Name: Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: חקור אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות אניזוטרופיית פלואורסצנציה לכימיה ביולוגית וביופיזיקה. למד כיצד לכמת את הקשר בין חלבון SBDS ל-GTPase EFL1 ולהבין תפקוד תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בתמיכה הכספית מפרויקט CONACyT מספרים 167359 ו-177138, ומפרויקט DGAPA-UNAM מספר IN201615.

1. SBDS-Flash ביטוי חלבון תג וטיהור הערה: לקבלת ניסויי אנאיזוטרופיה, בזק-תג מתאים הרצף Cys-Cys-פרו-הגלאי-Cys-Cys נוסף C- הסופית של SBDS אדם קידוד רצף ידי PCR. מבנה זה היה subcloned לתוך וקטור ביטוי-A pRSET ו להפוך לתאי Escherichia coli C41 להביע חלבון קידוד תג hexahistidine N-terminal (התג-שלו), רצף קידוד SBDS האדם ותג פלאש C- סופי 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי חלבון SBDS-Flash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform E. המוסמכת תאי C41 coli עם הפלסמיד pRSET-HisSBDS-Flash באמצעות פרוטוקול הלם חום תקן 19. פלייט תאי תקשורת המוצקה לוריא- Bertani (LB) השלימה עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. הרכב מוצק מדיה LB מורכב מ 10 גרם NaCl, תמצית שמרים 5 גרם, 10 גרם tryptone ו -20 אגר גרם במשך נפח 1 ליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקים שינו תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עדספיגה ב 600 ננומטר (600) מגיעה 0.5-0.7 ב 1 ליטר של תקשורת הנוזלת LB בתוספת אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת איזופרופיל 0.5 מ&quot;מ β-D-1-thiogalactopyranoside לתרבות ולהמשיך את הדגירה של שעה 5 נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה חיידקי ידי צנטריפוגה ב 3800 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant. בשלב זה, או לאחסן את התא גלולה ב -20 ° C או להשתמש מיד לטיהור חלבון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור חלבונים SBDS-Flash הערה: כל צעדי chromatographic מבוצעים באמצעות חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) מערכת או משאבה peristaltic. כרומטוגרפיה -affinity Ni 2 + משתמשת טור זרימה מהירה 5 מ&quot;ל. כרומטוגרפיה החליפין anionic משתמשת טור מחליף חזק 5 מ&quot;ל sulfopropyl קטיון. קצב הזרימה של 3 מ&quot;ל / דקה שימש את כל השלבים chromatographic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 35 מ&quot;ל של SBDS תמוגה בuffer (7.5 pH חיץ פוספט 50 מ&quot;מ, 300 מ&quot;מ NaCl, 20 imidazole מ&quot;מ) בתוספת 1 מ&quot;מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF) ו lyse ידי sonication במשך זמן כולל של 4 דקות באמצעות מחזורים של 10 שניות על 30 שניות OFF, ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב 9,000 XG במשך 50 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את supernatant וזורקים את הכדור כדי להסיר פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את עמודת זיקת Ni 2 + עם 3 כרכי עמודה (CV) של חיץ תמוגה SBDS ולהציג את כולו בהיר supernatant על הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלבון מאוגד על ידי שטיפה עם 3 קורות חיים של חיץ תמוגה SBDS ו elute עם 3 קורות חיים של חיץ SBDS Elution (50 מ&quot;מ פוספט חיץ pH 7.5, 300 מ&quot;מ NaCl, 250 מ&quot;מ imidazole). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את חלבון 6 פי eluted עם 50 מ&quot;מ חיץ פוספט pH 6.5 ולהסיר אגרגטים אפשריים על ידי סינון דרך קרום תאי 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה המחליפה קטיון sulfopropyl עם 3 קורות חיים של עמודת S מלח הנמוךחיץ (חיץ פוספט 50 מ&quot;מ pH 6.5, 50 mM NaCl) ולהציג את המדגם חלבון מהשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומר מאוגד לשטוף עם 3 קורות חיים של חיץ טור נמוך מלח S ו elute החלבון בצעד אחד עם 50 מ&quot;מ חיץ פוספט pH 6.5, 1 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 3.3 פי חלבון eluted עם 50 מ&quot;מ pH חיץ פוספט 6.5. לרכז את החלבון עם מכשירי אולטרה סינון על ידי צנטריפוגה ב 3800 XG במשך 15 דקות. פלאש להקפיא את החלבון בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הטוהר של החלבון על ידי ניתוח SDS-PAGE ו Coomassie מכתים 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 ביטוי חלבון וטיהור הערה: EFL1 התבטא לפי התקנה של האמרגן מסתעף גל 1/10 21 ואת 3&#39;UTR מחצלת שמר האפייה ב pRS426 הווקטור. חלבון רקומביננטי מקודד איזופורם האדם EFL1 1 התמזגו פרוטאז וירוס Etch טבק (TEV) אתר הכרה ותג hexahistidine בבית הסופית- C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי חלבון EFL1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform ס cerevisiae BCY123 תאים עם פלסמיד pRS426-EFL1TevHis באמצעות פרוטוקול אצטט ליתיום סטנדרטית 22. פלייט כל התאים טרנספורמציה ירידה סינתטי החוצה התקשורת בלי אורציל (SD-URA) בתוספת 2% (w / v) גלוקוז. הרכב של התקשורת SD-URA מורכב בסיס חנקן שמרים 8 גרם ללא חומצות אמינו, 11 גרם חומצות casamino, 55 מ&quot;ג סולפט אדנין, טירוזין 55 מ&quot;ג, 60 מ&quot;ג ו -60 לאוצין טריפטופן מ&quot;ג 1 נפח L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות טרנספורמציה שמרים ב 30 מעלות צלזיוס עד 600 מגיע 1.8 ב 1 ליטר של מדיה SD-URA השלימו עם 0.5% (w / v) גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת 2.8% (w / v) גלקטוז לתרבות ולהמשיך הדגירה במשך 18 שעות נוספות על 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה שמרים ידי צנטריפוגה ב 3800 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant.