Name: Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למדו שיטת מדידה מבוססת פלואורסצנציה לפעילות סקרמבלאז של פוספוליפידים בליפוזומים המכילים אופסין. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני תחבורת ליפידים בין-תאית בביופיזיקה ומדעי המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן Velux (A.K.M.), EY024207 המענקים של ה-NIH (A.K.M.) ופרויקט J3686 של קרן המדע האוסטרית (FWF).

1. הכנה ליפוזומים Proteoliposomes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיבוש liposome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק זכוכית, להוסיף 1,435 μl POPC (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל, כלורופורם) ו -160 μl POPG (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל, כלורופורם) בבקבוק תחתית עגולה להשיג 52.5 μmol שומנים טוחנת יחס של POPC: POPG = 9: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השומנים למשך 30 דקות באמצעות מאייד סיבובי במהירות סיבוב של 145 סל&quot;ד (לא באמבט מים דרוש נפח זה של ממס), ולאחר מכן להעביר את הבקבוק כדי ואקום ייבוש לפחות 3 שעות, או הלילה, בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה הסרט השומנים יבשים עם 10 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ HEPES pH 7.4, 100 מ&quot;מ NaCl (להלן המכונה חיץ) על ידי מתערבל את הבקבוק בעדינות עד תוצאות ההשעיה הומוגנית, עכור; הערה: ריכוז השומנים בשלב זה צפוי להיות 5.25 מ&quot;מ כמו שאף פסדים צריכים התרחשו עד כה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate ההשעיה באמבט מים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תדר of 40 קילוהרץ. הפתרון ייראה קצת יותר ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מכבש, להעביר את ההשעיה 10 פעמים דרך קרום עם גודל נקבובי 400 ננומטר, ואחריו מחזור שני של שחול עם 4 עובר דרך קרום עם גודל נקבובי 200 ננומטר. הערה: הקוטר הממוצע של חביבי המתקבלים הוא ~ 175 ננומטר. במידת הצורך, את הגודל ואת ההומוגניות של חביבי ניתן לבדוק על ידי Dynamic Light פיזור על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ריכוז פוספוליפידים של ההשעיה LUV כמפורט בסעיף 1.2). הערה: בגלל הפסדים במהלך שחול, הריכוז הוא בדרך כלל סביב 3.6 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את חביבי ב 4 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שבועות אם לא נעשה שימוש באופן מיידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות פוספוליפידים הערה: כדי לקבוע את ריכוז פוספוליפידים של ההשעיה LUV המשמש הכינון מחדש, כמו גם זה של proteoliposomes כי הם בסופו של דבר שנוצר, aliquot של המדגם הוא subjected לחמצון על ידי חומצה על-כלורית. הליך זה מתפרק פוספוליפידים לשחרר פוספטים אנאורגניים כי היא לכמת מכן על ידי assay colorimetric בהשוואה לתקני 23. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מניות 40 מ&quot;מ של פוספט נתרן (4 Na 2 HPO) במים מזוקקים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון המניות עם מים מזוקקים deionized להשיג 4 מ&quot;מ ו -0.4 מ&quot;מ עובד פתרונות שישמשו סטנדרטי כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הפתרונות עבודה, להכין סטנדרטים 13 x 100 מ&quot;מ 2 צינורות זכוכית בטווח שבין 0 ל 80 פוספט nmol נתרן בנפח סופי של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl כל אחת מהדגימות LUV ו proteoliposome כדי לכמת לדלל עם 40 μl של DDH 2 O ב 13 x 100 מ&quot;מ 2 צינורות זכוכית. הערה: ככל ריכוז השומנים של חביבי ו proteoliposomes הוא בטווח 2.5-5 מיקרומטר, 10 μl של מדגם אמור להכיל 25-50 nmol זרחן השומנים.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μl perchloric חומצה לכל אחד מן הסטנדרטים דגימות וחום עבור שעה 1 ב 145 ° C בתוך גוש חימום. שים גולה על הצינורות כדי למנוע אידוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו צינורות להתקרר לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1 מ&quot;ל של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl כל אחד מוכן טרי 12 גר &#39;/ ל אמוניום molybdate ו ascorbate נתרן 50 גר&#39; / ל ו מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום במשך 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס עם גולות על גבי הצינורות. הסר את הצינורות מגוש החימום ולתת להם להתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של הדגימות נגד (המדגם סטנדרטי המכיל פוספט נתרן 0 nmol) הריק עם ספקטרומטר באורך גל של 797 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את התוכן פוספט של דגימות נגד עקומת סטנדרט כיול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינון של opsin הערה: יש צורך לקבוע תנאי נפיחות אופטימליים עבור כינון מחדש כמו אלה תלוי אופיו של חומרי הניקוי, כמו גםכמו הרכב השומנים וריכוז של חביבי. כפי חביבים לשנות תכונות פיזור האור שלהם על נפיחות התהליך יכול להיות במעקב על ידי מדידה ספיגה (איור 2) כפי שנסקר על ידי ריגו, לוי 24 ו Geertsma et al. 25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 800 μl של חביבי (מסעיף 1.1; התאוששות שומנים לאחר שהחול היא 70%, הריכוז הצפוי של חביבי הוא 3.6 מ&quot;מ פוספוליפידים) לתוך צינור