Name: מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למדו לבודד תאי דנדריטים פלסמציטואידים ממח עצם עכברים בעלי נטייה לזאבת באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה. השיטה מספקת טוהר גבוה של 96.4% לניתוח תפקודי של תאי PDC וייצור אינטרפרון אלפא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למעבדת ציטומטריית זרימה במכללת וירג'יניה-מרילנד לרפואה וטרינרית על השימוש במתקן הליבה של זרימה ציטומטרית. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הסטארט-אפ של XML. XL הוא עמית בולים בתוכנית לתואר שני במדעי הביו-רפואה והווטרינריה.

הערה: MRL / MP-פאס LPR (MRL / LPR) עכברים נוטה זאבת גידלו ומתוחזק מתקן הפתוגן ללא הספציפיים הבאים בדרישות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) וירג&#39;יניה טק (מספר אבטחת צער בעלי חיים: A3208-01). מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם המלצות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול IACUC # 12-062. 1. תא תרבות בינונית הצפת המיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני תרבית תאים מלא (C10) באמצעות RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי, פירובט סודיום 1 מ&quot;מ, 1% 100 ממ חומצות אמינו לא חיוניים, 10 HEPES מ&quot;מ, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ מיון (HBSS-מלא) באמצעות תמיסת מלח מאוזן של 1x האנק (HBSS) השלימו עם 10 HEPES מ&quot;מ, 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אלבומין בסרום שור,0.05 מ&quot;מ MgCl 2 ו 0.2 U / ml I. DNase </li></ol> 2. עכבר Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי מנות בקוטר 6 ס&quot;מ המכיל 4 מ&quot;ל C10. מניחים את הכלים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר משאיפת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את הטחול ולשמור אותו בצלחת עם C10 על הקרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העכבר למטה עם הבטן כלפי מעלה על הצלחת הניתוח. לעקר את הגוף על ידי ריסוס אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור להפריד את העור מקיר השריר מתחת לאורך קו אמצע הגחון מן מאחת הערווה עד הצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור לאורך הגפיים האחוריים מן החתך הראשון עד הקרסול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העור לאחור בצדדים וחתך את קיר השרירים בצדי מהמקום החתך הראשון ממברנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את קיר שרירי הגב בצד ימין של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הטחול בצד הימני של העכבר מתחת המעי הדק ליד הקיבה. תרים קצה אחד של הטחול הדואר ולהפריד אותו מהבטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים שתי הגפיים האחוריות החוצה, כולל עצם הירך לבין השוקה, ולהסיר את כל השרירים ככל האפשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את השרירים לאורך הגפיים האחוריים מהג&#39;וינט האגן / הירך עד הקרסול עם מספריים חדים, מנסה להימנע כלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הגפיים האחוריים בגזירה במפרק האגן / ירך מפרק קרסול / רגל ללא חשיפת תוכן מח עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרירים הנותרים נקיים על העצמות על ידי גירוד עם סכין גילוח שוב ושוב וחיתוך השרירים בנקודות המשותפות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את עצמות בצלחת 6 ס&quot;מ המכיל 4 C10 מ&quot;ל על הקרח. המשך ביתור העכבר הבא. </li></ol> 3. בידוד Splenocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הטחול בעדינות עם בוכנת מזרק נגד מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי הצלחת ובה C10 4 מיליליטר עד שלא חתיכות אדומות נראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף C10 נוסף 6 מ&quot;ל לתוך צלחת דרך מסננתnd מכן להעביר את ההשעיה תא הכולל 10 מ&quot;ל צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ&quot;ל 1 x תאי דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה. לדגור על RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, צנטריפוגות צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 C10 מ&quot;ל. לבטל את כל גושים גדולים (תאים מתים) ולשמור את הצינור על קרח למשך מאוחר יותר. הערה: אם יש הרבה גושים קטנים, להשתמש מסננת תא 70 מיקרומטר לסנן את ההשעיה תא פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הסלולרי עם trypan הכחול באמצעות דלפק תא אוטומטי. </li></ol> 4. בידוד תא מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העצמות עם 4 מ&quot;ל C10 לתוך מרגמה ולהוסיף 6 C10 מ&quot;ל לעשות נפח של 10 מ&quot;ל C10 בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצח את העצמות בעדינות המרגמה באמצעות apestle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות עם העלי כדי לשחרר את מח העצם לתוך C10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את C10 10 מ&quot;ל המכיל מח עצם לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל על הקרח דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. להוסיף C10 10 מ&quot;ל טריים אל תוך המדוכה עדיין המכיל את העצמות. הערה: פיפטה הפתרון המכיל עד עצם מח ומטה מספר פעמים לפני שהם מעבירים דרך מסננים אם גושים אדומים גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 4.2 עד 4.4 פעמים. לאחר לשטוף האחרון, העצמות אמורות להופיע לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C. בינתיים מכינים 5 מ&quot;ל מוכן לשימוש בינוני שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי 15 מ&quot;ל ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 C10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט שכבת השעית התא 10 מיליליטר על גבי מדיום שיפוע צפיפות 5 מיליליטר, שמירת ממשק ברור בין שני השלבים. ואז צנטריפוגות צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ב 