בשלב זה, או לאחסן את התא גלולה ב -20 ° C או להשתמש מיד לטיהור חלבון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור חלבונים EFL1 הערה: כל הצעדים chromatographic מבוצעות באמצעות מערכת FPLC או משאבת peristaltic. כרומטוגרפיה -affinity Ni 2 + משתמשת טור זרימה מהירה 5 מ&quot;ל בקצב זרימה של 3 מ&quot;ל / דקה. גודל הדרה כרומטוגרפיה משתמש עמודה 125 מ&quot;ל וגדוש מראש עם Superdex 200 שרף בקצב זרימה של 1 מ&quot;ל / דקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 50 מ&quot;ל של חיץ תמוגה EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 מ&quot;מ NaCl, 20 imidazole מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 10% גליצרול) בתוספת 1 מ&quot;מ PMSF ו benzamidine 1 מ&quot;מ ו לשבש את התאים על ידי חיכוך על מקצף חרוז באמצעות חרוזי זכוכית (מ = 0.5 מ&quot;מ) למשך זמן כולל של מחזורי באמצעות 6 דקות של 2 דק &#39;ועוד 15 דק&#39; OFF, ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב 9,000 XG במשך 50 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את supernatant וזורקים את הכדור כדי להסיר פסולת הסלולר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את עמודת זיקת Ni 2 + עם 3 קורות חיים של חיץ תמוגה EFL1 ולהציג כל supernatant הבהיר על הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלבון מאוגד על ידי שטיפה עם 3 קורות חיים של חיץ תמוגה EFL1 ו elute עם 3 קורות חיים של חיץ EFL1 Elution (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 מ&quot;מ NaCl, 250 imidazole מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 10 גליצרול%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה הדרה גודל עם 1.5 קורות חיים של חיץ Anisotropy (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 10% גליצרול, 5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז כדי 1 מיליליטר חלבון EFL1 eluted מעמודת זיקת Ni 2 + עם מכשירי אולטרה סינון על ידי צנטריפוגה ב 3800 XG כדי בנפח הרצוי. הצג את המדגם על עמודת הדרת גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף החלבון eluted ולהתרכז ידי אולטרה סינון לריכוז סופי של כ 30 מיקרומטר. פלאש להקפיא את החלבון בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. ודא הטוהר הדואר של החלבון על ידי ניתוח SDS-PAGE ו Coomassie מכתים 20. </li></ol></li></ol> תיוג 3. SBDS-Flash עם פלורסנט פלאש דיי 4 &#39;, 5&#39;-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) והעמסת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי 3 nmol של חלבון SBDS-פלאש עם 3 nmol של 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) צבע פלואורסצנטי ב 5 נפח μl של חיץ אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו התגובה להמשיך במשך 8 שעות ב 4 ° C. Dialyze המדגם נגד חיץ Anisotropy במשך הלילה כדי להסיר את צבען חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חוק למברט-באר לכמת את% של חלבון הנקרא. מדוד את הספיגה ב 280 ננומטר ו -508 ננומטר ספקטרופוטומטר באמצעות קובט קוורץ של נפח מתאים. הערה: קח למשל את מקדם הספיגה הטוחן הבא (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הריכוז של חלבון הנקרא SBDS-הבזק באמצעות משוואה 2. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הריכוז של חלבון הכולל SBDS באמצעות משוואת 3 על ידי החלפת C SBDS-Flash שנמדדת בשלב קודם. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי חלבון הנקרא באמצעות משוואת 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. ניסויים Anisotropy הקרינה הערה: ניסויי Anisotropy נעשו בתוך spectrofluorometer מצויד בארגז כלי קיטוב ואיסוף נתונים בוצע באמצעות תכנית אנאיזוטרופיה הניתנת בתוכנה של הציוד. אורך גל העירור נקבע ל 494 ננומטר עם רוחב פס רפאים של 8 ננומטר ואת הפליטה נרשמת באמצעות מסנן להקה עובר של 530 ± 25 ננומטר. מדידות נעשו ב 25 מעלות צלזיוס קובט 200 μl עם אורך 5 מ&quot;מ נתיב 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><html> ב קובט הקרינה, להציב 200 μl של 30 ננומטר SBDS-Flash במאגר אנאיזוטרופיה ו לכיל 2 μl של 30 מיקרומטר EFL1. מערבבים היטב ולתת התגובה לעמוד במשך 3 דקות לפני מדידת ערך אנאיזוטרופיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.1 עד בהיקף כולל של 40 μl של EFL1 נוסף. </li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הנתונים למודל מחייב המתאים באמצעות אלגוריתם רגרסיה ריבועים קוי לפחות. משוואות עבור דגמי מחייב הנפוצים ביותר מוצגות בלוח 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את המודל הטוב ביותר המתאר את האינטראקציה בין החלבונים באמצעות בדיקת השאריות של 23 בכושר. תמיכת המודל שנבחר עם ניסויים נוספים. </li></ol> טבלה 1. אינטראקציה בין חלבונים נפוצות מודלים מחייבים ואת המשוואות המתמטיות המתארות אותם.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

