מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבודד תאים דנדריטיים פלסמציטואידים, או PDC, עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברים המועדים לזאבת לצורך חקר תפקודם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות למאפיינים של אוכלוסיית תאי חיסון מסוימת, כגון אינטרפרון אלפא המייצר PDC בשלב מאוחר של התפתחות הזאבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להעשיר אוכלוסיית יעד אחת עד כמה אוכלוסיות יעד לטוהר גבוה יותר מאשר על ידי מיון חרוזים מגנטיים.

לאחר הקטיף, העבירו את עצמות הגפיים האחוריות וארבעה מיליליטר של מדיום שלם, למרגמה. הוסף שישה מיליליטר של מדיום שלם טרי כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 מיליליטר. ולפצח את העצמות בעדינות בעזרת עלי.

מערבבים בעדינות את העלי כדי לשחרר את מח העצם. לאחר מכן, העבירו את כל המדיום דרך מסננת של 70 מיקרון לצינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח. הוסף 10 מיליליטר מדיום שלם טרי למרגמה.

ומסננים את הסופרנטנט פעמיים נוספות עד שהעצמות נראות לבנות. לאחר מכן, צנטריפוגה את תאי מח העצם, והשעיה מחדש של הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום שלם טרי. לאחר מכן, שכבו את התאים על חמישה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות טרי שהוכן בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, תוך הקפדה לא לשבש את השכבות.

ומפרידים את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, הסר בזהירות את שמונת המיליליטר העליונים של התמיסה, ואסוף את מעיל האפי של שני מיליליטר בשלב הביניים. הוסף 12 מיליליטר של מדיום שלם קר כקרח לתאים החד-גרעיניים המבודדים, וכסה את הצינור לערבוב על ידי היפוך.

לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה. כדי לצבוע את התאים עבור FACS, יש להשעות אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של נוגדן חוסם CD1632FC בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, שטפו את התאים בארבעה מיליליטר של מאגר מיון קר כקרח וסמנו את התאים ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים המתאים להכתמת פני התא.

במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. שטפו את התאים בארבעה מיליליטר של מאגר מיון קר כקרח כדי להסיר כל נוגדן מצומד פלואורסצנטי לא קשור. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של תמיסת העמסה של FACS והעבירו את הדגימה לתוך צינור FACS על קרח.

כדי לצבוע את בקרות הפיצוי, יש לציין אחת כפול 10 עד שישית טחול לכל צינור. שטפו את התאים עם ארבעה מיליליטר של מאגר מיון והשעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מאגר מיון. לאחר מכן, הוסף את הנוגדן המצומד הפלואורסצנטי המתאים מקוקטייל הנוגדנים של פני התא הראשי לכל צינור פיצוי מתאים ונער את הצינורות לערבוב.

לאחר 15 דקות בחושך, בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את כל הדגימות עם מאגר מיון והשעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של מאגר מיון קר כקרח. למעט צינור ה-DAPI, המושעה מחדש ב-500 מיקרוליטר של תמיסת טעינה FACS. כדי לטהר את אוכלוסיית תאי היעד על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, העמיסו צינורות איסוף המכילים 500 מיקרוליטר FBS בתוספת אנטיביוטיקה מתחת לשסתומי המיון.

לאחר מכן, טען את הצינור הלא מוכתם ואסוף 10,000 אירועים כדי להגדיר את השער השלילי לכל עוצמת פלורסנט. ו-10,000 אירועים בצינורות פיצוי הכתמים הבודדים כדי להגדיר את השער החיובי לכל עוצמת פלורסנט. אסוף 3,000 אירועים ממדגם הניסוי כדי להגדיר את השערים של אוכלוסיית התאים הממוינת.

שימוש בעוצמות הקרינה כפרמטרים של גרף הגישה X ו-Y כדי לשער ידנית את אוכלוסיית תאי היעד. לאחר מכן, מיין את אוכלוסיית תאי היעד לתוך צינור האיסוף. בתום המיון, הוסף עד ארבעה מיליליטר של מדיום שלם של אייס קול לתאים.

לאחר מכן, מכסים את הצינור ומערבבים את התאים על ידי היפוך. גלולה את התאים המטוהרים על ידי צנטריפוגה, שאיבת כל 200 המיקרוליטרים האחרונים של הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום שלם קר כקרח והעבירו את התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה שנייה.

לבסוף, שאפו את כל המיקרוליטרים מלבד 100 המיקרוליטרים האחרונים של הסופרנטנט ואחסנו את אוכלוסיית התאים הממוינים על קרח עד לשימוש. מיון תאים מופעלים מגנטיים של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים של מח עצם מעכברים המועדים לזאבת מביא לטוהר של 7.75% בלבד לאחר ההעשרה. עם זאת, תאים דנדריטיים מועשרים בפלסמציטואיד מועשרים ב-FACS מפגינים טוהר גבוה של עד 96.4% לאחר המיון.

כדי להבטיח טוהר גבוה, תאי מח העצם החד-גרעיניים מגודרים תחילה ומופרדים מהפסולת על ידי פרמטרים של פיזור קדימה וצדדית. באמצעות רוחב פיזור קדימה לעומת גובה פיזור קדימה ורוחב פיזור צדדי לעומת גובה פיזור צד, התאים הבודדים מגודרים עוד יותר כדי למנוע את האותות החיוביים השגויים המיוצרים על ידי אגרגטים. התאים השליליים הבודדים החיים של DAPI מגודרים לאחר מכן על ידי ביטוי פני התא החיובי CD11c שלהם, CD11B שלילי המאפשר שער נוסף של אוכלוסיית התאים הדנדריטיים של מח עצם חיובי B220, PDCA-1

אוכלוסיית ה-PDC הממוינה היא לא רק בעלת טוהר גבוה אלא גם נורמלית מבחינה תפקודית עם היכולת לייצר IFNalpha בגירוי CPG במבחנה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפצח את העצמות ולערבב בעדינות את מח העצם המשוחרר כדי לשמור על כדאיות התאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף RNA או תרבית וגירוי במבחנה, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ביטוי הגנים או התפקוד של אוכלוסיות תאים מועשרות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרי PDC לחקור את תפקידו של תא רב עוצמה זה בהתפתחות מודלים של עכברים המועדים לזאבת ולזאבת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוכלוסיית PDC מטוהרת מאוד ממח העצם של עכברים המועדים לזאבת.