1,363 גרם במשך 30 דקות בRT (20 מעלות צלזיוס) עם סט אץ כמו 9 האטה להגדיר כמו 0 (או הבלם OFF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר את הפתרון העליון 8 מ&quot;ל בזהירות ולאסוף את המעיל 2 מ&quot;ל באפי על הממשק (שכבה של תאים mononuclear) לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 C10 מ&quot;ל קרח קר עד 15 מ&quot;ל צינור חרוטי המכיל תאים mononuclear מח עצם, כובע ו להפוך כמה פעמים כדי לערבב היטב, אז צנטריפוגות צינור ב 800 XG במשך 10 דקות, 4 ° C. </li></ol> 5. מכתים פני התא עבור FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון נוגדן אנטי עכבר CD16 / 32 (1 דילול 100 HBSS-מלא, 5 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה בשלב 4.10, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 פתרון נוגדנים μl אנטי עכבר CD16 / 32 לחסום קולטני Fc על תאים mononuclear. דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת נוגדנים הקרינה מצומדות (נמלהi-עכבר CD11c-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול אנטי עכבר B220-V500 01:40 דילול HBSS- מלא כפי המומלץ על ידי היצרן ב 100 נפח סופי μl לדגימה). הערה: חשוב לכייל נוגדנים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות הדגירה בשלב 5.1.2, להוסיף 4 מ&quot;ל קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר מאוגד אנטי עכבר CD16 / 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 תערובת נוגדנים μl הקרינה מצומדות. דגירה על קרח למשך 15 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף 4 מיליליטר קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר נוגדני קרינת מצומדות מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון טעינת FACS (500 ng / ml DAPI ב HBSS-מלא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה בשלב 5.1.6, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 μ; L FACS פתרון הטעינה. מעביר את השעית התא לתוך (צינור FACS) צינור תחתי עגול 12 x 75 מ&quot;מ ולשמור את הצינור על קרח בחושך עד מיון בתוך השעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים לפיצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות לייבל 6 FACS PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI או בלא כתם. Splenocytes Aliquot ב 1 x 10 6 תאים / צינור לתוך צינורות FACS, ולשטוף עם 4 מ&quot;ל HBSS מלא ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.. הערה: השתמש DNA מחייבת הקרינה לצבוע, DAPI, להבחין בין תאים חיים מן התאים המתים. DAPI יכולים לעבור דרך קרום התא של תאים מתים (אבל לא של תאים חיים) ו- DNA כרומוזום לאגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 μl HBSS-מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צינור FACS המתאים, להוסיף אחד נוגדנים הבאים: אנטי עכבר CD19-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול או B220-V500 01:40 דילול אנטי עכבר כפי שהומלץ על ידי manufacturer. השאירו את ה -5 (DAPI) ו -6 (בלא כתם) FACS צינורות כפי שהם. מערבבים היטב על ידי רועדת דגירה כל צינורות FACS על הקרח בחושך במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 4 מ&quot;ל קרח קר HBSS מלא לתוך צינור כל צנטריפוגות צינורות FACS ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 קרח μl HBSS קר-מלא למעט גלולה בצינור שכותרתו DAPI, אשר resuspended ב 500 μl FACS פתרון הטעינה. שמירה על כל 6 צינורות על הקרח בחושך עד מיון. </li></ol></li></ol> 6. מיון על הסדרן הנייד הערה: מבצע של מיון הליך על cytometer והתוכנה טופל עם הדרכה מפורטת המסופקת על ידי החברה. בקצרה, אנו משתמשים 100 זרבובית מיקרון ב 20 psi, ריכוז תא היעד שנקבע בין 5 - 10 מיליון דולר מ&quot;ל, ולהתאים יעילות עד 70% ומעלה (כלומר, סכסוכים הזמן תחת 30%). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות אוסף FACS עם 500 μl FBS / צינור המכיל 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הפרמטרים פיצוי של סדרן התא באמצעות צינורות פיצוי חד כתם משלב 5.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט 10,000 תאי צינור בלא כתם להגדיר שער שלילי עבור כל עוצמת פלורסנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט 10,000 תאי צינורות פיצוי חד כתם אחרים כדי להגדיר שער חיובי עבור כל עוצמת פלורסנט. הערה: התוכנה מחשבת את הפרמטרים פיצוי אוטומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מדגם אחד משלב 5.1 כדי להגדיר את השערים של אוכלוסיות תאים ממוינות על ידי הקלטת 3,000 תאים. באמצעות עוצמת פלורסנט כפרמטרים של X ו- גרף ציר Y, ​​אוכלוסיית תאי יעד השער באופן ידני כקבוצה של נקודות כנראה מופרדות נקודות אחרות. הערה: סט gating זהו גמיש שרירותי המבוסס על הדרישות של חוקרים. אם החוקרים מצפים טוהר גבוה יותר על בסיס סמנים אחד או יותר, להזיז את השערגבוה יותר על בסיס עוצמת ניאון המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען צינור איסוף ולהתחיל למיין את אוכלוסיית תא המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את צינור איסוף על הקרח לאחר מיון עד שכל דוגמיות נעשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף C10 קר קרח על צינור איסוף עד 4 מ&quot;ל, כובע להפוך לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור האיסוף ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C, ולאחר מכן לשאוב supernatant, יוצא בסביבות 200 μl עם תא גלול ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף C10 קר קרח 1 מ&quot;ל ל resuspend התא גלולה ולהעביר את כל השעיה התא לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור 1.5 מ&quot;ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C ו לשאוב supernatant, עוזב 100 μl עם תא גלולה ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את אוכלוסיות תאים ממוינים על הקרח עד לשימוש. </li></ol>