<ol><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li>
<li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%3A+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein+folding%22">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding</a>. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).</li>
<li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li>
<li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li>
<li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+%28EFL1%29+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li>
<li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Third, Springer US. (2010).</li>
<li>Nishigaki, T., Treviño, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishigaki%2C+T+%22Tools+to+understand+protein-protein+interactions%22">Tools to understand protein-protein interactions</a>. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).</li>
<li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabnis%2C+RW+%22Handbook+of+Fluorescent+Dyes+and+Probes%22">Handbook of Fluorescent Dyes and Probes</a>. , Wiley. (2015).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li>
<li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+labeling+of+proteins%3A+techniques+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+%28MIT%29+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+%28MIMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li>
<li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li>
<li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+%28UBX%29+Domain-containing+Protein+1+%28UBXD1%29+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li>
<li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemsitry%22%5BJournal%5D)">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li>
<li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Intensity%2C+Anisotropy%2C+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Spectroscopic+Methods+of+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li>
<li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף ואין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

רוב הניסויים ביוכימיים עם חלבונים דורשים לא רק חלבון טהור אלא גם כמויות גדולות מהם, ללא קשר הטכניקה המשמשת. מסיבה זו, החלבונים משמשים עבור סוג זה של ניסויים מתקבלים על ידי ביטוי Heterologous, כפי שהיה במקרה המוצג כאן. ספקטרוסקופיה בתפרחת מחייבת הנוכחות של fluorophore במולקולה למדה. שאריות ארומטיים מהוות את fluorophores הפנימי של חלבון, עם זאת, באמצעות האות שלהם ללמוד אינטראקציות בין חלבונים מסבכת את הניתוח מכיוון שהם נפוצים ברוב החלבונים יהיה נוכח בשני, חלבון קולטן ו ליגנד. בנוסף,...

