התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת Nematostella vectensis

המטרה הכוללת של הליך זה היא להמחיש את הסדרה הצפויה של שינויים מורפולוגיים שהתרחשו במהלך התחדשות של פוליפ שלם מקטע זעיר של רקמה שהוסר מהקצה האוראלי של nematostella vectensis שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התחדשות, כגון כיצד תאים באתר הפצע מתארגנים מחדש ונפרסים כדי ליצור מחדש את המבנים החסרים. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה מכיוון שרציתי לראות כיצד פוליפ מורכב יחסית יכול להרכיב את עצמו מחדש החל מכמות המידע המורפולוגית הנמוכה ביותר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהתקדמות השלב לאחר הפציעה הראשונית מוסתרת לפעמים על ידי קרום רירי.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו להשיג הפרדה מלאה של הרקמה במקום הפצע, בגלל האופי הרך, הדביק והג'לטיני של הפוליפ. התחל הליך זה עם התניה של nematostella vectensis כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חשוב במיוחד כאשר משתמשים בטכניקה זו שבעלי החיים שנבחרו יהיו באותו גודל, ויש להם את אותה היסטוריה תרבותית, כגון האכלה זהה ופרמטרים אחרים של מצב.

הוציאו את המנה של בעלי חיים נבחרים מהחממה לאור החדר לפחות שעה לפני הקטיעה. השתמש בפיפטה מפלסטיק רחב קדח כדי להעביר את חמשת בעלי החיים מהבריכה לכריתת צלחת חיתוך זכוכית סטרילית בקוטר 100 מילימטר המכילה מי ים מלאכותיים במליחות של 12 חלקים לאלף. הנח את המנה על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו עם הגדלה משתנה בין פי 10 ל-40x.

בחר פוליפים תואמים בגודל בערך באותו אורך והניח אותם בקערה המופרדת מהמושבה למשך שלושה ימים לפני הקטיעה. בעזרת אזמל סטרילי, כרתו את הפיזיה האבורלית מכל פוליפ כדי לקבל קטע של הפיזה שאורכו בערך כמו שהוא רחב ואינו מכיל מזנטריה. כדי להשיג זאת, הנח את להב האזמל במגע עם החיה באתר הקטיעה הרצוי.

עשו זאת ללא סיוע או על ידי אחיזה עדינה בגוף החיה עם מלקחיים מספר חמש. חותכים את הרקמה על ידי מינוף הלהב המעוקל של האזמל בתנועת נדנוד על פני הגוף. הסר כל פוליפ תורם קטוע מהצלחת והחזיר אותו לקערה נפרדת עם הכיתוב קטועי גפיים.

לאחר תיארוך הקערה, החזירו אותה לתרבות המלאי. שטפו את הפיזה שנכרתה שנותרה בכלי החיתוך במי ים מלאכותיים במליחות של 12 חלקים ל-1,000. לאחר מכן, העבירו כל פיזה לבאר סטרילית נפרדת בצלחת תרבית תאים מרובת בארות שיש בה 10 מיליליטר מי ים מלאכותיים במליחות של 12 חלקים ל-1,000 בכל באר.

חזור על שלבים אלה כדי לאסוף לפחות חמש פיסות בכל באר שישמרו לכל טיפול ניסיוני. הנח את הצלחת המכילה את הפיזה לתוך חממה מווסתת טמפרטורה בטמפרטורה קבועה הנקבעת על ידי קצב ההתחדשות הרצוי. ציין את הפיזיה באמצעות מיקרוסקופ מורכב סטריאו עם הגדלה משתנה.

ציין את ה-nematostella physa הטרי שנחתך כשלב אפס, והמשיך לצבור ניקוד באותה שעה בכל יום לאחר הקטיעה, או DPA, באמצעות ה-NRSS. ציין את הפיסה כשלב אפס אם פיזה שזה עתה נחתכה מופיעה כמסה בצורת הדומה לבלון רפוי עם אתר פצע פתוח שסביר להניח שנראה לעין. ציין פיזיה כשלב ראשון אם פצע הקטיעה נראה סגור.