<ol><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Herzenberg, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+the+fluorescence+activated+cell+sorter+and+flow+cytometry%3A+a+view+from+Stanford%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford.</a> Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).</li>
<li>Brown, M., Wittwer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+principles+and+clinical+applications+in+hematology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology.</a> Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).</li>
<li>Laerum, O. D., Farsund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+flow+cytometry%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Clinical application of flow cytometry: a review.</a> Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).</li>
<li>Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+to+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry to clinical microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).</li>
<li>Mattanovich, D., Borth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell+sorting+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Applications of cell sorting in biotechnology.</a> Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).</li>
<li>Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD95+and+CCR7+expression+on+circulating+CD4%28%2B%29+lymphocytes+revealed+disparate+immunoregulatory+potentials+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus.</a> Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).</li>
<li>Cullender, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+interact+to+quench+microbiome+flagellar+motility+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).</li>
<li>Fernandez, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence-based+isolation+of+live+C.+elegans+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).</li>
<li>Cai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+expression+on+podocytes+and+its+role+in+inflammatory+immune+response+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis.</a> Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).</li>
<li>Blasius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-surface+molecule+selectively+expressed+on+murine+natural+interferon-producing+cells+that+blocks+secretion+of+interferon-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha.</a> Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).</li>
<li>Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+%28MCS%29+can+be+used+as+a+large-scale+method+for+establishing+zebrafish+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures.</a> Sci Rep. 5, 7959(2015).</li>
<li>Valli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-+and+magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+enrich+human+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells.</a> Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).</li>
<li>Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dysregulation+of+cytokine+networks+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus.</a> J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).</li>
<li>Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+plasmacytoid+dendritic+cell+frequency+and+function+revealed+by+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody.</a> J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).</li>
<li>Liao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tacrolimus+Protects+Podocytes+from+Injury+in+Lupus+Nephritis+Partly+by+Stabilizing+the+Cytoskeleton+and+Inhibiting+Podocyte+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis.</a> PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מיועד להעשרה בטוהר גבוה של pDC חי השומר על היכולת לייצר IFNα. היישומים של פרוטוקול זה כוללים, אך אינם מוגבלים לטיהור של pDC ו/או כל תא חד-גרעיני אחר ממח העצם של MRL/LPR וכל זני עכבר אחרים לחקר תפקודים תאיים ומולקולריים. מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה הם להבטיח כדאיות וטוהר גבוהים של ה-pDC הממוין. שלב המפתח הראשון הוא שחרור מח עצם מהעצמות. כדי למזער פגיעה בתאי מח העצם, חשוב לפצח בעדינות את העצמות ולערבב את העלי במקום לרסק את העצמות. שלב המפתח השני הוא העשרת תאים חד-גרעיניים עם מדיום שיפוע צפיפ...

