נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

המטרה הכוללת של מחקר זה היא לתכנת מחדש תאים חד-גרעיניים בדם היקפי לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, באמצעות ציפוי סדרתי על ידי צנטריפוגה. במקור, iPSCs נוצרו על ידי תכנות מחדש של פיברובלסטים. כיום, שונים משמשים לתכנות מחדש.

עם זאת, בגלל הנגישות של הדם, PBMCs יכולים להיות מקור תאים לא מקובל ליישום נוסף של iPSCs, בסינון תרופות, מודלים של תזה ופיתוח רפואה רגנרטיבית. באמצעות המחקר, נשתף פרוטוקול על תכנות מחדש של iPSCs באמצעות PBMCs על ידי הוספת כוח צנטריפוגלי. פרוטוקול זה יספק אפשרות נוספת בעת תכנות מחדש של תאים צפים.

כדי להדגים את הנוהל, נשתמש בנאם, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לבודד את התאים המונוציטים, השג תחילה לפחות עשרה מיליליטר של דם טרי משאיבת דם בצינור הכנת תאים. לאחר מכן, העבירו את הדם לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ודללו אותו עם PBS סטרילי ביחס של אחד לארבעה.

לאחר מכן, הוסף עשרה מיליליטר של מדיית שיפוע צפיפות לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר, ושכב בזהירות את הדם המדולל על גבי מדיית שיפוע הצפיפות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב -750 פעמים גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ללא הפסקת צנטריפוגה. לאחר 30 דקות, העבירו בזהירות את שכבת הבאפי לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר.

הוסף 30 מיליליטר PBS ושטוף את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -515 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו PBS והשעו מחדש את התאים ב-0.5 מיליליטר של מדיה של תאי דם.

לאחר מכן, ספרו את התאים וצלחו אותם בצלחת של 24 בארות. הוסף PBS לבארות שמסביב כדי למנוע אידוי. לאחר מכן, יש לייצב את התאים למשך חמישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני ההעברה.

הוסף תוספת של 0.5 מיליליטר של מדיה של תאי דם טריים ביום השלישי עד הרביעי, מבלי להפריע לתאים. בהליך זה, העבירו את תאי הדם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, וספרו אותם באמצעות המציטומטר. לאחר מכן, הכינו שלוש פעמים עשר עד חמישית תאים להעברה, וצנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 515 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט על ידי יניקה, והשעו מחדש את התאים ב-0.5 מיליליטר של מדיה של תאי דם. לאחר מכן, העבירו את התאים לבאר של צלחת 24 בארות לא מצופה. הפשירו את תערובת נגיף הסנדאי בקרח, והוסיפו אותה לתאים התלויים.

אוטמים את הצלחת בסרט איטום, וצנטריפוגה בחום של 1, 150 פעמים גרם למשך 30 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. כדי לצפות צלחת של 24 בארות בוויטרונקטין, למחרת, יש לדלל את תמיסת הוויטרונקטין ב- PBS כדי לקבל ריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של ויטרונקטין לבאר, ודגרו אותו בטמפרטורת החדר, למשך שעה לפחות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הציפוי, והעביר את כל המדיה המכילה את התאים והנגיף לבאר המצופה. לאחר מכן, אספו את התאים הנותרים עם 0.5 מיליליטר נוספים של תאי דם טריים והוסיפו אותם לבאר המכילה תאים.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב-1, 150 פעמים גרם למשך עשר דקות ב-35 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן, שמרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. להעברת תא שני, יש לצפות את הבאר בחמישה מיקרוגרם למיליליטר ויטרונקטין כפי שתואר קודם לכן. השתמש בבאר אחת של הצלחת לכל התמרה, והעביר את תרחיף התאים מהצלחת הראשונה, לצלחת הוויטרונקטין המצופה החדשה.