תאים מכילים שפע של Biomacromolecules המגיבה כל זמן אחד עם השני. קשר זה מעורר מתחמי כי להשתתף מסלולים הסלולר אחראי לתפקוד שלהם הולכת אותות, בקרת גנים ואת נדידת תאים בין היתר. כל האינטראקציות בין החלבונים המתרחשות בתא יוצרי רשת המכונית interactome. בשנת שמר האפייה יותר מ -70% מחלבוני הוכחו יש אינטראקציה 1 שותפים. הבנת interactome של התא ואת תפקידיהם לספק מידע רלוונטי על המורכבות והמגוון של יצורים חיים. מתודולוגיות מספר תוארו לזהות ולאפיין אינטראקציות חלבון-חלבון. שונות גבוהה באמצעות שיטות לשים כגון שני היברידית שמרים 2, מבחני השלמה-מקטעי חלבון 3, טיהור זיקה 4 מצמידים ספקטרומטריית מסה microarra חלבוןys משמש לזהות אינטראקציה 5,6. לאחר הזיהוי, יש צורך לאמת את זה עשוי להשתנות על בסיס כל מקרה לגופו. בדרך כלל, ניסויים אלה כרוכים לשבש את האינטראקציה עצם ברמה של החברים הבודדים של זוג האינטראקציה, למשל, על ידי מחיקת גן או ביטוי יתר של אחד החלבונים, ולאחר מכן מחפשים שינויים במאפיינים או פונקציה של חבר האחר בבית ברמה התאית. בהמשך לכך, טכניקות biophysical 7 משמשות לאפיין את האינטראקציה בין החלבונים ברמה המולקולרית. לשם כך, המבנה של קומפלקסים חלבונים נקבעים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- בעוד calorimetry וספקטרוסקופיה הקרינה משמשים כמותית מכניסטי לתאר אותם. בעבודה זו, אנאיזוטרופיה הקרינה שמשה כטכניקה לאפיין את האינטראקציה בין EFL1 GTPase ואת SBDחלבון S. חלבונים אלה משתתפים בבניית הסינתזה של הריבוזומים באמצעות קידום שחרורו של גורם ייזום איקריוטיים 6 מפני השטח של 60S 8 למקטע ריבוזומלי. החלבון SBDS עובר מוטציה במחלה המכונה 9 תסמונת שווקמן-יהלום ומעשי כגורם חילופי נוקלאוטיד גואנין עבור EFL1 יורדת הזיקה שלה עבור דיפוספט guanosine 10,11. מוטציות Disease in SBDS לבטל את האינטראקציה עם EFL1 ובכך למנוע הפעלה שלה. אנאיזוטרופיה הקרינה הוא נפוץ יישומים ביולוגיים ללמוד אינטראקציות חלבון-פפטיד או חומצות גרעין-חלבון. היא מבוססת על העיקרון כי fluorophore נרגש עם תוצאות אור מקוטב פליטת מקוטב חלקית. אנאיזוטרופיה הקרינה מוגדרת על ידי משוואה 1: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> איפה אני VV ואני VH הואעוצמות קרינה של אנכי (VV) ואופקי (VH) מקוטבות פליטה כאשר המדגם הוא נרגש עם מקוטב אנכי אור 12. אנאיזוטרופיה הקרינה היא רגישה לגורמים המשפיעים על השער של דיפוזיה הסיבוב של fluorophore ובכך תלויה בטמפרטורה, את הצמיגות של הפתרון ואת הגודל המולקולרי לכאורה של fluorophore. הגודל לכאורה של חלבון המכיל עליות fluorophore כאשר הוא מקיים אינטראקציה עם חלבון אחר שינוי כזה אז יכול להיות מוערך כשינוי אנאיזוטרופיה. באופן ספציפי יותר, fluorophore שמסתובבת לאט יחסית פתרון לכל חי הניאון שלה תהיה בערך VV אני גדול וערך לי VH קטן ולכן תפגין אנאיזוטרופיה גדול יחסית. עבור fluorophores כי נפילה ביחס במהירות לכל החיים הניאון שלהם, אני VV ואני VH יהיה דומה וערך אנאיזוטרופיה שלהם יהיה קטן 12 </sup<html> &gt; (איור 1). בנוסף, עבור אות אנאיזוטרופיה טובה למדידת רעש, זה הכרחי כדי לקבל fluorophore עם חי שלמי קרינה דומים בפעם מתאם הסיבוב של המולקולה של עניין. אחרת, לא ניתן לרשום את ההבדל במדויק אנאיזוטרופיה בין חלבון חינם וכי במתחם. לדוגמא, אנאיזוטרופיה של בדיקת ניאון עם חיים שלמים קרובים ל -4 NSEC כגון והעמסה או rhodamine מצורפות תרכובת משקל מולקולרית נמוכה של 100 Da היא 0.05. כריכה למולקולה של 160 kDa יגדל ערך אנאיזוטרופיה שלה ל -0.29; הבדל כי ניתן למדוד באופן מדויק. לעומת זאת, באותה הבדיקה הניאון מעורבת תגובה מחייבת גידול אשר בגודל מולקולרי משתנה מ -65 ל 1,000 kDa תגרום רק שינוי אנאיזוטרופיה של 0.28 עד 0.3, שהוא קטן מכדי שיהיה אפשר למדוד במדויק. בתרחיש זה, בדיקה עם חיים שלמים של 400 NSEC תתאים יותר 12. class = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של ציוד המשמש למדידת אנאיזוטרופיה הקרינה ואת ההליך. ייצוג סכמטי של הציוד המשמש לביצוע אנאיזוטרופיה הקרינה מדידה אינטראקציה בין חלבונים הניסוי. Fluorophores כי נפילת אנאיזוטרופיה קטנה תצוגה מהר המגבירה על קשירת שותף אינטראקציה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יישומי קרינה דורשים נוכחות של fluorophore בכל המולקולות למדו. כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון ישנם שלושה סוגי fluorophores: 1) שאריות טריפטופן נוכח החלבונים, 2) fluorophores מצורף כימי 3) שותפי היתוך ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו deriva שלהעזרי למידה. לרובם יש חלבוני שאריות טריפטופן על מבנו, ולכן הדרך הקלה למדוד אינטראקציה היא על ידי מעקב אחר השינויים בספקטרום הקרינה המקביל או על ידי ניטור שינויים בעוצמת הקרינה של שאריות טריפטופן. עם זאת, שאריות טריפטופן עשויות להיות נוכחות בשני החלבונים מסבכים את הניתוח. מצד שני, עבור fluorophore לשינוי תכונות ניאון שלה עקב אינטראקציה זה צריך להיות ממוקם על או ליד אתר הקישור וזה יכול להפריע לאינטראקציה עצמה. זה צריך תשומת לב מיוחדת בעת שימוש fluorophores המגושם כגון GFP. אם אף אחת fluorophores אלה יכולים לשמש למחקרים מחייב יש צורך, אם כן, להציג את fluorophores חיצונית לזו של חלבונים המעורבים. fluorophores רב מסונתזים כימי קיים והוא יכול להיות מחובר קוולנטית חלבונים באמצעות הקבוצות תגובתי שלהם כגון קבוצות האמינות (שרשרת צד של lysines או N- סופי) ואת קבוצות תיאול ב ציסטאין. Fנגזר luorophore עם אסטרים isothiocyanate ו succinimidyl להגיב עם קבוצות אמידות בעוד iodoacetamide ו maleimide קבוצות תיאול-reactive 13. הצבעים הנפוצים ביותר בשימוש ביישומי קרינה הם נגזרים של וההעמסה ואת צבע ירוק rhodamine, coumarins, fluorophores BODIPY וצבעי אלקסה פלואוריד. רשימה מפורטת של fluorophores זמינים מסחרית והשימוש בהם ניתן למצוא אזכור 14,15. עבור תיוג מוצלח, הקבוצה תגובתי חייבת להיחשף על פני השטח של החלבון, אך בשל המספר הגדול של קבוצות פונקציונליות תגובתי בדרך כלל נוכח פוליפפטידים קשה מאוד להשיג שינוי באתר ספציפי. החלבון של עניין במחקר זה, SBDS, מכיל 5 cysteines חינם ו -33 lysines שעלולים לגרום תיוג אתרים מרובים. תיוג לא אחיד עשוי להשפיע על המחייב יסבך ניתוח נתונים כמולקולות fluorophore שונים עשויות לעורר אותות בעצמת ניאון שונים על כריכה. כדי overcome בעיה זו, השתמשנו fluorophore פלאש, 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) והעמסת לתווית באתר-ישיר החלבון SBDS. זהו צבע arsenoxide עם זיקה גבוהה במשך ארבע cysteines במרווחים מוטיב יודע כמו פלאש-תג המורכב של רצף CCXXCC כאשר X הוא כל חומצת אמינו מלבד ציסטאין 16,17. מוטיב tetracysteine ​​זה מתווסף N- או C- הסופי של החלבון על ידי הנדסה גנטית יחד עם מקשר נאות כדי למנוע את השיבוש של הקפל הכללי של החלבון. הצמד המורכב לצבוע Flash ו- Flash תג תוכנן במקור לחלבוני תווית ספציפי לאתר בתאים חי 17 אבל זה יכול לשמש גם כדי לתייג חלבונים מטוהרים במבחנה כפי שהוא בא לידי ביטוי כאן. בנוסף, אסטרטגיות האנזימטית גם פותחו כדי לאפשר functionalization ספציפית לאתר של חלבונים 18. בכתב היד הזה אנו מתארים את השימושיות של אנאיזוטרופיה קרינהכלי sa ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. כריכה ניתן להעריך על ידי בדיקה פשוטה של ​​הצורה העקומה מחייבת בעוד ניתן להשיג מידע כמוני מן ההתאמה של נתוני הניסוי.