הפרדה יעילה של אוכלוסיית תאים לבחירה מתאים אחרים מאפשרת מחקרים על האוכלוסייה שאולי לא היו אפשריים אחרת. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) הוא שיטה להעשרת אוכלוסיית תאים מעניינת בטוהר גבוה. 1,2 סוגי תאים שונים מבטאים בדרך כלל מולקולות ייחודיות, או שילוב ייחודי של מספר מולקולות, על קרום הפלזמה שיכול להבחין בין אוכלוסיית תאים אחת לאחרת. עם קשירה של מולקולות פני התא הללו על ידי נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים ספציפיים, מכונת זיהוי הנקראת ציטומטר/ממיין זרימה מסוגלת לעורר ולזהות את אותות האור של צבעים פלואורסצנטיים שונים המייצגים סמני מולקולות שונים על התאים ברמת התא הבודד. המידע המשולב המורכב מנוכחות של אות אור (המייצג ביטוי חיובי של מולקולת פני השטח המתאימה) או היעדר אות אור (המייצג ביטוי שלילי של מולקולה) מגדיר את הפנוטיפ של התא. לאחר המעבר דרך הגלאי, תאים עם אותו פנוטיפ מעניין מופנים לעבר צינור איסוף ייעודי המבוסס על מטען חשמלי.
FACS מיושם באופן נרחב במחקרים שונים כל עוד האוכלוסייה להעשרה מסומנת בפלואורסצנטיות. 3-7 הוא שימש להפרדת חיידקים מצופים אימונוגלובולין (Ig)A מחיידקים שאינם מצופים IgA במיקרוביוטה של המעי 8 ולמיון אוכלוסיות תאים מהונדסות גנטית המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים. 9 חשוב לציין, יש לו את היכולת להפריד יותר מאוכלוסייה אחת בו זמנית, מה שלא רק חוסך זמן וריאגנטים אלא גם מאפשר עיצובי מחקר מתוחכמים יותר. 10 עם זאת, ל-FACS יש גם מגבלות. אם אוכלוסייה מעניינת נדירה מאוד (פחות מ-1%), יעילות המיון עלולה להיות מופחתת, ולגרום לאובדן תאים משמעותי. בנוסף, קשירת נוגדנים מסוימת עשויה להפעיל העברת אותות תוך תאית הגורמת לשינויים תפקודיים של אוכלוסיית התאים הממוינים. 11 לכן, יש לבחור בקפידה את הפנוטיפ המשמש למיון. 
קיימות שיטות אחרות מלבד FACS המבוססות גם הן על סמני פני התא להעשרה של אוכלוסיות תאים ספציפיות, כגון מיון תאים מופעל מגנטית (MCS). 12 בדומה ל-FACS, נוגדנים מצומדים לחרוזים מגנטיים יכולים לכוון למולקולות ספציפיות על פני התא. באינטראקציה של נוגדן-אנטיגן, ניתן להפריד תאים מצופים חרוזים מגנטיים מתאים שאינם מצופים לאחר שעברו דרך שדה מגנטי. עם זאת, ניתן למקד רק מספר מוגבל של מולקולות ב-MCS, מכיוון שחרוזים מגנטיים, בניגוד לצבעים פלואורסצנטיים שונים ב-FACS, אינם ניתנים להבחנה. לכן קשה ל-MCS להגדיר פנוטיפ תא עם שילוב מסובך של סמני פני השטח. 13,14 בנוסף, MCS מסוגל גם לגרום להפעלה לא מכוונת של תאי מטרה.
במחקר שלנו על מודל עכבר של זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), 15 התכוונו לטהר תאים דנדריטיים של פלסמציטואיד (pDC) כדי לחקור את השינויים התפקודיים שלהם עם התקדמות המחלה. השתמשנו לראשונה ב-MCS כדי להעשיר pDC ממח העצם על ידי התמקדות ב-PDCA-1, מולקולה המתבטאת באופן גבוה וייחודי ב-pDC של עכברים במצב יציב. 16 עם זאת, טוהר התאים היה נמוך באופן בלתי צפוי, ככל הנראה בשל הוויסות המוגבר של PDCA-1 על אוכלוסיות תאים אחרות בסביבה דלקתית כמו זאבת. 16 בסופו של דבר, השתמשנו ב-FACS עם שילוב של ארבעה סמני משטח (CD11c, CD11b, B220 ו-PDCA-1) כדי להפריד pDC בטוהר גבוה כאוכלוסיית CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+. לעכברים pDC יש סמן משטח ספציפי נוסף: Siglec-H. החלטנו לא להשתמש ב-Siglec-H, מכיוון שקשירת נוגדנים של מולקולה זו מדכאת את התפקוד של pDC לייצר IFNα. 11

