Name: הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: למדו הכנת סיבי קולגן ואלאסטין ממטריקס תאי לספקטרוסקופיית ברילואן. שיטה זו מאפשרת ניתוח מכני מלא ללא צורך במדידת מקדם השבירה מראש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה [מספר מענק EP/M028739/1]. RSE נתמך על ידי פרס המחקר לתואר שני של סנטנדר לשנת 2015.

זהירות: יש להתייעץ פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים וכל גיליונות נתוני בטיחות חומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. הלייזר המועסקים ניסויים אלה היא לייזר 3B מחלקה; ועמידה בכללי מקומי לשימוש בטוח של המערכת נדרשת. אנא להשתמש בכל שיטות הבטיחות המתאימות בעת ביצוע מדידת ספקטרוסקופיה ליזר כולל השימוש בציוד מגן אישי (משקפי בטיחות). גידי זנב התקבלו חולדות Wistar ישנות 7-8 בשבוע המורדם למטרות אחרות בהתאם לתקנות איחוד אירופאיות 1099/2009 ורווחת בעלי החיים (שחיטה או הריגה) לתקנות 1995. רצועות עורפיות השור התקבלו מטבחיים מקומי. 1. הכנת סיבים לדוגמא הערה: סיבי חלבון של מטריקס ניתן לחלץ מרקמות שונות, באמצעות הליכים שונים. פרוטוקולים זוקקו בהתאם לנהלים מיושמים באופן נרחב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><strong&gt; הפקת סיבי קולגן מזנב עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכברוש ידי הזרקה תוך הצפק של 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג של pentobarbitone נתרן משקל הגוף. ואז לנתק את הזנב ישירות בנקודת המגע עם הגוף, לחיצה עם סכין גילוח חד בקצה. עוטפים את הזנב בניילון ולאחסן קפוא זה ב -20 ° C עד הנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף בזנב מהמקפיא, לחתוך קטע ארוך 20 מ&quot;מ מהקצה הפרוקסימלי תוך עדיין קפוא ואז להשאירו להפשיר בצלחת פטרי מלאות בופר פוספט (PBS) פתרון (pH 7.4) בשעה RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזנב הוא מופשר, עושים חתך לאורכו של קטע באמצעות אזמל לפצל את העור. ואז לקלף בחזרה לחשוף ארבע צרורות גיד עטופות על חולית הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר נזהרים שלא חל כל-זן מראש, בעדינות לצייר כל סיב מתוך מעטפת ולמקם אותו בקבוקון המכיל מים מזוקקים עם 0.01% w / v אזיד הנתרן (NaN 3) יחסי ציבוראירוע התפתחות חיידקים, ולאחסן בקירור. זנב יחיד מניב סביב שלושים סיבי הגיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל סוג סיבי טהור שאני קולגן, להחיל תהליך עיכול אנזימטי שלושה חלק 10 לסיבי הגיד להסיר את proteoglycans וכל חומר noncollagenous אחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לטבול את הסיבים 0.125 U / ml chondroitinase ABC ב 0.05 חיץ M טריס ו 0.06 M נתרן אצטט (CH 3 COONa) ב- pH 8.0 למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממה רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לטבול את הסיבים 1 U / ml hyaluronidase Streptomyces 0.05 חיץ M טריס ו 0.15 M נתרן כלורי (NaCl) ב- pH 6.0 ולחזור אל האינקובטור רעד במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לטבול את הסיבים 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל של טריפסין ב 0.05 M פוספט נתרן (NaHPO 4) ו 0.15 M NaCl ב- pH 7.2 עבור 16 שעות בחממה רועד ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את סיבי מטוהרים המצוננים בקבוקונים המכילים מים מזוקקים, wi0.01 ה% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים, עד הנדרשים למדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת סיבי האלסטין מן הרצועה עורפית שור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג רצועה עורפית שור מן מטבחיים, לעטוף אותו בניילון ולאחסן קפוא זה ב -20 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר אלסטין טהור, לאסוף את הרצועה מהמקפיא, לאפשר לו להפשיר ב RT, defat זה באמצעות אזמל ולעכל את הרצועה באמבט מים רותחים על פי הנוהל Lansing, 11 כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1 M פתרון של נתרן הידרוקסידי (NaOH) במים מזוקקים ולהוסיף אותו הרצועה הנטולה השומן בבקבוק חרוטים, מכסה את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיח את הבקבוק בתוך אמבט מים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרצועה מבקבוק העיכול ולשטוף את גוש הרקמה המסיס במים מזוקקים מספר פעמים עד pH 7.0 (פיקוח באמצעות מד pH) מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הרקמה מהגמרלשטוף פתרון לצלול אותו במים מזוקקים (מעורבב עם 0.01% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים) במיכל אטום ולאחסן אותו בקירור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את רקמות מהמקרר, נזהרים שלא להפעיל כוח רב מדי-זן מראש, פינצטה שימוש למשוך פלחי ואלסטין קטן בעדינות (20 עד 50 מ&quot;מ אורך, בערך 2 מ&quot;מ עובי) הרחק בלוק גדול יותר ומניחים אותם בצלחת פטרי עם פתרון PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להקניט צרורות סיבים קטנים סביב 1 מ&quot;מ עובי וחותכים אותם באורכים של כמה מ&quot;מ באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את סיבי כדי בקבוקונים המכילים מים מזוקקים (עם 0.01% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים) ולאחסן בקירור אותם עד הנדרשים למדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת הסיבים על מצע רעיוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותך יהלומים, לחתוך חתיכה של שקופיות סיליקון רעיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור compartme hydratedNT, לחתוך רצועה של Parafilm כדי להתאים את השקופית סיליקון עם חתך חלול במרכז (גדול מספיק כדי להתאים סיב) ולמקם אותו על גבי המצע סיליקון. הערה: עבור מדידות סיבים יבשות, לחתוך את parafilm לתוך צורת U כך שאחד מארבעת הצדדים נשאר פתוח לאוויר כאשר אטום בשלב 1.