microfuge 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5.3 μl של חיץ ו 34.7 μl של 10% (w / v) DDM מומס חיץ א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר עם ערבוב הקצה על הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכינים את חרוזי פוליסטירן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 400 מ&quot;ג של חרוזים לדגימה ולשקול אותם בכוס זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותם פעמיים עם מתנול, שלוש פעמים עם מים ופעם עם חיץ א עבור כל שימוש כביסה צעד 5 מ&quot;ל של נוזל ומערבבים לאט במשך 10 דקות. הערה: מומלץ להכין את פוליסטירןחרוזים במשך כמה דגימות בעת ובעונה אחת, למשל, לשקול 6 גרם של חרוזים ולשטוף עם 75 מ&quot;ל של נוזל. חרוזים עודפים ניתן לאחסן במקרר למשך כמה ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך יציבות שלפוחית ​​30 דקות של האחרון לייבש את פוספוליפידים NBD שכותרתו בתוך שפופרת זכוכית בורג מכסה ( &quot;שפופרת זכוכית הכינון מחדש &#39;): מדגם Per, 9.5 μl של NBD-PC (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כלורופורם, מניב 0.4 mol% של פוספוליפידים סה&quot;כ) הם מיובשים תחת זרם של חנקן בתוך שפופרת זכוכית מומס וכפועל יוצא מזה 45 μl של 0.1% (w / v) DDM ב חיץ א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 שעות של יציבות שלפוחית ​​להוסיף פוספוליפידים מומס-NBD שכותרתו, החלבון-solubilized DDM ואת הצפת כך נפח סופי של 1 מ&quot;ל מכיל 0.36% (w / v), כלומר, 7 מ&quot;מ, DDM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכן, כדי ליצור ליפוזומים חלבון ללא (המשמש מאז כמדגם שליטה) להוסיף 45 μl של-PC NBD (מומס 0.1% DDM), 60 μl של DDM 0.1% ו -55 μl של חיץ; עבור proteoliposomes להוסיף, לבחינהple, 40 μl של חלבון (מפתרון המניות אופייני ~ 110 ng / μl) ב DDM 0.1%, 45 μl של-PC NBD (מומס DDM 0.1%), 20 μl של DDM 0.1% ו -55 μl של חיץ . הערה: הסדר של תוספת צריך להיות כפי שרשום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את המדגם עבור קץ hr נוסף על הסוף בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 מ&quot;ג של חרוזי פוליסטירן מוכן דגירה המדגם עם ערבוב הקצה מעל לקצה עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להוסיף 160 מ&quot;ג נוספים של חרוזי פוליסטירן דגירה עם ערבוב הקצה על הקצה במשך שעה 2 נוספת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם (עזיבת חרוזי פוליסטירן בילה מאחורי) לצינור זכוכית בורג מכסה המכיל 160 מ&quot;ג של חרוזי פוליסטירן טרי ומערבבים לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: הדרך הקלה ביותר להעביר את המדגם ולהימנע מתחנפים חרוזים היא להשתמש פיפטה פסטר כי נדחק לתחתית שפופרת הזכוכית עם לחץ חיובי קטן. לאחר קצה פיפטה הוא בתקיפות בביתהחלק התחתון של הצינור, ואז המדגם ניתן למשוך בקלות ללא הפרעה מן החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להעביר את המדגם כדי צינור microfuge ללא ובה למעלה חרוזים ומניחים על קרח כהכנה assay פעילות scramblase. </li></ol></li></ol> 2. Assay פעילות Scramblase הערה: עוצמת הקרינה של ליפוזומים או proteoliposomes מדולל חיץ מנוטרת לאורך זמן על התוספת של dithionite בספקטרומטר קרינה. כדי לקבל עוצמת החל יציבה, הקרינה היא רשמה שני 50 לפחות (או עד אות יציבה מושגת) לפני הוספת dithionite מדגם לנער ללא הפסקה ולאחר מכן הוא במעקב במשך לפחות 500 שניות לאחר הוספת dithionite. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1,950 μl של חיץ א &#39;עד קובט פלסטיק המכיל ומערבבים-מיני בר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של proteo המוכן (ליפוזומים) ולתת המדגם לאזן את spectro הקרינהמטר עם ערבוב מתמיד במשך כמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכינים תמיסה של 1 M dithionite ב 0.5 M unbuffered טריס (למשל, עבור שני מדגמים לשקול את 20 מ&quot;ג של dithionite בתוך שפופרת microfuge ו להתמוסס 114 μl קרים כקרח 0.5 M טריס ישירות לפני השימוש ולשמור על הקרח עבור הבא לִטעוֹם). הערה: פתרון dithionite חייב להיות מוכן טרי ולא צריך לשמש יותר מ 20 דקות לאחר הכנה; אם מדידות רבות הם להיעשות, aliquots של dithionite יכול להישקל החוצה מראש ופיזר ממש לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ניטור הקרינה (עירור 470 ננומטר, פליטת 530 ננומטר, ושיסף ננומטר 0.5 רוחב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של פתרון 1 M dithionite ל- SEC 50 קובט לאחר תחילת הקרינה הקלטה (להשתמש מחצה במכסה של החדר קובט אם אפשר) ולהמשיך להקליט את הקרינה במשך שניות 400-600 נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים כפי שתואר בסעיף 3. </li></ol> 3.ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קינטיקה של ערבול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את עקבות הקרינה של כל מדגם המתקבל על ידי assay פעילות scramblase ידי הגדרת הקרינה הראשונית, F אני, לפני הוספת dithionite, ואת קרינת נקודת סיום, F, הגיע לאחר&gt; 400 שניות. אני F נקבע עבור כל דגימה כערך הממוצע של קרינה לתקופת 30 שניות לפני תוספת של dithionite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את נתוני נקודת הסיום המתאים את היקף הפחתת קרינה, R = 100 • F / F i. אנו משתמשים L R התנאים ליפוזומים חלבון ללא ו- R P עבור proteoliposomes המכיל opsin. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת המשקל המולקולרי של Scramblase מחדש מהבחינה התפקודית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת נתוני הפחתת קרינה על פי המשוואה הבאה: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (מקסימום R - R L) (משוואה 1) הערה: איפה מקסימום R הוא ההפחתה המקסימלי מתקבלת כאשר חלבון מספק מחדש כך שכל השלפוחית ​​במדגם להחזיק לפחות scramblase אחד פונקציונלי, p הוא ההסתברות כי שלפוחית ​​בפרט במדגם מורחב &#39;scramblase-אקטיבית &quot; כלומר, הוא בעל לפחות scramblase אחד תפקודי. הערך עבור L R הוא בדרך כלל 45% 3 ואילו R מקסימום הוא בדרך כלל 82.5% 3, במקום (מקסימום R יכול להיקבע באופן ניסיוני עבור proteoliposomes opsin עם PPR של&gt; 1 מ&quot;ג / mmol) 100% צפוי. כפי R מקסימום &lt;100% הנחה היא כי שלפוחית ​​תת-אוכלוסייה של הוא עקשן כינון מחדש. מקס R = 82.5%, את החלק היחסי של שלפוחית ​​כי אינה יכולה לקבל חלבון הוא 0.35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאר את היחסים בין p (≥1 scramblase) ומקום מגורי הקבע (פוספוליפידים חלבון / מילימול מ&quot;ג) על ידי הסטטיסטיקה פואסון כדלקמן: p (≥1 scramblase) = 1 - e <sעד&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (משוואה 2) הערה: כאשר m = מספר scramblases לכל שלפוחית ​​α =-מונו מעריכית מתמדת בכושר ביחידות של פוספוליפידים חלבון / מילימול מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשבר של השלפוחית ​​אינו תורם ערבול אפילו PPR גבוה (ראה דיון), לשנות את המשוואה: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (משוואה 3) הערה: איפה PPR * = PPR / (1- ו), כאשר f הוא האוכלוסייה העקשנית של שלפוחית ​​או, במקרה זה, PPR * = PPR / 0.65 (משוואת 4). הערה: α הקבוע בכושר נקבע על ידי התאמת גרף של p (≥1 scramblase) לעומת PPR * עם פונקציה מונתה מעריכים. אם opsin (משקל מולקולרי 41.7 KDA) מבחינה תפקודית reconstitutes לתוך 175 ננומטר בקוטר שלפוחית ​​(לכל אחד מהם יש שלפוחית ​​280,000 פוספוליפידים 26) בתור מונומר, α = 0.187 מ&quot;ג מילימול -1. אם opsin dimerizes לפני כינון 3 להניב שלפוחית ​​scramblase-פעיל, אז α= 0.37 מ&quot;ג מילימול -1. אם PPR ולא PPR * היו לשמש לניתוח, לאחר מכן את הערכים α המתאים יהיה 0.122 ו 0.244 מ&quot;ג מילימול -1. הערכים החזויים אלה עבור α להניח שכל מולקולות opsin מבחינה תפקודית המוסמכות. אם רק חלק קטן של המולקולות מוסמך לטרוף שומנים, לאחר מכן את הערכים המתאימים של α יהיו גדולים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+animal+rhodopsins%3A+structures%2C+functions%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115(2014).</li>
<li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci.+Off.+J.+Eur.+Photochem.+Assoc.+Eur.+Soc.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li>
<li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+lipids%3A+why+an%27+what%27s+the+reason+for%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flipping lipids: why an' what's the reason for?</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li>
<li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scramblase%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li>
<li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li>
<li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925(2012).</li>
<li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li>
<li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E%2C+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration%2C+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li>
<li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+meets+all-trans-retinal%3A+the+making+of+RPE+bisretinoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li>
<li>Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E%2C+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16+proteins%3A+unknown+structure+and+confusing+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li>
<li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li>
<li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li>
<li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li>
<li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li>
<li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li>
<li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li>
<li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbial%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li>
<li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li>
<li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+then+%5Bsic%5D+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Lévy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li>
<li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367(2013).</li>
<li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li>
<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