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>ג'יבקו מבית Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>ג'יבקו מבית Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>ג'יבקו מבית Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco מבית Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>GIBCO של Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>ג'יבקו מבית Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו מבית Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1x Hank' s תמיסת מלח מאוזנת&nbsp;</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>שיפוע צפיפות בינוני</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD19-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11c-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11b-APC-CY7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר PDCA-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-3172-81</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר B220-V500&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561226</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאים דנדריטיים פלסמציטואיד II, עכבר</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria I ציטומטר זרימה&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>643178</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva גרסה 6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) היא טכניקה לטיהור אוכלוסיות תאים ספציפיות על סמך פנוטיפים שזוהו על ידי ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להבין טוב יותר את המאפיינים של אוכלוסיית תאים בודדים ללא השפעה של תאים אחרים. בהשוואה לשיטות אחרות להעשרת תאים, כגון מיון תאים מופעל מגנטי (MCS), FACS גמיש ומדויק יותר להפרדת תאים בשל היכולת לזהות פנוטיפ על ידי ציטומטריית זרימה. בנוסף, FACS מסוגל בדרך כלל להפריד אוכלוסיות תאים מרובות בו זמנית, מה שמשפר את היעילות והגיוון של הניסויים. למרות של-FACS יש כמה מגבלות, הוא שימש באופן נרחב לטיהור תאים למחקרים פונקציונליים הן במבחנה והן ב-vivo. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול המשתמש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות כדי לבודד אוכלוסייה נדירה מאוד של תאים חיסוניים, תאים דנדריטיים פלסמציטואידים (pDC), עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברים המועדים לזאבת למחקרים פונקציונליים במבחנה של pDC.

החוקרים בקשו להעשיר מח עצם PDC עם טוהר גבוה, וללא השפעת סוגי תאים אחרים, מן MRL / LPR נוטה זאבת עכברי שניהם בגיל צעיר ומבוגרים ללמוד את השינויים התפקודיים של PDC באשר ליכולתם לייצר IFNα. אסטרטגית הטיהור הראשונה השתמשה הייתה MCS, אשר, כפי שמראה איור 1, הוביל רק 7.75 טוהר% לאחר העשרה. לעומת MCS, FACS מועשר PDC עם טוהר גבוה ככל 96.4%. כדי להבטיח טוהר גבוהה, אסטרטגיה gating צעד-אחר-צעד בוצע. כפי שניתן לראות בתרשים 2, ת...