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסיבים מהמקרר, להשתמש זוג מלקחיים בסדר לאסוף סיב בודד מפתרון האחסון ומניח אותו בצלחת קטנה פטרי מלא מים טהורים ב RT במשך 5 דקות כדי לשטוף את המדגם. לאחר מכן, לאסוף את הסיב ולהעבירו למרכז החלול parafilm על פני מצע סיליקון. זהירות: למנוע נזק סיבים ידי מותח אותו במהלך פעולה זו, ולהימנע לצידוד המדגם על פני המצע, מכיוון שהדבר עלול לגרום לשינוי תכונות מכניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח coverslip זכוכית דק על הסיבים ולאטום את החדר על ידי עובר מלחם מחומם בעדינות על משטח הזכוכית כדי להמס את parafilm מתחתהזכוכית. זהירות: למנוע נזק סיבים לא להביא למצב קצה הלחמה קרוב מדי או חימום המצע מוגזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התא האטום על משטח שטוח תחת משקל קטן ולהשאיר אותה במשך כ -12 שעות כדי להשיג קשר טוב בין המצע המדגם סיליקון, תוך הימנעות ניזק הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשקל ולאבטח את התא במקום על פני המצע, באמצעות ברגים. </li></ol></li></ol> 2. הגדרת הניסוי ברילואן ורכישת סיבים ספקטרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תא מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מדגם מוכן כמו חלק 1.3 על בעל אנכי מצויד goniometer לאפשר סיבוב מטוס של המדגם תוך שמירה על זווית פיזור קבוע (2 Φ = 90 °, ראה איור SI-1) ופיזרו עמדה נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע התאמה מדויקת להתמקד של אור הליזר על המדגם דרך leננו-שניות. 9 זהירות: הכוח פלט לייזר עשוי להיות גבוה מדי ולייצר כוויה במדגם. ודא כי הוא מוגדר גבוה מספיק כדי לתת רגישות טובה אך לא גבוהה מדי כדי למנוע נזק המדגם. כאן השתמשנו כוח של CA. 76 mW על המדגם. זה היה מספיק כדי לקבל רגישות טובה בלי לשרוף את המדגם, גם בהתחשב שמדובר דק במגע עם מצע מסייע שמגרש את החום שנוצר על ידי תאורת ליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המדגם בזווית של 45 מעלות (Φ) אל קרן הלייזר האירוע באמצעות סולם Vernier. להשיג מיצוב אופטימלי על ידי הפעלת מדידה למקסם את עוצמת הפסגות בספקטרום (ראה להלן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ספקטרומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה לרכישה ומניפולציה של הנתונים ולהגדיר את רכישת ספקטרום ברילואן של המדגם 12. ההליך המתואר כאן חל על muאינטרפרומטר טנדם ltipass (איור SI-1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את השנייה פברי פרו- (FP) התאבכות שינוי המתח עצמאי להחיל את פייזו ידי יחידת הבקרה. עבור הליך טרום יישור זה, מלאו אחר האור המוחזר על ידי כל FP. כאשר עוצמת שמשתקף שני FPS שואף לאפס, את היישור הנכון הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול הספקטרום: טווח התדרים נגישים, או בטווח הספקטרום חינם (FSR), תלוי את המרחק בין שתי מראות של חלל FP הראשון, L, דרך FSR = c / 2 L, כאשר c היא מהירות האור L נמדדת על ידי מד חיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנכרן את הסריקות של שתי התאבכות FP ולעבור המערכת האופטית לתצורת multipass טנדם. פקד משוב של עוצמת אור הליזר מועברת אוטומטית ישמור על היישור של שני FPS במהלך המדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידת רמת נוזלf ברילואן ספקטרה זהירות: הספקטרום ברילואן תלוי מאוד הטמפרטורה הידרציה של המדגם ובקר כה נזהר בפרמטרים הוא מפתח להשגת ספקטרום לשחזור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל רכישת ספקטרום ברילואן של המדגם ולהפעיל אותו עד יחס אות לרעש טוב מושגת. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם חתך פיזור, הריכוז והעובי של המדגם. הערה: אין כלל אצבע עבור יחס אות לרעש אבל האיכות ספקטרלי נבדקת על ידי בניסויים על פי המדגם המבוקש המנותח. יש trade-off בין איכות רפאים ומשך המדידה, ולכן הפרמטרים הניסיונות צריכות להיבחר בהתאם ליישום הספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המדידה של דגימות יבשות, את הספקטרום רצוף - עבור כל אחד מהם, לאחר שלב 2.3.1 - עד אין שינויים במצב של הפסגות iים שנצפה. זו מושגת כאשר המדגם הוא בשיווי משקל עם האווירה בחדר ולא ייבוש נוסף ישפיע על הספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קיטוב האור (VV או VH; V מייצג אנכיים H עבור הכיוון האופקי של יחסי קיטוב האור לכדור פיזור) ולרכוש ספקטרום בכל זווית לציר סיבים (θ; איור SI-1) על ידי החלפה של מדגם מטוס ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הספקטרום ברילואן להגיש לעיבוד שלאחר מכן. </li></ol></li></ol> 3. ניתוח של ברילואן ספקטרה הערה: ניתוח Fit של פסגות ברילואן ניתן לבצע באמצעות פונקציות שונות. מתנד הרמוני דיכא (DHO) 4,13 פונקציה נבחר זהו מודל תקף פסגות שמקורם מצבי אקוסטי דיכא במדיה viscoelastic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח Fit של פסגות ברילואן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את טווח הספקטרום עבור השיא של עניין הדואר ספקטרום ברילואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר בסיס ב בכושר אם ברקע ספקטרלי הוא הרבה יותר גבוה מאפס. הערה: הבסיס יכול להשתנות בין ספקטרומים. ודא כי התיקון מיושם באופן שיטתי לשחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח ריבועים מפורטים לפחות הולם באמצעות פונקציה DHO 4,13 אל פסגת ברילואן עניין איטרטיבי עד ההתכנסות מושגת ואת עקומת ההתאמה האופטימלית מתקבלת. כעת שמור את התוצאות לנכון להגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ערכים ממוצעים מהפרמטרים ההתאמה של שני שיאים של כל כפיל ברילואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את מהירות גל אקוסטי מתדירות השיא (באמצעות הביטוי להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את תוצאות בכושר באמצעות גרפים, למשל, מהירות גל אקוסטי לעומת זווית לציר סיבים, θ , ולהחיל מודלים רלוונטיים (למשל, עבור מערכות איזוטרופי אקוסטית 9) כדי לחלץ כמויות מכאניות כגון מקדמי מותח גמישות. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+de+la+lumi%C3%A8re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog%C3%A8ne%3B+influence+de+l%27agitation+thermique%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li>
<li>Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+effects+on+the+elastic+properties+of+amorphous+polymeric+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials.</a> J. Chem. Phys. 141 (21), 214901(2014).</li>
<li>Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+spectroscopy+of+weakly+interacting+mesoscopic+colloids%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids.</a> Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).</li>
<li>Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aComez%2C+L+%22Solid+State+Physics%22">Solid State Physics</a>. Robert, E. C., Robert, L. S. 63, Academic Press. 1-77 (2012).</li>