<table><tbody><tr><td>חרוזי זכוכית 0.5 מ"מ</td><td>מוצרי Biospec 11079105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td> טהור במיוחד <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>צבע 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein</td><td>ThermoFischer</td><td>Scientific LC6090</td><td>ערכה זו מכילה את הצבע לתיוג תג FlAsH</td></tr><tr><td>Ampiciline</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז נטול מים</td><td>למדיום</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלקטוז</td><td>למדיום</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>למדיום</td><td></td> DOC0157-טריפטופן<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Bezamidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>נתרן כלורי&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>טקסיקים, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>מגנזיום כלוריד</td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>אשלגן פוספט dibasic</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>נתרן פוספט בסיס חנקן שמרים חד-בסיסי</td></tr><tr><td>ללא חומצות אמינו</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>מיקרו מגורען</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>אדנין סולפט</td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>חומצות קסאמינו</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>יחידות סינון</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; מסנן</td></tr><tr><td>ממברנה</td> kDa <td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>מסנן ממברנה, אסטרי תאית מעורבים, הידרופילי, 0.22&nbsp; ומיקרו; מ', 47&nbsp; מ"מ, לבן, רגיל</td></tr><tr><td>Ni2+ עמודת זיקה</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>מחסנית מלאה מראש ב-5&nbsp; ml Ni-NTA Superflow</td></tr><tr><td>עמודת מחליף קטיון סולפורפרופיל חזק</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 מ"ל</td></tr><tr><td>עמודת אי הכללה בגודל</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>תא פלואורסצנטי</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 UV-Vis</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 טווח טמפרטורות שולחני Ambient-15&deg; עד 60&deg; C</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>הופסק</td><td>מוליכות מערכת FPLC צג UV-MM II צג P500 שבר משאבה</td></tr><tr><td>ספקטרופלואורומטר</td><td>Olis</td><td>אין ישים</td><td>Olis DM 45 עם ארגז כלים לקיטוב</td></tr></tbody></table>

anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

אינטראקציות בין חלבונים ממלאים תפקיד חיוני בתפקוד של אורגניזם חי. לאחר אינטראקציה זוהתה ומאומתים יש צורך לאפיין אותה ברמה המבנית מכניסטית. שיטות ביוכימיות biophysical קיימות מספר למטרה זו. ביניהם, אנאיזוטרופיה הקרינה היא טכניקה רבת עוצמה המשמש במיוחד כאשר עוצמת הקרינה של חלבון שכותרתו fluorophore נשאר קבוע על אינטראקציה בין חלבונים. בטכניקה זו, חלבון שכותרתו fluorophore הוא נרגש עם אור מקוטב האנכי של אורך גל מתאים באופן סלקטיבי שמרגש משנה של fluorophores לפי נטיותיהם היחסיות עם אלומת האור הנכנסת. פליטת וכתוצאה מכך יש גם כיווניות שהיחסים המוקדמים ב המטוסים אנכיים ואופקיים מגדיר אנאיזוטרופיה (r) כדלקמן: r = (אני VV -אני VH) / (אני VV + 2I VH), שבו אני VV ואני <sUB&gt; VH הם עוצמות הקרינה של רכיבים אנכיים ואופקיים, בהתאמה. אנאיזוטרופיה הקרינה רגישה דיפוזיה הסיבוב של fluorophore, כלומר בגודל מולקולרי לכאורה של fluorophore מחובר לחלבון, אשר משתנה על אינטראקציה בין חלבונים. בטקסט הנוכחי, שימוש אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי ללמוד אינטראקציות בין חלבונים הודגם להתייחס המחייב בין חלבון מוטצית הסינדרום שווקמן-היהלום (SBDS) לבין גורם ההתארכות כמו-1 GTPase (EFL1). כמקובל, תיוג של חלבון עם fluorophore מתבצעת על קבוצות תיאול (ציסטאין) או בקבוצות אמינו (להלן: אמין או ליזין N-terminal) של החלבון. עם זאת, SBDS בעל מספר cysteines ו lysines שלא איפשר באתר ביים תיוג של זה. כמו טכניקה חלופית, לצבוע 4 &#39;, 5&#39;-bis והעמסה (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) שמשה לתייג מוטיב tetracysteine ​​במיוחד, Cys-Cys-פרו-הגלאי-Cys-Cys, מהונדסים גנטיים C- הסופית של חלבון SBDS רקומביננטי. התאמה של נתוני הניסוי ספקה מידע כמוני ומידע מכניסטית על המצב המחייב בין החלבונים האלה.

כדי לבצע כל ניסוי אנאיזוטרופיה חשוב לשלול שינויים גדולים בעוצמת הקרינה של fluorophore מאז אנאיזוטרופיה הנצפית של תערובת של מינים מיוצגות על ידי משוואה 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> כאשר F אני</em...

אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להעריך ולכמת את האינטראקציה בין שני חלבוני עניין באמצעות אניזוטרופיה של פלואורסצנציה. מדידות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביוכימיה והביופיזיקה של חלבונים, כגון חלבונים שאינטראקציותיהם חיוניות לתפקוד התא.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להשיג מידע כמותי ואיכותי על האינטראקציה בין חלבונייโปรטאין. כדי להכין חלבון SBDS-FlAsH מבודד, הכינו תחילה ליטר אחד של מצע נוזלי LB בתוספת 100 micrograms per milliliter של ampicillin. ובתוכו, גדלו חיידקים שעברו טרנספורמציה ב-37 degrees Celsius עד שהצפיפות האופטית ב-600 nanometers תגיע ל-0.5 עד 0.7.השראו ביטוי של חלבון SBDS-FlAsH על ידי הוספת 0.5 millimolar IPTG לתרבית והמשיכו בדגירה למשך חמש שעות נוספות. לאחר מכן, אספו את תרחף החיידקים באמצעות סנטריפוגציה ב-3800 ×g למשך עשר דקות בטמפרטורה של 4 °C. הסירו את הנוזל העליון (supernatant).השביה מחדש את התאים ב-35 מיליליטר של SBDS lysis butter המועשר ב-one millimolar PMSF. בצע ליזה באמצעות סוניקציה למשך זמן כולל של ארבע דקות, במחזורים של עשר שניות פעולה ו-30 שניות מנוחה, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סנטריפוג את הדגימה ב-9,000 times G למשך 50 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שמרו את הנוזל העליון והשליכו את המשקע כדי להסיר שיירי תאים. לאחר שיווי המשקל של עמודת זיקה לניקל באמצעות שלושה נפחי עמודה של SBDS lysis buffer, העבירו את כל הנוזל העליון המנוקה אל העמודה. הסירו חלבונים שאינם קשורים על ידי שטיפה בשלושה נפחי עמודה של SBDS lysis buffer.לאחר שטיפת העמודה, אלוטו את החלבון הקשור באמצעות שלושה נפחי עמודה של תמיסת אלוציה SBDS. כדי לטהר את החלבון באופן נוסף, השילו את עמודת מחליף הקטיונים sulfopropyl באמצעות שלושה נפחי עמודה של Low salt S column buffer. דללו את החלבון פי שישה עם תמיסת פוספט 50 millimolar ב-pH 6.5 והחדירו אותו לעמודה.שטפו את החומר שאינו קשור בשלושה נפחי עמודה של Low salt S column buffer. לאחר מכן, בצעו אלוציה של החלבון בשלב אחד על ידי הוספת 50 millimolar phosphate buffer PH 6.5, one molar sodium chloride לעמודה. דללו את האלואט פי שלושה עם 50 millimolar phosphate buffer PH 6.5.לאחר מכן, רכז את החלבון באמצעות התקני אולטרה-פילטרציה על ידי סבב צנטריפוגה ב-3800 ×g למשך 15 דקות. איכות החלבונים המשמשים בסוג זה של ניסוי היא קריטית. פרשנות הנתונים הופכת למסובכת אם דגימות החלבון שנעשה בהן שימוש אינן בדרגת טוהר גבוהה.אששו את טהרת חלבון ה-SBDS-FlAsH באמצעות אנליזת SDS-PAGE וצביעת Coomassie. הקפיאו את החלבון בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי ואחסנו אותו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לשימוש הבא. כדי להכין חלבון EFL1 מpurified, תרבתו תחילה שמרים שעברו טרנספורמציה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בליטר אחד של מצע synthetic drop-out ללא uracil, בתוספת 0.5 אחוזי גלוקוז, עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר תגיע ל-1.8.השראו ביטוי של חלבון על ידי הוספת 2.8% גלקטוז לתרבית והמשיכו את הדגירה למשך 18 שעות ב-30 °C. אספו את ת сусפנזיית השמרים על ידי צנטריפוגה ב-3800 ×g למשך עשר דקות ב-4 °C. הסירו את הנוזל העליון לאחר הצנטריפוגה.שHח תחת השהיה את התאים ב-50 milliliters של באפר ליזיס EFL1 בתוספת one millimolar PMSF ו-one millimolar benzamidine. שברו את התאים באמצעות חיכוך במכשיר bead-beater בעזרת כדוריות זכוכית למשך זמן כולל של שש דקות, במחזורים של שתי דקות פעילות וחמש עשרה דקות מנוחה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 9,000 times G למשך 50 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שמרו את הנוזל העליון והשליכו את המשקע כדי להסיר שיירי תאים. לאחר מכן, השיגו שיווי משקל בעמודת זיקה לניקל באמצעות שלושה נפחי עמודה של EFL1 lysis buffer. העבירו את כל הנוזל העליון המזוכה אל העמודה שהגיעה לשיווי משקל.לאחר הסרת חלבון שאינו קשור על ידי שטיפת העמודה בשלושה נפחי עמודה של EFL1 lysis buffer, בצע אלוטה של החלבון הקשור באמצעות שלושה נפחי עמודה של EFL1 elution buffer. כדי לטהר עוד יותר את חלבון ה-EFL1, שווה את עמודת הפרדת הגדלים (size exclusion column) עם 1.5 נפחי עמודה של Anisotropy buffer. רכז את חלבון ה-EFL1 שהותלוש מעמודת הניקל (nickel affinity column) לנפח של מיליליטר אחד באמצעות מכשירים לסינון אולטרה (ultra filtration devices) על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-3800 ×g. לאחר מכן, הזרק את הדגימה המרוכזת אל עמודת הפרדת הגדלים.אספו את החלבון שנשטף ורכזו אותו באמצעות אולטרה-פילטרציה לריכוז סופי של כ-30 micromolar. ודאו את טהרתו של חלבון ה-EFL1 באמצעות אנליזת SDS-PAGE וצביעת Coomassie. הקפיאו את החלבון בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי ושמרו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד לשימוש הבא.ערבב שלושה nanomoles של חלבון ה-SBDS-FlAsH עם שלושה nanomoles של צבע lumio green בנפח של 5 µm של באפר אניזוטרופיה. הנח לתגובה להימשך שמונה שעות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שמונה שעות, בצע דיאליזה לדגימה מול באפר האניזוטרופיה למשך הלילה כדי להסיר את הצבע החופשי.מדדו את הבליעה באורכי גל של 280 ננומטר ו-508 ננומטר בספקטרופוטומטר באמצעות קוביית קוורץ (Quartz Cuvette). לאחר מכן, השתמשו בחוק למברט-באר כדי לכמת את אחוז החלבון המסומן, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לפני מדידת ערך האניזוטרופיה, יש לבצע כל שלב של סינון מתגליל החלבון בזהירות, תוך וידוא שכל הדגימה מועברת לתמיסה והופכת להומוגנית.בתוך קובט פלואורסצנציה (Fluorescence Cuvette), הכניסו 200 µL של 30 nM SBDS-FlAsH בבופר אניזוטרופיה ותקרו 2 µL של 30 µM EFL1. ערבבו היטב, והמתינו שלוש דקות לפני מדידת ערכי האניזוטרופיה והפלואורסצנציה. חזרו על תהליך זה עד להוספה של נפח כולל של 40 µL של EFL1.כשלב סופי, התאימו את הנתונים למודל קישור משוער כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לבצע ניסוי אניזוטרופיה כלשהו, חשוב לשלול שינויים משמעותיים בעוצמת הפלואורסצנציה. כפי שמוצג כאן, הפלואורסצנציה של SBDS-FlAsH אינה משתנה באופן ניכר בעת הקישור ל-EFL1.טיטרציה של EFL1 לתוך קוביית קוורץ המכילה SBDS-FlAsH מובילה לעלייה באניזוטרופיה הראשונית שנצפית. מספר הוספות של EFL1 מתארות את עקומת הקישור המתאימה, אותה ניתן להתאים למודל קישור משוער באמצעות רגרסיה של ריבועים פחותים לא-ליניארית. במקרה זה, מודל בעל אתר קישור אחד אינו מתאר באופן הולם את הנתונים הניסיוניים.במקום זאת, מודל של שני אתרי קישור שאינם זהים מתאר באופן הולם את הנתונים הניסויים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את ניסוי קישור האניזוטרופיה של פלואורסצנציה בשלוש שעות אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להחזיק בכמות גדולה של חלבון מpurified.במקביל להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקת השלמה מבוססת פרגמנטים (fragment-based complementation assay), או אניזוטרופיה של פלואורסצנציה עם דומיינים שונים של החלבון הנחקר, כדי לתמוך במודל קישור מתאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעל你们 ידע מקיף על אופן ביצוע ניסוי קישור ולאחריו בדיקת אניזוטרופיה של פלואורסצנציה.

