לאחר מכן, הפרידו את הרגל מהעכבר על ידי חיתוך ה-femur במפרק הירך וה-tibia בקרסול. כופפו את הרגל לצורת L והשתמשו במספרי ניתוח כדי להפריד בין עצמות הרגל על ידי חיתוך במפרק הברך.לאחר מכן, גרדו בעדינות את השריר לכיוון קצה אחד של עצם הרגל עד שהסחוס ישתחרר. בשלב הבא, בעזרת מזרק עם מחט במידה 27-gauge ואורך חצי אינץ', ובשימוש ב-PBS המועשר ב-2%FBS, שטפו כל עצם רגל מעל ממבנה ניילון של 100 micrometer אל תוך מבחנה קונית של 50 milliliter, עד שהעצם תהפוך ללבנה, כדי למקסם את מספר התאים הנאספים. בעזרת בוכנת המזרק, מעכו את התאים דרך ממבנה הניילון אל תוך המבחנה הקונית של 50 milliliter כדי לקבל סספנסיה של תאים בודדים.חזור על הפעולה עם רגל העכבר השנייה. סבב במערך צנטריפוגה את התאים שנאספו ב-400 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות, והשמד את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, הוסף 5 mL של ammonium chloride potassium, או ACK, כדי לסבב מחדש את מחית העצם.דגרו את תרחיף התאים על קרח למשך 10 דקות כדי לבלע את כדוריות הדם האדומות. כדי להפסיק את הבלוע, מלאו את המבחנה ב-PBS. לאחר מכן, סובבו את התאים שוב בצנטריפוגה והשליכו את העלייה.שחזר את התאים באמצעות חמישה מיליליטר של PBS, ובדוק את מספר התאים באמצעות המוסיטומטר (hemocytometer) בשיטת הדחייה של Trypan blue. כעת, הוסף 2x pre-stem cocktail כדי לשחזר את התאים בריכוז של פעמיים 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבר שני מיליליטר לבארי של פלטות בעלות שישה באריים.דגרו את התאים ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למשך לילה. לאחר הדגירה, הוסיפו שתי מיליליטר של על-נוזל ויראלי לכל באר, ולאחריהם eight micrograms per milliliter של polybrene. סובבו את הפלטות ב-1500 ×g ב-30 °C למשך 90 דקות.לאחר מכן, החזירו את הפלטות לאינקובטור למשך הלילה. העבירו בעזרת פפית את תרחיף התאים למבחנות קוניות, וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 400 ×g בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השתמשו ב-2x pre-stem cocktail לכל באר כדי לערבב מחדש את התאים, והחזירו אותם לבארי המקור.לאחר הכנת העכברים המקבלים להשתלה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, קצרו את תאי התורם שעברו טרנסדוקציה מהפלטות בעלות ששת הבארים על ידי העברה עדינה של הנוזל העליון למבחנות קוניות באמצעות פיפטה. השתמשו ב-1 mL של PBS לשטיפת כל באר, ואספו את התאים שנותרו למבחנות. הוסיפו 0.5 mL של 0.05% trypsin לבארים, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות.בשלב הבא, הוסיפו מיליליטר אחד של D-10 לבארי, ושחררו תאים שנותרו באמצעות פיפוט עדין. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנות המתאימות והשקיעו ב-400 ×g בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שטפו שוב את התאים באמצעות PBS.לאחר מכן, לאחר הסבב בצנטריפוגה, השתמשו ב-5 mL של PBS כדי לתלות מחדש את התאים, וספרו אותם באמצעות שיטת הדחת Trypan blue והמוצימטר. להזרקה לעכברים, תלו מחדש 5 × 10⁵ עד 2 × 10⁶ תאים ב-50 עד 100 µL של PBS. הניחו את העכבר על צדו, וקבעו אותו באמצעות האגודל והאצבע, כך שהעין תבלוט מעט מהראש.החדירו את המחט בצורה צדית לזווית המדיאלית של העין (medial canthus) בזווית של 45 מעלות, כאשר הפיה (bevel) פונה כלפי מעלה, והזריקו. לאחר ההזרקה, בדקו את העכבר לאיתור סימני פגיעה, כגון נפיחות או דימום, באתר ההזרקה, ועיינו בפרוטוקול הכתוב להנחיות נוספות לטיפול לאחר ההזרקה. לבסוף, נתחו את ביטוי ה-GFP בדם, בהתאם לפרוטוקול הכתוב.איור זה ממחיש כיצד לחשב תיתור ויראלי יחסי, כאשר אחוז ה-GFP מחושב מאירועים שנאספו משער התאים החיים (live cell gate). מוצג כאן תיתור שבו יש יותר מחלקיק ויראלי אחד לתא, ודגימות אלו מייצגות תיתורים עם חלקיקים ויראליים בודדים לתא. באופן אידיאלי, לפחות 50% מהתאים החיוביים ל-GFP יזוהו בדילול של 1:30 של העלון הויראלי.בניסוי זה מוצג מקבל השתלה מוצלח, שבו עכברי CALRdel52 מראים פנוטיפ של MPN המתאפיין ברמות גבוהות של טסיות, עלייה בכמות המגקריוציטים במחול השחורה ופיברוזיס של מחול השחורה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה ימים, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעקוב אחר כל שלב בפרוטוקול.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים לבחון את ההשפעות של גנים ספציפיים על המטופואזה (hematopoiesis). לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק עכברים המבטאים את הגן המבוקש בתאי המטופואזה.