<li>Madami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+a+propagating+spin+wave+induced+by+spin-transfer+torque%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).</li>
<li>Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phonons+and+the+elastic+moduli+of+collagen+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle.</a> Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).</li>
<li>Cusack, S., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+elastic+constants+of+collagen+by+Brillouin+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering.</a> J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).</li>
<li>Vaughan, J. M., Randall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brillouin+scattering%2C+density+and+elastic+properties+of+the+lens+and+cornea+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye.</a> Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).</li>
<li>Palombo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+fibrous+proteins+of+the+extracellular+matrix+studied+by+Brillouin+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).</li>
<li>Sivan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+accumulation+of+pentosidine+in+aggrecan+and+collagen+from+normal+and+degenerate+human+intervertebral+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs.</a> Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).</li>
<li>Leon, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoskel%2C+NT+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 144, Academic Press. 196-214 (1987).</li>
<li>Fioretto, D., Scarponi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+glassy+polymer+studied+by+Brillouin+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering.</a> Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).</li>
<li>Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+with+chemical+specificity+by+confocal+Brillouin+and+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy.</a> Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).</li>
<li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistage+VIPA+etalons+for+high-extinction+parallel+Brillouin+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy.</a> Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).</li>
<li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Measurement+of+Age-Related+Stiffening+in+the+Crystalline+Lens+by+Brillouin+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy.</a> Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li>
<li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Brillouin+optical+microscopy+of+the+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye.</a> Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ספקטרוסקופיה ברילואן הפיזור היא כלי ייחודי שבו הרכיבים הבודדים של מותח האלסטיות של סיבי חלבון ניתן לאפיין בפירוט חסר תקדים. יתר על כן, המדידות יכולות להתבצע על בקנה מידה מיקרוסקופי ובכך תספקנה לנו תובנה רומן לתוך מכניקת מייקרו בקנה המידה של מבנים ביולוגיים, מה שמאפשרים לנו, בפעם הראשונה, כדי להבין את המכנים, וכנראה תפקודי, משמעות של המורכבויות באדריכלות וביוכימיה מטריקס אשר נחשף בשנים האחרונות. הטכניקה מודדת תכונות מכאניות בתחום תדרי GHz. תחום זה לא נחקר לפני עבור biopolymers מבני וזה הוא מעלה מספק את האמצעים כדי לענות על שאלות בסיסיות אודות מנגנונים מולקולריים של גמישות. תיארנו את השלבים הדרושים כדי לחלץ סיבי קולגן ואלסטין מרקמות של בעלי חיים כדי למדוד ברילואן scattering ספקטרום באמצעות מצע רעיוני כדי להשיג את התיאור המלא של ביומכניקה סיבים. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם אלה המבטיחים כי סיבי מטוהרים מתקבלים תנאי ניסוי מתאימים נמצאים במקום למדידות לשחזור של החלבונים הסיביים. עם זאת, הוא חייב לזכור כי הליכי המיצוי רשאיים לשנות את התכונות המכאניות של הסיבים. שינויים של הטכניקה כרוך הצימוד עם מיקרוסקופיה אופטית עבור פיזור ברילואן microfocused ומיפוי מתקרב 13 ואת השילוב האפשרי עם טכניקות משלימות (למשל, פיזור ראמאן). יישומים נוכחיים של הטכניקה הם התמקדו בעיקר חומרים ביולוגיים ניכרים, אבל התפתחויות חשובות, למשל, אלה המבוססים על etalons VIPA מספר 14, עושים אפשרי התרגום של טכניקה זו מן המעבדתיים אל מיטתו עם מגוון רחב של יישומים כבר שדstrated 15,16 כולל פוטנציאל ביישומים vivo. גישת VIPA מהווה חלופה למה שאנו מתארים; יש לו זמן רכישה מהר אבל אינו מתאים בהכרח במקרה של דגימות אטומות כגון אלה נתחו כאן. יתר על כן, השימוש מצע רעיוני אינו מעשי קופצים להגדיר המשתמשות etalons VIPA כי בניגוד שלהם לא יהיה מספיק כדי לדחות את האור מעין-אלסטי. מגבלות הקשורות למהירות של רכישת מערך נתונים ספקטרליים ואת חתך פיזור החלש מטבעו של החומר עלולות להגביל יישומים למערכות ביולוגיות דינמיות לרכישת נתונים ממעמקי רקמות, אבל חידודים טכניים עשויים לשפר על ביצועים נוכחיים. BLS מבטיח להיות כלי מרכזי במחקר ביו-יסודי על תאי מטריקס ובכך לייצר תובנות חדשות אודות האבולוציה של תכונות מכניות במהלך הצמיחה מטריקס ההפסד שלהם פתולוגינִווּן. עם זאת, חשוב לזכור כי המדידות הן לא פולשנית, ולפיכך עלולה להתבצע in vivo. ואכן, זה כבר הושג בתוך הקרנית 16 ו עבודה כזו עשויה לספק פלטפורמה לפיתוח כלי אבחון חדש עבור מגוון רחב של הפרעות רקמות חיבור. elastography אולטראסאונד במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הם שיטות חלופיות המדידה micromechanical, אבל הטכניקה BLS מציעה רזולוציה מרחבית טובה יותר (בסולם subcellular) מאשר לשעבר, ובניגוד AFM, מטילה שום כוחות מכניים על הדגימה אינו מוגבל הניתוח רק של תכונות פני השטח. moduli ברילואן של קולגן ואלסטין הם בטווח GPA, תוך moduli של צעירים זנים מקרוסקופית הם בסדר גודל של מגפ&quot;ס (לפרטים נוספים ידווחו במקום אחר). תוצאה זו מצביעה על מודולוס הפרש אלסטי עם תלות חזקה על תדר העירור, בשלהתנהגות viscoelastic של הסיבים. BLS ניתן ליישם במגוון רחב של בעיות וחומרים במדעים ביו. זה יכול לעזור לענות על שאלות על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות ביולוגיות, כמו גם לספק כלי פיזי עבור הבנה בסיסית של חומרים ואינטראקציות ברמה המולקולרית.