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

סרטון זה מדגים את הטכניקה של ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות (FFS) לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים. חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בדגימה עוברים דימריזציה באמצעות סוכן כאשר חוקרים אוליגומריזציה של חלבונים באמצעות FFS. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, כאשר החלבונים נעים פנימה והחוצה מנפח התצפית הקטן, ניתוח התנודות בבהירות המולקולות הפלואורסצנטיות מבוצע כדי לקבוע את המצב האוליגומרי של החלבונים.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת האנאיזוטרופיה הפלואורסצנטית כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבון תסמונת שוואכמן-יהלום (SBDS) המתויג פלואורופור לבין גורם התארכות דמוי 1 GTPase (EFL1). על דגירה של חלבוני SBDS עם ריכוזים הולכים וגדלים של EFL1, נצפתה עלייה מתמדת באנאיזוטרופיה, מה שמצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שני החלבונים.

זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון

סרטון זה מתאר אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית בעלת ביצועים גבוהים המסייעת לנטר את האינטראקציה בין גורמי שעתוק לדנ"א. הבדיקה מנטרת את האינטראקציות של מולקולת DNA עם תווית פלואורופור עם גורם השעתוק הספציפי שלה על ידי מדידת מידת הקיטוב עקב סיבוב מולקולרי או אנאיזוטרופיה של ה- DNA המסומן פלואורופור.

אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית לקביעת גורם שעתוק-זיקה לקשירת DNA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל נתונים smFRET תלת-צבעי וניתוח שלה עם אנסמבל תלת-ממד מודל מרקוב חבוי. מתוך תפיסה זו, מדענים יכולים לחלץ מידע קינטי מערכות חלבונים מורכבים, כולל cooperativity או אינטראקציות מתואם.

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לחקר הגמישות והדינמיקה המקומית של ביומולקולות באמצעות אניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן ברמת מולקולה בודדת במצב מיקרוסקופיה קונפוקלית.

אניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן ממולקולות בודדות לאפיון גמישות מקומית בביו-מולקולות

חקור אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות אניזוטרופיית פלואורסצנציה לכימיה ביולוגית וביופיזיקה. למד כיצד לכמת את הקשר בין חלבון SBDS ל-GTPase EFL1 ולהבין תפקוד תאי.

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

גלה סרטונים נוספים