את assay פעילות scramblase אפשרה לנו במקור לקבוע opsin שיש לו פעילות פוספוליפידים scramblase 2. את assay גם אפשר לנו לאפיין את פעילות scramblase של opsin ידי בדיקה סגולית (השתמשנו במגוון של שומנים כתב שכותרתו NBD כגון NBD-phosphatidylethanolamine, שכותרתו עם NBD על שרשרת acyl כפי שמוצג על-PC NBD באיור 1 א &#39;, או על headgroup,-ספינגומיילין NBD או NBD- phosphatidylserine 2), את ההשפעה של הרכב השומנים שלפוחית ​​(למשל, כולסטרול בסכומי...

Rhodopsin קולטי האור, קולטן חלבון בשילוב אבטיפוס G (הנסקרת למשל ביחס 1), הוא scramblase פוספוליפידים הראשון להיות מזוהה מבחינה ביוכימית אומת 2,3. Scramblases הם מובילי פוספוליפידים להגביר את הקצב האיטי מיסודם של transbilayer תנועה פוספוליפידים לרמות מתאימות פיזיולוגית בתוך דו-כיוונית, ATP-עצמאי באופן 4-6. דוגמאות לפעולות שלהם ניתן למצוא ב reticulum endoplasmic הממברנה cytoplasmic חיידקים שבו מכונן ערבול דרוש הומאוסטזיס וצמיחת קרום, כמו גם עבור מגוון רחב של מסלולי glycosylation 5. פוספוליפידים מוסדרים ערבול נדרשת לחשוף phosphatidylserine (PS) על פני השטח של תאים אפופטוטיים שבו היא פועלת כמו &quot;לאכול-לי&quot; -signal עבור מקרופאגים 7 והוא מספק משטח procoagulant על ​​טסיות הדם מופעל כדי לזרז את הייצור של גורם חלבוןs דרוש קרישת דם. בממברנות דיסק קולטי אור, פעילות הערבול של rhodopsin הוצעה כדי לנטרל את חוסר האיזון פוספוליפידים בין שני העלונים הממברנה של bilayer כי מופק על ידי ATP תלוי, השומנים חד כיווני flippase ABCA4 4,8,9 10-12. למרות החשיבות פיזיולוגיות של scramblases, זהותם נותר חמקמק עד rhodopsin היתה כפי שדווח scramblase דיסקים קולטי האור 2, בני משפחת חלבון TMEM16 זוהו Ca 2+ scramblases תלויי הדרושים חשיפה PS על הממברנה פלזמה (הנסקרת תוך התייחסות 13), ואת החלבון חיידקי FtsW הוצע בתור ליפידים השנייה scramblase הדרושים לסינתזת פפטידוגליקן 14. תגליות אלו התבססו על הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים ליפוזומים והדגמה של הפעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות describ מתודולוגיהאד כאן. Scramblases פוטנציאליות נוספות 15-21 - החלבונים MurJ ו AMJ מעורב ביוסינתזה פפטידוגליקן, WzxE וחלבונים הקשורים מעורב ערבול מבשרי O-אנטיגן, חלבון MprF צריכה translocate phosphatidylglycerol aminoacylated דרך הממברנה cytoplasmic בקטריאלי, ובני משפחה Xkr8 כי הוצעו לחשוף PS על פני השטח של תאים אפופטוטיים - להישאר להיבדק ביוכימית. זה מדגיש את החשיבות של assay חזק כדי לזהות ולאפיין פעילות scramblase. כאן, אנו מתארים את הכינון מחדש של opsin המטוהר, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור, אל שלפוחית ​​unilamellar הגדולה (חביב), ואת ניתוח בדיעבד של פעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות assay המבוסס-קרינה. ישנם מספר פרוטוקולים היטיבו לתאר זמינים בספרות לביטוי Heterologous וטיהור opsin, ולכן אנחנו לא<html> לתאר את זה בפרוטוקול זה; אנו משתמשים בפרוטוקולים המתואר גורן ואח &#39;. 3 אשר מניב FLAG-מתויג, opsin thermostable בסביבות 100 ng / μl ב 0.1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). כינון מושג על ידי טיפול חביב עם חומר ניקוי מספיק כך שהם להתנפח אבל אינם נמסים. בתנאים אלה, חלבון הממברנה - סיפק בצורת מיצלות חלבון-דטרגנט - ישתלב ליפוזומים הופכים מחדש לתוך הממברנה ליפוזום עם הסרת חומר ניקוי, וכתוצאה מכך proteoliposomes. כדי לשקם opsin (שהושג כמו פרוטאין טהור ב 0.1% (w / v) DDM), חביבי ערוכים מתערובת של POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine) ו POPG (1- Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3- [-rac- phospho (1-גליצרול)]) ורווי DDM לפני הוספת opsin ו-PC NBD. הדטרגנט מוסר מכן על ידי טיפול המדגם עם חרוזי פוליסטירן. <html> הילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; העיקרון שבבסיס assay הקרינה המבוססת מוצגת באיור 1B. החביבים הם מחדש באופן סימטרי עם כמות זכר-PC NBD או אחרים כתב פוספוליפידים פלורסנט NBD שכותרתו (איור 1 א). על הוספת dithionite, dianion קרום impermeant, מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני של חביבי ניתנים ללא ניאון כמו קבוצת ניטרו של NBD מצטמצם אמינו-קבוצה ללא ניאון. כמו לא מולקולות-PC NBD ולא dithionite מסוגלים לחצות את קרום על הזמן בקנה מידה של הניסוי (&lt;10 דק &#39;), זו התוצאה 50% הפחתה של אות ניאון. עם זאת, אם ליפוזומים הם מחדש עם scramblase, מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי יכולים לזחול במהירות אל מחוץ שבו הם מופחתים. זו התוצאה של אובדן מוחלט של הקרינה במקרה האידיאלי (תרשים 1C). es / ftp_upload / 54,635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . איור 1: ייצוג סכמטי של assay פעילות scramblase את assay משתמשת שומנים כתבו ניאון שכותרתו NBD; NBD-PC מוצג (א). שלפוחית ​​unilamellar גדולה הן מחדש עם כמות זכר-PC NBD. כינון מייצר שלפוחית ​​סימטרית, עם NBD-PC מופץ באופן שווה את הכרוזים החיצוניים ופנימיים. Dithionite (S 2 O 4 2) כימי מפחית את הקבוצה נטר של NBD אל אמינו-קבוצה ללא ניאון. טיפול של ליפוזומים ללא חלבון עם dithionite (B, למעלה) גורמת ירידה של 50% של הקרינה מאז רק מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני מופחתים: dithionite טעון שלילית ולא יכול לחצות את הממברנה להגיב עם מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי. טיפול Dithionite של proteoliposomes המכילים opsin (B, למטה), כלומר, proteoliposomes scramblase-פעיל, התוצאות בהפסד 100% של fluorescence כמו opsin מקל תנועה של NBD-PC בין הפנימי לבין העלון החיצוני. (C) מראה עקבות קרינת אידיאליזציה מתקבלות על טיפול ליפוזומים חינם בחלבוני proteoliposomes המכיל opsin עם dithionite. שיעור הפסד קרינה הוא זהה בשני המקרים המציין כי הירידה הכימית של NBD ידי dithionite היא הגבלת קצב, וכי ערבול מתרחש בקצב שווה או גדול מהשיעור של התגובה הכימית. עקבות המתקבלות ניסוי בפועל מוצגות באיור 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> השיטות אנו מתארים ניתן להשתמש בו כדי לשקם ו assay חלבונים מטוהרים אחרים, כמו גם תערובות של חלבונים בממברנה שהושגו, למשל, על ידי מיצוי microsomes עם חומר ניקוי 22.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (מלח נתרן)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>פלואוריומטר קובטות</td><td>סיגמה</td><td>C0918-100EA</td><td>קובטות</td></tr><tr><td>ספקטרופלואורומטר</td><td>פוטון טכנולוגיה בינלאומית, בע"מ</td><td>פלואורמטר</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוסולפיט דרגה טכנית, 85%</td> <td>סיגמא</td><td>157953-5G</td><td>דיתיוניט</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 תוכנה</td><td></td><td></td><td>פריזמה</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 מ"ל מכבש&nbsp;</td><td>נורת'רן ליפידס, בע"מ</td><td></td><td>מכבש</td></tr><tr><td>Whatman, דיסק ניקוז, PE, 25 מ"מ</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>תמיכת דיסק</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore ממברנות חרוטות מסלול, 0.4 ומיקרו; מ', קוטר 25 מ"מ</td><td>סיגמא</td><td>WHA110607</td><td>400 ננומטר ממברנות</td></tr><tr><td>ווטמן נוקלאופור חרוטות מסלול, 0.2 ומיקרו; m, קוטר 25 מ"מ</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 ננומטר ממברנה</td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR צינורות תרבית, חד פעמי, זכוכית בורוסיליקט, 13 x 100 מ"מ</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>צינורות זכוכית</td></tr><tr><td>חומצה פרכלורית</td><td>סיגמא</td><td>30755-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום מוליבדט טטרהידרט</td><td>סיגמא</td><td>A-7302</td><td>אמוניום מוליבדט</td></tr><tr><td>(+)-נתרן L-אסקורבט</td><td>סיגמא</td><td>A7631-25G</td><td>נתרן אסקורבט</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 סופחים</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>חרוזי פוליסטירן</td></tr><tr><td>&nbsp; 2.0 מ"ל מיקרו-צינורות שקופים</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>שפופרות Reconstitution</td></tr><tr><td>מחדש צינור זכוכית</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Reconstitution צינורות זכוכית</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp;</td><td>מלברן&nbsp;</td><td></td><td>DLS</td></tr></tbody></table>

assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים scramblase

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate פוספוליפידים ברחבי bilayer הממברנה באופן דו-כיווני בצורה ATP-עצמאית. Scramblase הראשון להיות מזוהה ומאומת ביוכימית היה opsin, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור. Rhodopsin הוא G חלבון בשילוב קולטן מקומי ממברנות דיסק קולטי אור מוט של הרשתית שבו הוא אחראי על תפיסת האור. פעילות scramblase של Rhodopsin אינה תלויה ליגנד שלה 11- ציס -retinal, כלומר, opsin apoprotein פעיל גם scramblase. למרות פוספוליפידים מכוננים מוסדרים ערבול לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגית תא, רק כמה scramblases פוספוליפידים זוהה עד כה מלבד opsin. כאן אנו מתארים assay מבוסס קרינה של פעילות scramblase של opsin. Opsin הוא מחדש לתוך ליפוזומים unilamellar גדול המורכב phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol וכמות זכר PC שכותרתו NBD ניאון (1-palmitoyl-2- {6- [7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazole-4-י.ל.) אמינו] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). פעילות Scramblase נקבעת על ידי מדידת המידה שבה מולקולות NBD-PC ממוקמות העלון הפנימי של השלפוחית ​​מסוגלות לגשת העלון החיצוני שבו הקרינה שלהם מתבטלת כימית על ידי סוכן צמצום שאי אפשר לחצות את הממברנה. השיטות נתאר יש תחולה כללית והוא יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין פעילויות scramblase של חלבונים בממברנה אחרים.

אנו מתארים את הכינון מחדש של opsin לתוך חביבי לאפיין את פעילות scramblase שלה באמצעות assay המבוסס-קרינה. אנחנו מנתחים את התוצאות להציב גבול תחתון על השיעור של פוספוליפידים בתיווך opsin ערבול ולקבוע מדינת oligomeric שבו opsin reconstitutes תפקודי לתוך השלפוחית. כדי לזהות תנאי כינון מחדש אופטימליים, יש צורך לקבוע באופן אמפירי את כמות חומר הניקוי כי ...

אנו מתארים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית למדידת ערבול פוספוליפידים בליפוזומים חד-צדדיים גדולים שהורכבו מחדש עם אופסין.