פיזור אור ברילואן (BLS) האפקט התגלה על ידי לאון ברילואן בשנת 1922. 1 הוא מורכב של הפיזור הקשיח של אור הנראה על ידי פונונים אקוסטי מופעלים תרמית בחומר. בפיסיקה של מצב מוצק, פונונים אקוסטי הן תנודות קוהרנטית של כל האטומים בסריג. שרשרת חד ממדית של שני סוגי לסירוגין של אטומים בסריג היא מודל פשוט הממחיש את ההבדל בין פונונים אקוסטית, נחשפו על ידי BLS, ו פונונים אופטי, נחקרו על ידי קליטת IR ו פיזור ראמאן (איור 1). פונונים אקוסטיות נמצאים פאזיים תנועות של אטומים בשרשרת עם תזוזה לאורך כיוון התפשטות (פונונים אקוסטי האורך) או בניצב לכיוון התפשטות (רוחבי פונונים אקוסטית), תוך פונונים אופטי הם מחוץ פאזיים תנועות של אטומים הפקת מומנט דיפול חשמלי נדנוד (אורך או מצבים רוחביים). spectro BLSscopy נעשה שימוש במדע אנליטיים מאז 1920; עם זאת, רק מאז 1980 יש מדידות ניגודיות גבוהה התאפשרה הודות לשימוש ספקטרומטר פברי פרו- multipass טנדם. מאז, מספר גדל והולך של ההתקדמות BLS עבור יישומים אנליטיים החומר המעובה (שבו האינטראקציה-פונון פוטון מנוצלת) 2-4 ומגנטיות חומרים (באמצעות אינטראקציה פוטון-מניון) 5 הובא על. עבודות הזרע על יישומים ביו 6-8 סללו את הדרך לפיתוח גישות שונות, כולל אחת מיושם פה אחד שתואר לעיל 9 באמצעות מצע רעיוני בתצורה דמוי טסיות להשיג את התיאור המלא של מותח גמישות דוגמית. בעבודה הנוכחית, אנו מיישמים ספקטרוסקופיה BLS אל מרכיביו הבסיסיים של תאי מטריקס ברקמות חיבור, החלבונים הסיביים אלסטין Type I-קולגן. Type לי קולגן הוא מולקולת סליל נוקשה, משולשת אשר מרכיבה רוחבי longitudinally עם לחצות קישור נרחב ליצירה סיבית נוקשה למעשה ברקמות כגון גידים. רשתות של קולגן שלרוב מתקיימות עם רשתות של אלסטין, חלבון אשר, באופן יוצא דופן, יוצר גמישות לטווח ארוך באמצעות שילוב של אנטרופיה אינטראקציות הידרופוביות עם הסביבה והוא חיוני לפונקציות של רקמות כגון ריאות ועור. סיבי שניהם מודל באמצעות מודל קריסטל משושה במחקר הנוכחי. 9 בחלק 1, אנו מתארים את הפרוטוקול לחלץ סיבים מרקמות של בעלי חיים כדי להכין את המדגם עבור מדידות ספקטרוסקופיות. בחלק 2, ההליך להקמת המנגנון ברילואן ורכישת ספקטרה מסיבי מוצג. חלק 3 נותן פרטים של ניתוח נתונים להחיל את ספקטרום ברילואן כדי לחלץ את המידע המכאני הרלוונטי הכלול בו. לאחר מכן, תוצאות נציגים מוצגות discusseד.