בינתיים, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיית iPSC לבאר של הצלחת הראשונה לצורך תחזוקה, ודגרו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני, עם החלפת מדיה יומית עם מדיית iPSC טרייה. המושבות יופיעו ביום ה-14 עד ה-21, לאחר ההעברה. צנטריפוגה הצלחת המצופה החדשה, המכילה את התאים התלויים, ב -1, 150 פעמים גרם ב -35 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות.

לאחר הצנטריפוגה, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני, למשך הלילה. למחרת, הסר את הסופרנטנט והחלף אותו במדיה של תאי גזע פלוריפוטנטיים טריים. שמור על התאים המחוברים עם החלפת מדיה יומית, עד להגעה למפגש של 80%.

שבוע לפני קטיף המושבה, זרעו תא אחד כפול עשרה עד רביעי בצלחת מצופה ויטרונקטין בקוטר 100 מילימטר. לאחר מכן, הכינו צלחת מצופה ויטרונקטין בגודל 60 מילימטר, על ידי הוספת שני מיליליטר תמיסת ויטרונקטין ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות. על ידי התבוננות במיקרוסקופ, סמן את המושבות בתחתית הצלחת בגבולות ברורים באמצעות עט טוש.

הסר את תמיסת הוויטרונקטין מהצלחת החדשה, והוסף שישה מיליליטר של מדיה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, בתוספת עשרה מילי-מולרי RHO קינאז. לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות מהתאים, ושטוף אותם עם שלושה מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק מושבת iPSC, ודגרו עליהם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוציאו את התמיסה מהצלחת, ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות נוספות. לאחר 30 דקות, שאבו 200 מיקרוליטר מדיה מהצלחת, ונתקו את המושבות הממוקדות על ידי פיפטינג. לאחר מכן, העבירו את המושבות המפוזרות לצלחת חדשה של 60 מילימטר.

דגירה ושמירה על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני עד שהם מגיעים למעבר 10. בשלב המוקדם של התכנות מחדש, iPSCs עורבבו עם התאים הממוינים המחוברים שלא תוכנתו מחדש. לפני ההתפשטות, iPSCs ותאים אחרים היו שונים להבחנה.

על ידי זריעת התאים בצפיפות נמוכה, התקבלו מושבות שהיו גדולות מספיק לקטיף. לאחר בידוד המושבה, גושי התאים פורקו לתאים בודדים, ותרבות. מושבות iPSC טהורות נראו לאחר מכן.

לאחר שתאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים הטהורים התרחבו, נבדקה איכות התאים. התאים נצבעו בפוספטאז אלקליין כדי לאשר את המצב הלא ממוין של תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים. מושבות שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיים מבודדים הראו כולן צביעה חיובית.

סמנים פלוריפוטנטיים אושרו על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית. התאים שתוכנתו מחדש סמנים פלוריפוטנטיים בעלי ביטוי גבוה, כגון SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4, והכי חשוב, TRA-1-60, הביטוי של סמנים פלוריפוטנטיים אושר על ידי RTPCR. באמצעות ציפוי סדרתי על ידי צנטריפוגה, הצמדת המעבר משתמשת ב-PBMC על גבי צלחת מצופה מטרית.

החיבורים שם הם כפי שמתוינים, ומושבות iPSC חוזרות על עצמן לטיהור. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לייצר iPSC מ-PBMCs תוך חודש. פרוטוקול זה מפחית את הזמן הנדרש להצמדה של תאים מתמרים ומונע אובדן של תאים מתוכנתים מחדש שלא הצליחו להתחבר בעצמם.

עם זאת, הטיהור של iPSCs יוצרי מושבות שתוכנתו מחדש במלואם יכול להיות קריטי, כאשר מנסים הליך זה. בעבר, תכנתנו מחדש בהצלחה PBMCs ותאים חד-גרעיניים באמצעות פרוטוקול זה. ניתן להשתמש ב-iPCs שמקורם בתאי דם שנוצרו באופן נרחב בתחומי מחקר שונים.

פרוטוקול זה יכול לסייע בתהליך התכנות מחדש של סוגים אחרים של תאי תרחיף צפים, ליישומים ומחקרים נוספים.