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשחזר קולטן טיפוסי המצומד לחלבון G לתוך וזיקולות אונילמילריות גדולות, ולמדוד את יכולתו לבצע טרנסלוקציה בלתי תלויה ב-80p של פוספוליפידים דרך דו-שכבה ליפידית באמצעות בדיקה מבוססת פלואורסצנציה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הטרנספורט הבין-תאי של ליפידים, כגון מהי הזהות המולקולרית של חלבונים המסוגלים לבצע סקרבלינג (scrambling) של ליפידים ומהו המנגנון שלהם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא אמינה ויציבה מאוד.לאחר שנקבע נוהל השחזור עבור הרכב ליפידי נתון ודטרגנט מועדף. כדי להתחיל בנוהל זה, השתמשו במזרק זכוכית כדי להוסיף 1435 µL של תמיסה בריכוז 25 mg/mL של POPC וכלורופורם לבקבוק בעגול תחתית. הוסיפו 160 µL של תמיסה בריכוז 25 mg/mL של POPG וכלורופורם כדי לקבל 52.5 µmol ליפידים ביחס מולרי של תשע ל-אחד של POPC ל-POPG.בשלב הבא, ייבשו את הליפידים במשך 30 דקות באמצעות אידור סיבובי (rotary evaporator) המוגדר ל-145 RPM. עם השלמת הייבוש, העבירו את הבקבוק לדסיקטורור ואקום למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של בופר A כדי להגhidrat את שכבת הליפידים המיובשת.סובב בעדינות את הבקראקום עד להיווצרות תרחיף עכור הומוגני. בצע סוניקציה לתרחיף בתדר של 40 kilohertz באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות אקסטרודר, העבר את הדגימה דרך ממбраנה בעלת גודל נקבים של 400 nanometer, 10 פעמים.בצע לאחר מכן מחזור שני של אקסטרוזיה (extrusion), על ידי העברת הדגימה דרך ממברנה עם גודל נקבים של 200 nanometer, ארבע פעמים. הset aside את התוךיה המתקבלת, שנראית צלולה יותר, המכילה שלפוךיות unipamellar גדולות של פוספוליפידים בקוטר של כ-175 nanometers. לאחר השלמת האקסטרוזיה, הכן תמיסות סטנדרט במבחנות זכוכית של 13 על 100 millimeter כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.לאחר מכן, העבירו 10 µL מכל דגימת LUV ופרוטאו ליפוזום למבחנה זכוכית נפרדת ודללו עם 40 µL של מים מזוקקים דה-יוניים. הוסיפו 300 µL של חומצה פרכלורית לכל מבחנה, וחממו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 145 °C בבלוק חימום. הניחו גולה על כל מבחנה כדי למנוע אידוי.לאחר מכן, יש להמתין עד שהמבחנות יתקררו לטמפרטורת החדר ולהוסיף לכל אחת 1 ml של מים מזוקקים ודה-יוניים. יש להוסיף לכל מבחנה 400 µL של תמיסה שהוכנה טרי שמכילה 12 g/L של ammonium molybdate ו-50 g/L של sodium ascorbate, ולערבב באמצעות וורטקס. יש לחמם את המבחנות במשך 10 דקות ב-100 °C, תוך שימוש בגולות זכוכית למניעת התאיידות.לאחר מכן, הוציאו את המבחנות מבלוק החימום והניחו להן להתקרר לטמפרטורת החדר. בעזרת ספקטרומטר המכוון ל-797 nanometers, השגיאו עקומת כיול באמצעות התמיסות הסטנדרטיות. לאחר מכן, מדדו את הבליעה של הדגימות ביחס לדגימה הריקה, וקבעו את תכולת הפוספט.התחילו על ידי העברת 800 µL מכל תרחיף LUV שהוחדר לשפופרת microfuse נפרדת בנפח של 2 mL. הוסיפו לכל שפופרת 5.3 µL של buffer A ו-34.7 µL של DDM בריכוז 10% mass-per-volume, המומס ב-buffer A. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב מסוג end-over-end.בזמן דגירת הדגימות, שקלו 400 milligrams לכל דגימה של חרו지를 לתוך כלי זכוכית. שטפו את החרוזים עם חמישה milliliters לכל דגימה של methanol, תוך כדי ערבוב איטי למשך 10 דקות. חזרו על שטיפה זו פעם אחת נוספת עם methanol, שלוש פעמים עם מים, ופעם אחת עם buffer A. במהלך 30 הדקות האחרונות של דגירת הדגימות, ייבשו 9.5 microliters לכל דגימה של phospholipid המסומן ב-NBD בתוך מבחנת זכוכית עם פקק הברגה תחת זרם של חנקן.לאחר מכן, הוסיפו 45 µL לדגימה של 0.1% w/v DDM בבופר A כדי להמיס את הפוספוליפיד המיובש. לאחר השלמת הדגירה, הוסיפו את תמיסת הפוספוליפיד המסומן ב-MBD המומס לכל דגימה. לאחר מכן, הוסיפו 0.1% DDM, בופר A ואת האופסין המומס ב-DDM בכמות הרצויה, לפי סדר זה, כדי להגיע לנפח סופי של 1 mL עם ריכוז של 7 mM של DDM.