<table><tbody><tr><td><חזק>כונדרואיטינאז ABC</חזק></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2905</td><td></td></tr><tr><td><חזק>טריס בופר</חזק></td><td>פלוקה</td><td>93358</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נתרן אצטט</חזק></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S608-500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>PBS</חזק></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td><חזק> נתרן אזיד</חזק></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td><>סטרפטומיצס היאלורונידאז&nbsp; </חזק></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H1136-1AMP</td><td></td></tr><<tr><td>חזק>נתרן כלורי</חזק></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td><חזק>טריפסין</חזק></td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' T4665</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נתרן פוספט</חזק></td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' S9638</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נתרן הידרוקסיד</חזק></td><td>Fisher</td><td>Scientific S320-500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מים טהורים</חזקים></td><td>מיליפור</td><td>ZRQS0P3WW</td><td>מיוצר בבית</td></tr><tr><td><חזק>מים מזוקקים</חזקים></td><td>Bibby Scientific Limited</td><td>D4000</td><td>מיוצר בבית ממים דוממים</td></tr><tr><td><חזקים>אוטאטל</חזקים></td><td>מריאל&nbsp;</td><td>J01601A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><חזק>טנדם אינטרפרומטר TFP-1</חזק></td><td>JRS מכשירים מדעיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>מקפיא</חזק></td><td>Lec</td><td>TU55144</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מקרר</חזק></td><td>זנוסי</td><td>ZBA15021SA</td><td></td></tr><tr><td><צלחת חמה>חזקה</חזקה></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SP88857206</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מהדקים</חזקים></td><td>VWR</td><td>241-7311 ו-241-7201</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מעמד מהדק</חזק></td><td>VWR</td><td>&nbsp; 241-0093</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדחום</חזק></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-201-401</td><td></td></tr><tr><td><חזק>סרט נצמד</חזק></td><td>סיינסברי'ס</td><td>7650540</td><td></td></tr><tr><td><חזק>פרפילם</חזק></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td><חזק>סיליקון</חזק></td><td>IDB Technologies</td><td>N/A</td><td>אין קטלוג מספר. הזמנה לפי בקשה.</td></tr><tr><td><זכוכית כיסוי>חזקה</חזקה></td><td>VWR</td><td>631-1571</td><td></td></tr><tr><td><בקבוק חרוטי חזק></חזק></td><td>VWR</td><td>214-1175</td><td></td></tr><tr><td><חזק></חזק></td><td>VWR</td><td>213-0469</td><td></td></tr><tr><td><צילינדר מדידה><חזק/חזק></td><td>VWR</td><td>612-3838</td><td></td></tr><tr><td><חזק>בקבוקון</חזק></td><td>VWR</td><td>548-0051 & 548-0863</td><td></td></tr><tr><td><חזק>פטרי צלחת</חזק></td><td>VWR</td><td>391-0441</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אזמל</חזק></td><td>סוואן מורטון בע"מ</td><td>&nbsp; 0914 & 0308</td><td></td></tr><tr><td><חזק>יהלום סופר</חזק></td><td>RS מכשירים</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ברזל הלחמה</חזק></td><td>RS מכשירים</td><td>231-5332</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מלקחיים עדינים</חזק></td><td>VWR</td><td>232-0188</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כפול מיקרו-מרית</חזק></td><td>VWR</td><td>גדלים</td><td></td></tr> <tr><td>שונים<מד pH חזק></חזק></td><td>Hanna Instruments</td><td>HI-2210-02</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שייקר מסלולי</חזק></td><td>IKA</td><td>&nbsp; </td><td></td>0002819000</tr></tbody></table>

