Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך ולכמת את האינטראקציה בין שני חלבונים מעניינים באמצעות אנזוטרופיה פלואורסצנטית. אמצעים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח. תחום הביוכימיה של החלבונים והביופיזיקה של החלבונים, כגון חלבונים שהאינטראקציות ביניהם חשובות לתפקוד התא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לקבל מידע כמותי ואיכותי על האינטראקציה בין חלבון לחלבון. להכנת חלבון SBDS-FlAsH מטוהר, הכינו תחילה ליטר אחד של מדיום נוזלי LB בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. ובתוכו, התרבות שינתה חיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהצפיפות האופטית ב -600 ננומטר מגיעה ל -0.5 עד 0.7.

השראת ביטוי חלבון SBDS-FlAsH על ידי הוספת IPTG של 0.5 מילי-מולרית לתרבית והמשך הדגירה למשך חמש שעות נוספות. לאחר מכן, אספו את תרחיף החיידקים על ידי צנטריפוגה ב -3800 פעמים G למשך עשר דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את ה-supernatant.

השעו מחדש את התאים ב-35 מיליליטר של חמאת ליזה SBDS בתוספת PMSF מילי-מולרי אחד. Lyse על ידי סוניקציה למשך זמן כולל של ארבע דקות תוך שימוש במחזורים של עשר שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-9,000 פעמים G למשך 50 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

יש לשמור את חומר העלון ולהשליך את לוח הצבעים כדי להסיר פסולת תאית. לאחר איזון עמודת הזיקה של הניקל עם שלושה נפחי עמודות של מאגר ליזה SBDS, הכנס את כל הסופרנטנט המובהר על העמודה. הסר את החלבון הלא קשור על ידי שטיפה עם שלושה נפחי עמודות של מאגר ליזה SBDS.

לאחר שטיפת העמודות, יש להוציא את החלבון הקשור עם שלושה נפחי עמודות של מאגר פליטה SBDS. כדי לטהר עוד יותר את החלבון, יש לאזן את עמודת מחליף הקטיונים של סולפופרופיל עם שלושה נפחי עמודות של מאגר עמוד S דל מלח. מדללים את החלבון פי שישה עם מאגר פוספט 50 מילי-מולרי PH 6.5 ומכניסים אותו לעמודה.

שטפו את החומר הלא קשור עם שלושה נפחי עמודים של מאגר עמודים S דל מלח. לאחר מכן, הסירו את החלבון בשלב אחד על ידי הוספת 50 מילי-מולרי פוספט בופר PH 6.5, נתרן כלורי מולרי אחד על העמודה. לדלל את ה-eluate פי שלושה עם מאגר פוספט 50 מילי-מולרי PH 6.5.

לאחר מכן, יש לרכז את החלבון במכשירי סינון אולטרה על ידי צנטריפוגה ב -3800 פעמים G למשך רבע שעה. איכות החלבונים המשמשים בניסוי מסוג זה היא חזקה מאוד. פרשנות הנתונים מסתבכת אם דגימות החלבון המשמשות אינן בעלות טוהר גבוה.

אמת את טוהר החלבון SBDS-FlAsH על ידי ניתוח SDS-PAGE וצביעה של Coomassie. הקפיאו את החלבון בחנקן נוזלי ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. להכנת חלבון EFL1 מטוהר, תרבית ראשונה שינתה שמרים ב-30 מעלות צלזיוס בליטר אחד של מדיום נשירה סינטטי ללא אורציל, בתוספת 0.5 אחוז גלוקוז עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-1.8.

עודדו ביטוי חלבון על ידי הוספת 2.8 אחוז גלקטוז לתרבית והמשיכו את הדגירה למשך 18 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. אוספים את תרחיף השמרים על ידי צנטריפוגה ב 3800 פעמים G למשך עשר דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה.

השעו מחדש את התאים ב-50 מיליליטר של מאגר ליזה EFL1 בתוספת PMSF מילי-מולרי אחד ובנזמידין מילי-מולרי אחד. לשבש את התאים על ידי חיכוך על מקצף חרוזים באמצעות חרוזי זכוכית למשך זמן כולל של שש דקות באמצעות מחזורים של שתי דקות הפעלה וחמש עשרה דקות כיבוי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-9,000 פעמים G למשך 50 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שמור את הסופרנטנט והשליך את החך כדי להסיר פסולת תאית. לאחר מכן, אזנו את עמודת הזיקה של הניקל עם שלושה נפחי עמודות של מאגר ליזה EFL1. הציגו את כל הסופרנטנט המובהר על העמודה המאוזנת.