ציון פיזיה כשלב שני אם פני השטח של עמוד השמיעה נראים מנופחים, וחושפים שמונה קשתות מוגבהות המסודרות בתבנית סימטרית רדיאלית ומופרדות על ידי חריצים. בשלב השני, התבונן בכתמים חצי כדוריים קטנים בקודקוד הקשתות שגובהם כרוחב של כנראה חולפים, ומורכבים ראשונית משכבת תאים אקטודרמלית אחת. ככל שהפיזיה מזדקנת, היא עלולה להיות עטופה ברירית, אותה יש להסיר בזהירות בעזרת מלקחיים.

ציון פיזה כשלב שלישי אם ניצני הזרועות המכילים שכבות רקמה אנדודרמיס ואקטודרמיס נוצרים ביציבות בקצה השמיעה של לפחות כמה קשתות רדיאליות. ציין פיזה כשלב רביעי אם הפיזיה מכילה שמונה מזנטריות נפרדות הנראות לעין המשתרעות בקולנטרון מהחדרות בדופן הגוף עם אורכי אבורה שמיעתיים שהם יותר מפי שניים מרוחבם הרדיאלי הנמדד מהמקום שבו הם נראים כמתחברים ללוע בקצה האבורלי שלו, או לאנטרוסטום. לבסוף, ציין פיזיה כשלב חמישי אם לפיזיה יש יותר מארבעה מזנטריות עם קפלים, והקפלים מלאים ומתפתלים יותר מאשר בשלב ארבע.

בשלב החמישי, לחיה יש מראה בוגר כמעט רגיל, אך אין תאי בלוטת המין הנראים לעין. קבוצה זו של ביקורת nematostella physa שטופלה ב-0.1 אחוז DMSO התחדשה לחלוטין לשלב החמישי. פיזיה שטופלה בכלורוקווין, לעומת זאת, לא הצליחה ליצור לחלוטין מזנטריות שלמות.

תקריב מראה הן את הנוכחות והן את היעדר הקפלים במזנטריות בפיזה שהודגרה בכלורוקווין. גרף זה ממחיש את התוצאות המצטברות של הטיפול בכלורוקווין. כל טיפול בין 10 ל-50 מיקרו-טוחנת גרם לפגמים דומים, בעיקר היעדר רפורמה מלאה של המזנטריות בכך שהמזנטריות חסרות קפלים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה עבור כל צלחת בת שש בארות המכילה 30 פיזה חתוכה. הניקוד מהיר, ואולי דורש חצי שעה עבור כל צלחת משוכפלת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקטוע את הפיזיה כדי לדמיין את השינויים המורפולוגיים המתרחשים במהלך התחדשות של פוליפ שלם מקטע זעיר של רקמה אבורית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת שלבים מורפולוגיים בהם ניתן להצמיד את האירועים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות של פוליפ שלם מכוס רקמה אחידה מבחינה ויזואלית. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתנות מראש את בעלי החיים ביחס להיסטוריה התזונתית, לחתוך לשניים כדי לא לכלול מזנטריה בוגרים, ולתקנן את גודל הפיזיה המתחדשת כדי להפחית את השונות בתוך הטיפולים. בעקבות הליך זה, ניתן להעריך את ההשפעות של מוטציות גנטיות או הפרעות במסלול האיתות עם מולקולות קטנות, למשל.

או ששינויים מורפוגנטיים יכולים להיות בקורלציה עם ניתוח מיקרוסקופי של התפשטות עצמית, מעקב אחר שושלת או ביטוי גנים באתר שני. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של ההתחדשות לחקור את הביולוגיה של התא, מסלולי האיתות והתהליכים המורפוגנטיים העומדים בבסיס יכולת ההתחדשות המדהימה של אורגניזם מודל זה.