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

ספקטרוסקופיה של ברילואין היא טכניקה מתפתחת בתחום הביו-רפואי. הוא בוחן את התכונות המכניות של דגימה באמצעות אינטראקציה של אור נראה עם גלים אקוסטיים המושרים תרמית או פונונים המתפשטים במהירות של כמה קילומטרים לשנייה. מידע על האלסטיות והמבנה של החומר מתקבל בצורה לא הרסנית ללא מגע, ובכך פותח את הדרך ליישומי in vivo ואבחון פוטנציאלי של פתולוגיה. עבודה זו מתארת את היישום של ספקטרוסקופיה של ברילואין לחקר הביומכניקה באלסטין וסיבי קולגן מסוג I המעוכלים על ידי טריפסין של המטריצה החוץ-תאית. חלבונים סיביים של המטריצה החוץ-תאית הם אבני הבניין של רקמות ביולוגיות וחקירת ההתנהגות המכנית והפיזית שלהם היא המפתח לביסוס יחסי מבנה-תפקוד ברקמות תקינות והשינויים המתרחשים במחלות. נהלי הכנת הדגימה ואחריהם מדידת ספקטרום Brillouin באמצעות מצע רפלקטיבי מוצגים יחד עם פרטים על המערכת האופטית ושיטות ניתוח נתונים ספקטרליים.

אנו מציגים פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיה של פיזור אור Brillouin על סיבי קולגן מסוג I מטוהרים על ידי אלסטין וטריפסין של המטריצה החוץ-תאית כדי לחלץ את מלוא תכונותיהם האלסטיות.

