מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה בין מארח לפתוגן כגון כיצד פתוגנים חיידקיים גורמים למחלות בבני אדם על ידי שימוש בחלבונים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שזה יכול לענות אם כל פתוגן יכול לנצל Vitronectin לביסוס זיהום של המארח. נתמקד בוויטרונצין, חלבון מארח המשתתף במטריצה החוץ-תאית, אך גם מתפקד כמעכב משלים במסלול הקובע של הפעלה משלימה.

עובדות אלה חשובות מאוד ומושך מאוד עבור פתוגנים גרימת מחלות בבני אדם. כדי להתכונן לציטומטריית זרימה, יש להשתמש שוב כדורי החיידקים עם 50 מיקרוליטרים של חיץ חסימה המכיל 250 ויטרונקטין ננו-מולאר. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות במשך שעה בטמפרטורת החדר מבלי לרעוד.

לאחר הדגירה, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 3, 500 גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן, לשטוף את כדורי שלוש פעמים באמצעות PBS וצעדי צנטריפוגה דומים. לאחר שטיפה, להוסיף 50 microliters של נוגדנים אנטי אנושיים ויטרונצין polyclonal כבשים לכדור חיידקי ב 1 עד 100 דילול ב PBS BSA.

הדגירה ההשעיה במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את החיידקים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר נוגדנים לא מאוגדים. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של PBS BSA המכיל פלואורסין isothiocyanate מצומד נוגדנים נגד כבשים polyclonal גלולה.

דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת בחושך. לבסוף, לאחר שלושה צעדי כביסה, להשתמש שוב גלולה חיידקי עם 300 microliters של PBS ולנתח על ידי ציטומטריה זרימה. כדי להתכונן ל- ELISA, יש לחלק 100 מיקרוליטרים של תות פתרון חלבון לכל באר של צלחת מיקרוטיטר של PolySorp.

סגור את הצלחת עם המכסה ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס לילה כדי להקל על קיבוע של חלבון על בארות צלחת microtiter. השלך את הפתרון מצלחת המיקרוטיטר על ידי הטיה הפוכה מעל הכיור. לאחר מכן, לשטוף את בארות שלוש פעמים עם 300 microliters של PBS לגם.

חסום את הבארים הצפויים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם PBS המכיל נפח של 2.5 אחוזי BSA. לאחר הסרת פתרון החסימה, לשטוף את בארות שלוש פעמים עם 300 microliters של PBST לבא. עכשיו, להוסיף 100 microliters של 50 רקומביננטי nanomolar שלו מתויג PH לכל מדגם.

בארות הבקרה, להוסיף רק 100 microliters של PBS BSA. הדגירה את הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, השלך את תפתור החלבון והסר את החלבונים הלא מאוגדים על ידי שטיפת הבאר שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטרים של PBST לבא.

לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של PBS BSA המכיל צנון סוס peroxidase מצומד נוגדנים אנטי פוליקלונאליים שלו. לאחר הדגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את בארות שלוש פעמים עם 300 microliters של PBST לבא. זהה את מתחמי נוגדני האנטיגן על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של רגנט גילוי ELISA לכל באר.

לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חומצה גופרתית טוחנית אחת לגם כדי לעצור את התגובה. למדוד את הצפיפות האופטית של בארות ב 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלסטיק. לשתק ויטונוקטין אנושי על חיישנים תגובתי אמין באמצעות שיטת צימוד אמין על פי הנחיות היצרן.

באמצעות PBS, לדלל באופן סדרתי את ליגנד PH רקומביננטי מאפס לארבעה micromolar ולהעביר את הפתרונות וכתוצאה מכך 96 גם שחור שטוח תחתון צלחת מיקרוטיטר. הפעל את הניסוי ב 30 מעלות צלזיוס באמצעות מכשיר אינטרפרומטריה ביו שכבה. פיפטה 10 microliters של פתרון שני מיקרוגרם למיליליטר של Vitronectin ב PBS על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית כמו טיפה אחת.

אפשר לירידה להתייבש במגלשה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את שקופיות זכוכית מצופה חלבון שלוש פעמים על ידי טבילת אותם ב המכילה PBS במשך שתי שניות כדי להסיר עודף חלבון לא מצופה. עכשיו, להוסיף 10 מיליליטר של תרבות Hif טרי לתוך צלחת פטרי פלסטיק סטרילי להטביע את מגלשות זכוכית מצופה במדיום התרבות.