שחזור של חלבון ממברנה מושג על ידי טיפול בוזיקולות בדטרגנט בכמות מספקת, כך שההנפיחות לא תוביל להמסה. תחת תנאים אלו, שחייבים להיקבע באופן אמפירי עבור כל הרכב ליפידי ודטרגנט, החלבון ישתלב בליפוזומים. ערבבו את הדגימות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסיפו 80 milligrams של חרוזי הפוליסטירן שהוכשרו לכל מבחנה, והדגירו שוב למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ערבוב מסוג end-over-end. הוסיפו 160 milligrams נוספים של חרוזי פוליסטירן לכל דגימה, והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ערבוב מסוג end-over-end. עם סיום ההדגרה, העבירו את הדגימות, תוך השארת החרוזים מאחור, למבחנות זכוכית נקיות, שכל אחת מהן מכילה 160 milligrams של חרוזים טריים.ערבבו בתנועת סיבוב (end-over-end) למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, תוך הגנה מאור. לאחר מכן, העבירו את הדגימות, ללא החרוזים, למבחנות microfuse ייחודיות. הניחו את המבחנות על קרח כהכנה לבדיקת פעילות הסקראמבלאז (scramblase activity assay).התחילו בהוספת 1950 µL של בופר A לקובטה מפלסטיק, המכילה מוט ערבוב פלסטי. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של דגימת הפרוטאלליפוזום שהוכנה. הניחו לדגימה להגיע לשיווי משקל בספקטרומטר הפלואורסצנציה תוך כדי ערבוב קבוע למשך חמש שניות.בזמן שהדגימה מגיעה לשיווי משקל, הכין תמיסה של דיתיוניט בריכוז של one molar ב-tris לא מחוצב בריכוז של 0.5 molar. התחל את ניטור הפלואורסצנציה עם עירור של 470 nanometers, פליטה של 530 nanometers ורוחב חריץ של 0.5 nanometers. רשום את הנתונים למשך 50 seconds כדי להשיג אות יציב.לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של תמיסת דיתיוניט בריכוז של 1 M לקובטה. רשמו את הפלואורסנציה למשך 500 שניות לפחות. לבסוף, נתחו את הנתונים כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט.לצורך ניתוח מלא של נתוני הפלואורסצנציה, כאשר מטרתו היא לקבוע את חלקן של הוזיקולות שלא ניתן לשחזר. שחזור החלבונים והליפידים בוזיקולות המשוחזרות וכן התפלגות הגודל של הוזיקולות. במחקר זה, opsin משוחזר לתוך וזיקולות אונילמילריות גדולות כדי לאפיין את פעילות הסקראמבלאז (scramblase) שלו באמצעות בדיקה מבוססת פלואורסצנציה.וסיקולות שוחזרות עם NBD-PC, אשר מתחלק באופן שווה בין העליים החיצוניים והפנימיים. דיתיוניט מחזר את קבוצת הניטרו של NBD בחלק החיצוני של הוסיקולה לקבוצות אנימי שאינן פלורסצנטיות, מה שמוביל להפחתה של 50% בפלורסצנציה בליפוזומים נטולי חלבון. עם זאת, כאשר אופסין מקל על תנועת ה-NBD בין העלה הפנימי והחיצוני, מתרחש אובדן מלא של הפלורסצנציה.ניתן לראות כאן את התוצאות המייצגות של גישה זו ביחסי חלבון-פוספוליפיד שונים. מידת הפחתת הפלואורסצנציה עולה עם כמות האופסין שהרכיב מחדש לוויזקולות, הנעה בין אפס ל-4.95 micrograms. Dithionite הוסף בזמן המצוין, ופלואורסצנציית NBD נוטרה במשך 400 שניות.הפחתת הפלואורסצנציה משמעותית יותר ביחסי חלבון-פוספוליפיד גבוהים יותר, כאשר ההפחתה הגדולה ביותר היא 85%. הפחתת הפלואורסצנציה בנקודת הסיום משמשת לאחר מכן לקביעת ההסתברות לפעילות סקראמבלאז (scramblase), כלומר הסבירות שבווסיקולות קיימת לפחות אחת מסקראמבלאז, תוך שימוש בסטטיסטיקת Polson. העקומה האדומה מייצגת התאמה מונו-אקספוננציאלית עבור אופסין. בעוד שהקווים האפורים המקווקוים מייצגים התאמות מונו-אקספוננציאליות לשחזור של אופסין אל תוך וסיקולות כמונומרים, דימרים קודמים או טטראמרים קודמים.ניתן להתאים בקלות את השיטה שתיארנו לצרכים שונים. הפרוצדורות הן ורסטיליות, וניתן יהיה להשתמש בהן בעתיד כדי לזהות ולאפיין פעילות של סקרמבלאז פוספוליפידים של חלבוני ממברנה אחרים. ניתן להחיל את פרוצדורת הרכיב מחדש (reconstitution) על כל חלבון ממברנה.טכניקה זו אפשרה לנו לזהות את האופסין כסקרמבלאז (scramblase) פוספוליפידי הראשון שאישש ביוכימית, ולאחר מכן אפשרה לנו לאפיין את הפעילות של מצבי קונפורמציה שונים של החלבון, ואת יכולתו להוביל ליפידים שונים.