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין דגימה של סיב חלבון של המטריצה החוץ-תאית, קולגן או אלסטין, להצבה בתא הדגימות עבור מדידות ספקטרוסקופיית Brillouin. באמצעות שיטה זו, ניתן להפיק סיבי קולגן ואלסטין של המטריצה החוץ-תאית מרקמות חיבור ממקור חייתי לצורך שימושם במדידות ספקטרוסקופיית Brillouin. היתרון המרכזי של גישה זו הוא שניתן לקבוע באופן מלא את התכונות המיקרו-מכניות של הדגימה ללא ידיעה מוקדמת על מדד השבירה של החומר.בעוד הזנב עדיין קפוא, חתכו סגמנט באורך 20 מילימטר מהקצה הפרוקסימלי והפשירו את הרקמה בצלחת פטרי מלאה ב-PBS בטמפרטורת החדר. כאשר הזנב מופשר, השתמשו בסקאלפל כדי לבצע חתך לאורך הדגימה להפרדת העור, וקלפו את הרקמה כדי לחשוף ארבעה צרורות של גידי מעטפת סביב חוליות הזנב. באמצעות פינצטה עדינה, משכו בעדינות כל סיב אל מחוץ למעטפת והניחו אותם במבחנה המכילה מים מזוקקים בתוספת 0.01% משקל לנפח sodium azide לאחסון בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.כדי להוציא קולגן סיבי טהור מסוג 1, השקעו את הסיבים ב-chondroitinase ABC בבופר tris ובנתרן אצטט למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם ניעור. למחרת, העבירו את הסיבים ל-streptomyces hyaluronidase בבופר tris ובנתרן כלוריד ל-24 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם ניעור. לאחר מכן, השקיעו את הסיבים ב-trypsin בנתרן פוספט ובנתרן כלוריד למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור.ניתן לאחסן את הסיבים המזוהים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במבחנות עם מים מזוקקים בתוספת 0.01% sodium azide עד למועד השימוש. כדי להפיק סיבי elastin מרצועה נחומית של בקר, ראשית יש להסיר את השומן מהרצועה הנחומית של הבקר שהושגה לאחרונה. לאחר הסרת כל הרקמה השומנית, יש להוסיף את הרצועה לבקראכית קונית ולכסות את הרקמה בתמיסת sodium hydroxide במים מזוקקים שהוכנה טרי.הרתיחו את הרצועה באמבט מים בטמפרטורה של 95 °C למשך 45 דקות. לאחר מכן, שטפו את הגוש הבל ממיס מספר פעמים בכלי כימי הממולא במים מזוקקים. כאשר יתקבל pH של 7.0, טבלו את הרקמה במים מזוקקים בתוספת 0.01% sodium azide ואטמו את המכל לאחסון בטמפרטורה של ארבעה °C עד למועד השימוש.לאחר האחסון, השתמשו בפינצטה כדי למשוך בעדינות מקטעי אלסטין קטנים בעובי של כ-שני מילימטר ובאורך של 20 עד 50 מילימטר מהבלוק הגדול. הניחו את המקטעים בתוך צלחת פטרי המכילה PBS והשתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד בעדינות צרורים של סיבים בעובי של כמילימטר אחד מהמקטעים. לאחר מכן, השתמשו בסקאלפל כדי לחתוך את הצרורים למקטעים באורך של מספר מילימטרים, והעבירו את חלקי הסיבים למבחנות של מים מזוקקים בתוספת 0.01% sodium azide לאחסון בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד למועד השימוש.כדי להרכיב את הסיב על תשתית מחזירה, השתמש תחילה בחותך יהלום כדי לחתוך חתיכה משבב סיליקון מחזיר. לאחר מכן, גזור רצועת פארה-פילם (para-film) עם חור במרכזה, הגדול מספיק כדי להחזיק חתיכת סיב, והנח את הפארה-פילם על תשתית הסיליקון. כעת, השתמש בפינצטה עדינה כדי להעביר סיב בודד מתמיסת האחסון בטמפרטורה של 4 °C אל צלחת פטרי קטנה מלאה במים מזוקקים בטמפרטורת החדר.לאחר 5 דקות, העבירו את הסיב השטוף למרכז החלל ב-para-film שעל מצע הסיליקון. לאחר מכן, הניחו כיסוי זכוכית דק מעל הסיב והניחו מלחם חם בעדינות מעל הזכוכית כדי להמיס את ה-para-film שמתחתיה. כדי לאפשר סיבוב של הדגימה במישור תוך שמירה על זווית פיזור ומיקום נפח קבועים, רכבו את הדגימה על תושבת אנכית המצוידת בגוניומטר ומקמו אותה בזווית של 45 מעלות לקרן הלייזר הפוגעת.בסיבי קולגן יבשים בזווית סיבוב ספציפית של אפס מעלות, מודים לונגיטודיים יוצרים שיא מסה (bulk peak) ב-18.92 gigahertz, בעוד שהמודים המקבילים לפני השטח יוצרים שיא ב-9.85 gigahertz. השיא המקבילי לפני השטח זז לתדרים נמוכים יותר כאשר זווית הסיבוב הספציפית מתקרבת ל-90 מעלות, בעוד ששיא המסה מראה הזזה אדומה (red shift) קלה בלבד בעקבות שינוי זווית הסיבוב הספציפית באותו טווח. בסיבי קולגן רטובים, שני השיאים נותרים ללא שינוי מהותי לאורך הניסוי, כאשר שיא המסה נמצא ב-10.5 gigahertz והשיא המקבילי לפני השטח ב-4.9 gigahertz, דבר המצביע על הפחתה של 80 עד 100% בתדר ומסביר את הנוקשות המופחתת של החומר המהומה.באיור זה מוצגת תרשים של מהירות גל אקוסטי של קולגן יבש שהתקבל משיאי מקבילי-פני ורוחביים כפונקציה של זווית הסיבוב הספציפית. בסיבי אלסטין יבשים שנמדדו בזווית סיבוב ספציפית של 0 מעלות, שיא הנפח (bulk peak) מופיע ב-16.8 gigahertz ואילו אופן המקבילי-פני מופיע ב-8.2 gigahertz. לעומת זאת, סיבי אלסטין רטובים מציגים שיא נפח בתדר נמוך ב-37% משיא הנפח של האלסטין היבש, דבר המעיד על ירידה בנוקשות הסיב.בדומה לקולגן יבש, קיימות ראיות לאניזוטרופיה בתכונות המכניות של סיבי אלסטין יבשים, המדגימות את יעילותה של ספקטרוסקופיית ברילואן (Brillouin spectroscopy) בהשגת נתונים רלוונטיים על הקשיחות, ההרכב וההיבטים המבניים של חומרים ספציפיים הנבדקים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת דגימות של סיבי קולגן ואלסטין לבדיקות מיקרו-מכניות המבוססות על ספקטרוסקופיית פיזור אור ברילואן.