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבודד תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים, או PDC, בדרגת טהרה גבוהה ממוח העצם של עכברים הנוטים ללופוס, לצורך חקר תפקודם. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות למאפיינים של אוכלוסיית תאי חיסון מסוימת, כגון PDC המייצרים אינטרפרון אלפא בשלב מאוחר של התפתחות הלופוס. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להעשיר אוכלוסיית מטרה אחת או מספר אוכלוסיות לרמה של טהרה גבוהה יותר מאשר במיון באמצעות חרוזי מגנט.לאחר הקצירה, העבירו את עצמות הגפיים האחוריות ו-4 milliliters של מצע מלא למכתש. הוסיפו 6 milliliters של מצע מלא טרי כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 milliliters. רסקו את העצמות בעדינות באמצעות עלי. ערבב בעדינות בעזרת העלי, כדי לשחרר את מחית העצם. לאחר מכן, העבר את כל המצע דרך מסננת של 70 micron אל תוך מבחנה קונית של 50 milliliter על קרח. הוסף 10 milliliters של מצע מלא רענן אל המכתש.סננו את הנוזל העליון פעמיים נוספות עד שהעצמות ייראו לבנות. לאחר מכן, סבבו במצנטריפוגה את תאי מח העצם, ותלה את המשקע ב-10 milliliters של מצע מלא טרי. לאחר מכן, הניחו את התאים בשכבה מעל חמישה milliliters של מצע מדרג צפיפות שהוכן טרי בתוך מבחנה קונית של 15 milliliters, תוך הקפדה לא להפר את השכבות.הפרידו את התאים באמצעות סבוב (centrifugation). לאחר מכן, הסירו בזהירות את שמונת המיליליטרים העליונים של התמיסה, ואספו את שכבת ה-buffy coat בנפח של שני מיליליטר מהממשק (interphase). הוסיפו 12 מיליליטר של מצע גידול מלא קר (ice-cold complete medium) לתאים החד-גרעיניים שבודדו, וסגרו את המבחנה כדי לערבב באמצעות היפוך.לאחר מכן, השקיעו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה. לצביעת התאים עבור FACS, השעיו אותם מחדש ב-100 µL של נוגדן חוסם CD1632FC בטמפרטורה של 4 °C. לאחר 10 דקות, שטפו את התאים ב-4 mL של בופר מיון קר מאוד וסמנו את התאים עם 100 µL של תערובת נוגדני צביעה מתאימה לפני השטח של התא.למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך. שטפו את התאים בארבעה מיליליטר של בופר מיון קר מאוד כדי להסיר נוגדנים מצומדים לפלואורסצנציה שאינם קשורים. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-500 מיקרוליטר של תמיסת טעינה ל-FACS והעבירו את הדגימה לשפופרת FACS על קרח.כדי לצבוע את בקרות הפיצוי, העבירו מנה של 10⁶ splenocytes לכל מבחנה. שטפו את התאים עם 4 milliliters של sorting buffer והשעיו את המשקעים ב-100 microliters של sorting buffer. לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן המשולב עם הפלואורוצרום המתאים מתוך תערובת נוגדי השטח של התאים לכל מבחנת פיצוי תואמת, ונערנו את המבחנות לערבוב.לאחר 15 דקות בחושך, בטמפרטורה של 4 °C, שטפו את כל הדגימות בבופר מיון (sorting buffer) ותלו את המשקעים ב-500 µL של בופר מיון קר מאוד. למעט מבחנת ה-DAPI, אותה תלו ב-500 µL של תמיסת טעינה ל-FACS. כדי לטהר את אוכלוסיית תאי המטרה באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), הניחו מבחנות איסוף המכילות 500 µL של FBS בתוספת אנטיביוטיקה מתחת לשסתומי המיון.בשלב הבא, טענו את המבחנה ללא הצביעה ואספו 10, 000 אירועים כדי לקבוע את השער השלילי (negative gate) עבור כל עוצמת פלואורסצנציה. אספו 10, 000 אירועים ממבחנות הפיצוי לצביעה בודדת כדי לקבוע את השער החיובי (positive gate) עבור כל עוצמת פלואורסצנציה. אספו 3, 000 אירועים מהדגימה הניסיונית כדי לקבוע את השערים של אוכלוסיית התאים הממוינת.השתמש בעצמות הפלואורסצנציה כפרמטרים של צירי ה-X וה-Y בגרף כדי לבצע סינון ידני (gating) של אוכלוסיית תאי המטרה. לאחר מכן, מיין את אוכלוסיית תאי המטרה לתוך מבחנת האיסוף. בסיום המיון, הוסף עד ארבעה milliliters של מצע גידול מלא מקורר על קרח לתאים.לאחר מכן, סגרו את המבחנה וערבבו את התאים על ידי הפיכה. השקיעו את התאים המזוהים באמצעות צנטריפוגציה, ושאבו את כל הנוזל העליון למעט 200 µL האחרונים. לאחר מכן, השביו את המשקע למצב של סספנסיון ב-1 mL של מצע מלא קר מאוד (בטמפרטורת קרח) והעבירו את התאים למבחנת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL לצורך סבב צנטריפוגציה שני.לבסוף, שאבו את כל הנוזל העלון למעט 100 microliters האחרונים, ואחסנו את אוכלוסיית התאים הממוינת על קרח עד לשימוש. מיון תאים מפעיל באופן מגנטי (MACS) של תאי דנדריטיים פלזמציטואידיים ממוח העצם של עכברים הנוטים ללופוס מביא לטוהר של 7.75% בלבד לאחר ההעשרה. לעומת זאת, תאים דנדריטיים פלזמציטואידיים שהועשרו באמצעות FACS מראים טוהר גבוה של עד 96.4% לאחר המיון.כדי להבטיח רמה גבוהה של טוהר, תאי מח העצם המונונוקליאריים עוברים תחילה סינון (gating) והפרדה משאריות (debris) על בסיס פרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter). באמצעות השוואה בין רוחב הפיזור הקדימה לגובה הפיזור הקדימה, ובין רוחב הפיזור הצידי לגובה הפיזור הצידי, התאים הבודדים עוברים סינון נוסף כדי למנוע אותות חיוביים כוזבים הנוצרים על ידי צברים (aggregates). תאים בודדים חיים השליליים ל-DAPI עוברים לאחר מכן סינון על בסיס ביטוי שטח של CD11c חיובי ו-CD11B שלילי, מה שמאפשר סינון נוסף של אוכלוסיית תאי הדנדריטים הפלסמציטואידיים של מח העצם, שהם המטרה, המאופיינים כחיוביים ל-B220 ו-PDCA-1.אוכלוסיית ה-PDC הממוינת היא לא רק בדרגת טהרה גבוהה, אלא גם תקינה מבחינה תפקודית, עם יכולת לייצר IFNalpha בעקבות גרייה של CPG in vitro. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשבור את העצמות ולערבב בעדינות את מחית העצם המשוחררת כדי לשמור על חיוניות התאים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף RNA או תרבית וגרייה in vitro, כדי להשיב על שאלות נוספות לגבי ביטוי הגנים או התפקוד של אוכלוסיות התאים המועשרות.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרי PDC לבחון את תפקידה של תא רב-עוצמה זה בהתפתחות של לופוס ובמודלים של עכברים הרגישים ללופוס. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הבידוד של אוכלוסיית PDC בדרגת ניקיון גבוהה ממוח העצם של עכברים הרגישים ללופוס.