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

סרטון זה דן בבדיקת דליפת פלואורסצנטיות כדי לחקור את האינטראקציות של פפטידים חודרי תאים עם קרום התא באמצעות חיקויים של קרום התא – שלפוחיות חד-למלריות גדולות, או LUVs, עטופות בצבע פלואורסצנטי ומרווה (quencher).

בדיקת דליפת פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה פפטידית חודרת תאים עם ממברנה

בסרטון זה, אנו מדגימים אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד בתבנית מיקרופלואידית באמצעות בדיקת אפנון pH, באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH המתויג לשומנים פוספטידיל-אתנולמין של דו-שכבה ליפידית נתמכת, הנקראת פלטפורמה מיקרופלואידית. המודולציות ב- pH לאחר קשירת חלבון לפוספוליפידים גורמות למרווה פלואורסצנטית.

בדיקת אפנון pH על שכבות שומנים נתמכות לזיהוי אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד

אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת הדיפוזיה הרוחבית של מין פעיל על פני השטח בממשק נוזל-נוזל על ידי מיזוג חד-שכבת טיפה על חד-שכבה שטוחה.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

אנו מציגים שיטה חסכונית להערכת חדירות הממברנה הליפוזומלית עם רגישות ורזולוציה עדיפות על פני טכניקות קונבנציונליות. באמצעות תגובת החלפת ליגנד מכוסה חדשה, טכניקה זו מזהה שינויים המושרים על ידי פוספוליפאזA 2 בממברנות המודל. גישה נגישה זו, המשולבת בקלות עם ניתוחים סטנדרטיים, משפרת את הרזולוציה לחקר ביופיזיקה של ממברנות ואינטראקציות רעלים.

בדיקת חדירות קרום ליפוזום לחקירת ההשפעות של קבוצות פוספטידילינוזיטול פוספט על הפעולה הממברנוטרופית של ארס PLA2

למדו שיטת מדידה מבוססת פלואורסצנציה לפעילות סקרמבלאז של פוספוליפידים בליפוזומים המכילים אופסין. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני תחבורת ליפידים בין-תאית בביופיזיקה ומדעי המוח.

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

גלה סרטונים נוספים