preparation-extracellular-matrix-protein-fibers-for-brillouin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

ספקטרוסקופיית ראמאן היא טכניקה מתאימה ללא מגע, תווית ללא ניתוח של תאים חיים, רקמות מהונדסות בונה רקמות מקומיות. מקור ספציפיים טביעות אצבעות ספקטרלית ניתן להפיק נותחו באמצעות ניתוח רב משתני.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

אנו מתארים טכניקה לחריטת סורגי בראג סיבים זהים לכל ליבה של סיב מרובה ליבות. זה מושג על ידי הכנסת משטח נוסף לנתיב האופטי כדי להפחית את העדשה על ידי המשטח המעוקל של חיפוי הסיבים.

כתיבת Gratings בראג בסיבים מרובי-ליבות

nanofibers electrospun יש שטח פנים גבוה יחס משקל, שלמות מכנים מעולה, ולתמוך גדילת תא תפוצה. יש nanofibers אלה מגוון רחב של יישומים ביו. כאן אנו לפברק nanofibers קרטין / PCL, באמצעות טכניקה electrospinning, ולאפיין את סיבי עבור יישומים אפשריים בהנדסת רקמות.

סינתזה של nanofiber קראטין מבוסס על הנדסה ביו רפואית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבנות ספקטרומטר רילואן מהיר. מדורג מערך שלב כמעט צילם etalons (VIPA) להשיג מהירות מדידה יותר מ -1,000 פעמים מהר יותר מאשר ספקטרומטרים פברי פרו- סריקה מסורתית. שיפור זה מספק את האמצעים לניתוח רילואן של רקמה וביו-חומרים בכוח הרמות נמוכות in vivo.

ספקטרומטר תת-GHz מהירות גבוהה לניתוח פיזור רילואן

אנו מתארים את בניית ספקטרומטר (CW-SBS) מהירה continuous-wave-גירוי-ברילואן-פיזור. ספקטרומטר מעסיקה בתדר יחיד דיודות-לייזר, אדי אטומי חריץ-מסנן כדי לרכוש שידור ספקטרום של דגימות עכורים/הלא-עכורים עם רזולוציה גבוהה ספקטרלי-מהירויות של עד 100-fold מהר יותר מאשר אלה של ספקטרומטרים CW-SBS הקיים. שיפור זה מאפשר ניתוח גשמי ברילואן במהירות גבוהה.<br...

ספקטרומטר פיזור מהיר ברילואן מגורה מכ לניתוח גשמי

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

המטרה הכללית שלנו היא להבין כיצד תאים התחושה מסחטות רמזים כי להוביל צמיחה סיבי מכוון. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של adsorption מולקולרית המושרה אור של חלבונים, משמש כדי לייצר מיקרו דפוסים מוגדרים של מטריקס רכיבים מטריצות על מנת ללמוד אירועים ספציפיים השולטים אקסון הצמיחה ואת מציאת.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

מאמר זה מתאר פרוטוקול לאפיון מכני של ספרואידים חיים בתוך מטריצה תלת-ממדית באמצעות מיקרוספקטרוסקופיית ברילואין. שיטה אופטית מלאה זו מאפשרת ויזואליזציה ספרואידית ברזולוציה מיקרוסקאלית ותכונות מכניות כמותיות. גישה זו משפיעה על פנוטיפינג מכני; לדוגמה, קביעת מצבים פתולוגיים של ספרואידים גידוליים בתוך מיקרו-סביבה תלת-ממדית.

מיפוי מכני של ספרואידים באמצעות ספקטרוסקופיית ברילואין

למדו הכנת סיבי קולגן ואלאסטין ממטריקס תאי לספקטרוסקופיית ברילואן. שיטה זו מאפשרת ניתוח מכני מלא ללא צורך במדידת מקדם השבירה מראש.

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

גלה סרטונים נוספים