fluorescence-activated-cell-sorting-for-purification-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

עבור מחקרים מדעיים רבים הדורשים ניתוח ביולוגי וכימי של אוכלוסיות תאים תאים חייב להיות במצב גבוה של טוהר. תא Fluorescence מיון מופעל (FACS) היא שיטה מעולה בו כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

זוהי שיטה מהירה ומקיפה של immunophenotyping מיאלואידית תאים מדכאי נגזרות (MDSC) ומעשירה...

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה ליצירת תאים דנדריטיים פלסמקיטואידים (pDCs) מתאי אב לימפואידים נפוצים (CLPs). לאחר תרבית משותפת של CLPs מטוהרים עם תאי הזנה מוקרנים γ בנוכחות ליגנד טירוזין קינאז-3 דמוי FMS (FL), CLPs מתמיינים ל-pDCs שאינם דבקים, שנוכחותם מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה.

דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

במחקר זה אנו מציגים מערכת תרבית במבחנה שיכולה לייצר ביעילות pDCs על ידי תרבית משותפת של אבות לימפואידים נפוצים עם תאי הזנה AC-6 בנוכחות ליגנד Flt3.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

למדו לבודד תאי דנדריטים פלסמציטואידים ממח עצם עכברים בעלי נטייה לזאבת באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה. השיטה מספקת טוהר גבוה של 96.4% לניתוח תפקודי של תאי PDC וייצור אינטרפרון אלפא.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

גלה סרטונים נוספים