לאחר הסרת חלבון לא קשור על ידי שטיפת העמודה בשלושה נפחי עמודות של מאגר ליזה EFL1, יש להסיר את החלבון הקשור עם שלושה נפחי עמודות של מאגר פליטה EFL1. כדי לטהר עוד יותר את חלבון EFL1, אזנו את עמודת אי הכללת הגודל עם נפחי עמודה של 1.5 עמודות של מאגר אנזוטרופי. רכז את חלבון ה-EFL1 שחמק מעמודת הזיקה של הניקל למיליליטר אחד עם התקני סינון אולטרה על ידי צנטריפוגה ב-3800 פעמים G.לאחר מכן, הכנס את הדגימה המרוכזת לעמודת אי הכללת הגודל.

אוספים את החלבון החמק ומתרכזים על ידי סינון אולטרה לריכוז סופי של כ-30 מיקרומולר. ודא את טוהר חלבון EFL1 על ידי ניתוח SDS-PAGE וצביעה של Coomassie. הקפיאו את החלבון בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

מערבבים שלוש ננומול של חלבון SBDS-FlAsH עם שלוש ננומול של הצבע הירוק lumio בנפח של חמישה מיקרומטר של מאגר אניזוטרופי. תנו לתגובה להימשך שמונה שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שמונה שעות, יש לבצע דיאליזה של הדגימה כנגד מאגר האניזוטרופיה למשך הלילה כדי להסיר את הצבע החופשי.

מדוד את הסופגים ב-280 ננומטר ו-508 ננומטר בספקטרופוטומטר באמצעות קובט קוורץ. לאחר מכן, השתמש בחוק למברט-ביר כדי לכמת את אחוז החלבון המסומן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני מדידת ערך האניזוטרופיה, יש לבצע בזהירות כל שלב סינון מלגיון החלבון, ולהבטיח שהדגימה כולה תחולק לתמיסה ותהפוך להומוגנית.

בקובט פלואורסצנטי, הנח 200 מיקרוליטר של 30 ננו-מולרי SBDS-FlAsH במאגר אניזוטרופיה וטיטר שני מיקרוליטר של 30 מיקרו-מולרי EFL1. מערבבים היטב, ונותנים לתגובה לעמוד שלוש דקות לפני מדידת ערך האניזוטרופיה והפלואורסצנטיות. חזור על תהליך זה עד להוספת נפח כולל של 40 מיקרוליטר של EFL1.

כשלב אחרון, התאם את הנתונים למודל כריכה משוער כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע כל ניסוי אניזוטרופיה חשוב לשלול שינויים גדולים בעוצמת הקרינה. כפי שמוצג כאן, הקרינה של SBDS-FlAsH אינה משתנה באופן ניכר בעת הקישור ל-EFL1.

טיטרציה של EFL1 לקובט קוורץ המכיל SBDS-FlAsH מביאה לעלייה באניזוטרופיה הראשונית שנצפתה. מספר תוספות של EFL1 מתארות את עקומת הקישור המתאימה שניתן להתאים באמצעות רגרסיה לא ליניארית של ריבועים מינימליים למודל מחייב משוער. במקרה זה, מודל אתר מחייב אחד אינו מתאר כראוי את נתוני הניסוי.

במקום זאת, מודל של שני אתרי קשירה לא זהים אכן מתאר כראוי את נתוני הניסוי. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ניסוי קשירת האניזוטרופיה הקרינה תוך שלוש שעות אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שיהיה חלבון מטוהר בכמויות גדולות.

במקביל להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זו עם בדיקת השלמה מבוססת פרגמנטים, או אניזוטרופיה פלואורסצנטית עם תחומים שונים של החלבון הנחקר על מנת לתמוך במודל הקישור המתאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע ניסוי קשירה ואחריו אניזוטרופיה פלואורסצנטית.