הדגירה את הכלים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם רועד ב 20 סל"ד. לאחר הדגירה, הסר חיידקים לא מאוגדים על-ידי טביעה של השקופיות שלוש פעמים במקו מקור מלא ב- PBS לפני הדמיה של החיידקים המאוגדים על-ידי כתמי גרם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תאים אפיתל A549 תרבות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר שטיפה אחת ו טריפסיניזציה של התאים ב 37 מעלות צלזיוס, לדלל את ההשעיה התא ל 5, 000 תאים למיליליטר באמצעות מדיום שלם המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר של ג'נטמיצין. לפני זיהום חיידקי, להחליף את המדיום בארות עם F12 בינוני דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף את monolayer התא שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, מניחים את הצלחת על קרח ו 200 microliters של מדיום F12 מקורר מראש המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר של Vitronectin. לאחר הדגירה את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, להשליך את הפתרון על ידי צינור ולשטוף את שכבת התא פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של סוג הפרא החדש Hif במדיום F12 לכל באר.

דגירה הצלחת במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את המדיום עם פיפטה ושטפו את תאי האפיתל A549 שלוש פעמים עם PBS. מוסיפים 50 מיקרוליטרים ל הבאר של פתרון ניתוק התאים ומעקב עם דגירה של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של F12 להשלים בינוני ל הבא כדי לעצור את התגובה אנזימטית. מעבירים את תאי האפיתל מכל באר לצינור זכוכית של שישה מיליליטר המכיל ארבעה בחנורי זכוכית. Lyse התאים בטמפרטורת החדר על ידי מערבולת במשך שתי דקות.

לאחר דילול התא lysate 100-פי, צלחת 10 microliters של מדגם מדולל על צלחת אגר שוקולד. לספור את המושבות בעקבות דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את הניתוח של עמידות תלויה Vitronectin לפעילות החיידקית של סרום אנושי, התרבות הראשונה גלולה החיידקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר צנטריפוגה, תן שימוש חוזר גלולה חיידקי עם נפח אחד של חיץ Dextrose-Gelatin-Veronal. עכשיו, להוסיף 1, 500 CFU של חיידקים כדי 100 microliters של DGVB בתוספת המכיל 5% סרום. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם רעידות ב 300 סל"ד.

מוציאים 10 מיליליטר מתערובת התגובה באפס דקות ו-15 דקות. מניחים את aliquot על אגר שוקולד הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר הדגירה של צלחות אגר שוקולד, לספור את המושבות המופיעות על הצלחות ולחשב את אחוז החיידקים שנהרגו כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כל המבודדים הקליניים של Hif שנבדקו במחקר זה גייסו את ויטוונקטין לפני השטח של התא כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה. קשירה של ויטרונקטין על ידי סוג הבר זן Hif גרם לשינוי באוכלוסייה ואילו המוטנט לא לקשור Vitronectin. אינטראקציות חלבון חלבון בין חלבון ויטרונאטין מחייב גדול PH ו Vitronectin הוערכו על ידי ELISA.

התוצאות מצביעות על אינטראקציה משמעותית בין PH וגם Vitronectin ואת השליטה החיובית ביחס לשליטה השלילית. האינטראקציה בין PH ו Vitronectin הוערכו בזמן אמת באמצעות אינטרפרומטריה ביו שכבה יש זיקה של 2.2 micromolar. יתר על כן, ביטוי חסר חיידקים של PH על פני התא הפגין דבקות מופחתת משטחי זכוכית מצופה Vitronectin בהשוואה לתאי סוג הבר.

בנוסף, נוכחותו של Vitronectin על פני השטח של תאי אפיתל שיפרה באופן משמעותי את הדבקות של Hif. כדי להעריך את הפעילות המשלים של Vitronectin, הרג מתווך בסרום נבדק. תאי Hif מסוג פראי הפגינו עמידות גבוהה יותר בסרום מאשר תאים מוטנטים.

לא נהרגו חיידקים בנוכחות סרום שהושבת בחום. מעניין, סוג הבר Hif הפגין הישרדות מופחתת בסרום מדולדל Vitronectin וחידוש של Vitronectin גדל הישרדות חיידקית. עם זאת, זן המוטנטים לא הגיב לדלדול Vitronectin כי זה לא יכול לגייס Vitronectin על פני השטח של התא.

לאחר השליטה, טכניקה זו ניתן לעשות זאת בשלושה עד ארבעה ימים עבור כל פתוגן ולזכור להשתמש בתרבות הטרייה של פתוגנים חיידקיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה על איך לנתח את ויטרונקטין מחייב פתוגן. בנוסף לטכניקה זו, ויטרונאטין מחייב חלבוני משטח של חיידקים ניתן לזהות באמצעות פרוטומיקה ו כתמים מערביים.

טכניקה זו חשובה לחוקרים בתחום האינטראקציה בין המארח לפתוגן וגם לחקור את מנגנון הארסיות בחיידקים.