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים את השראת מחלת השתל נגד המאכסן של המעי, GvHD, בעכבר מושתל המוקרן באופן קטלני באמצעות תאי גזע המטופויטיים אלוגניים ולימפוציטים מסוג T אלוריאקטיביים מעוררי GvHD. פרוטוקול זה מסייע לבסס מודל GvHD חמור במעי כדי להבין את מנגנון המחלה ולפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות.

השראת מחלת השתל לעומת המאכסן במודלים של עכברים באמצעות השתלת מח עצם אלוגנית והשתלת תאים טחול

אנו מציגים פרוטוקול מהיר וגמיש למערכת ביטוי רטרו-ויראלית מבוססת קולטן תאי T יחיד (TCR).  וקטורים רטרו-ויראלים משמשים להתמרת תאי אב של מח עצם כדי לחקור את התפתחות תאי T ותפקודם של TCR יחיד in vivo כחלופה לעכברים טרנסגניים TCR.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

כאן נשתמש זוהרים, רנטגן, והדמיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/שחושב טומוגרפיה ללמוד איך מעכבים פעילות mTOR משפיעה על engrafted-מח עצם מיאלומה גידולים במודל xenograft. דבר זה מאפשר ניתוחים פיזיולוגית הרלוונטיים, לא פולשנית, והן עם מודאלים מרובים של מיאלומה נגד ההשפעה של טיפולים מיקוד engrafted מח עצם מיאלומה גידולים ויוו.

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

אנו מתארים את השימוש השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) כדי להעריך את פוטנציאל ממאיר של תאים מהונדסים גנטית hematopoietic. HSCT שימושית לצורך הערכת שונים תאים ממאירים hematopoietic ויוו , כמו גם יצירת קבוצה גדולה של עכברים עם תסמונות myelodysplastic (MDS) או לוקמיה להעריך טיפולים חדשניים.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

אנו מתארים את ההשתלה התוך-פרנכימלית של תאי אב עצביים אנושיים שעברו התמרות עם וקטור מדווח כפול המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק-לוציפראז (GFP) במוח העכבר. לאחר ההשתלה, אות הלוציפראז נמדד שוב ושוב באמצעות תאים מושתלים in vivo bioluminescence ותאים מושתלים המבטאים GFP שזוהו בחתכי מוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השתלה תוך-מוחית ומעקב ביולומינסנציה In Vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תימוציטים שליליים כפולים מתימוס העכבר ולאחר מכן התמרה רטרו-ויראלית ותרבית משותפת על מערכת תרבית משותפת של קו תאי סטרומה דמוי מח עצם דמוי דלתא (OP9-DL4) לניתוח פונקציונלי נוסף.

תרבית משותפת והתמרה של תימוציטים מורינים על תאי סטרומה דמויי דלתא המבטאים 4 כדי לחקור אונקוגנים בלוקמיה של תאי T

כאן, הזרקה תוך פריטוניאלית של תאי לוקמיה מנוצלת כדי לבסס ולהפיץ לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) בעכברים. שיטה חדשה זו יעילה בהשתלה סדרתית של תאי AML ויכולה לשמש חלופה למי שעלול לחוות קשיים וחוסר עקביות עם הזרקה תוך ורידית בעכברים.

השתלה תוך צפקית ליצירת לוקמיה מיאלואידית חריפה בעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פיתוח של מודל עכברי הניתן לשחזור של גליומה של חוט השדרה על ידי הזרקת תאי גידול לחלל הבין חולייתי, ומציע גישה יעילה יותר ופחות פולשנית למחקר ופיתוח טיפולי.

השתלה כירורגית של תאי גידול בחוט השדרה של עכברים

הפרוטוקול נועד לתאר מודל עכברי ליצירת הישנות של לוקמיה לימפובלסטית חריפה, בהתבסס על הדינמיקה של התגובה לכימותרפיה אינדוקציה.

מודל עכברי של הישנות לוקמיה לכימותרפיה אינדוקציה ללוקמיה לימפובלסטית חריפה

למדו את שיטת ההתמר-השתלה ליצירת מודלי עכבר המביעים גנים מסוימים בתאי דם. טכניקה זו מאפשרת חקר מחלות מיאלופרוליפרטיביות והמטופואזה תקינה במהירות וביעילות.

התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

גלה סרטונים נוספים