מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

המטרה הכוללת של גישה זו היא למדל קולוניזציה של כבד על ידי שיבוטי גידול גרורתיים הנוצרים על ידי סרטן המעי הגס, ולהשתמש במודל זה כדי לשפר את האבחון והטיפול בגרורות בכבד. תצפיות קליניות מצביעות על הטרוגניות של מחלה גרורתית. המודל שלנו מספק יכולת ללכוד את ההטרוגניות הזו כדי לזהות גנים הקשורים למחלה אוליגו-גרורתית ופולי-גרורתית.

ולהשתמש בידע זה לשיפור הגילוי המוקדם והטיפול בגרורות. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שאנו משתמשים בקווי תאים חד-שבטיים בעלי תווית כפולה שמקורם בחולים עם סרטן המעי הגס, ויכולים לצפות בהתפתחות של גרורות בכבד הן in vivo והן ex vivo. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלה גרורתית.

זה נותן לנו את היכולת לבדוק כל תרופה פוטנציאלית עם הערכה כמותית של מספר הנגעים הגרורתיים וקינטיקה של הגדילה של כל נגע. לאחר יצירת תאי HCT116 מסומנים של לוציפראז tdTomato והכנת מדיה, ריאגנטים ומכשירים, על פי פרוטוקול הטקסט, צלחו את התאים המועברים בצפיפות הבאה לבאר, בשלוש עותקים, בצלחות של 96 בארות. לאחר הדגירה של התאים במשך חמש שעות, כמת את העוצמות הפלואורסצנטיות של tdTomato באמצעות מערכת IVIS על ידי הפעלת תוכנת התמונה על שולחן העבודה.

לחץ על אתחול כפתור כדי לאתחל את זמן ההדמיה, שילוב בינוני, שניים עבור F/Stop, 535 עבור מסנן העירור ו-580 עבור מסנן הפליטה. הנח את לוחית 96 הבארות על תחנת ההדמיה, ולחץ על רכוש כדי להתחיל בהדמיה. לאחר רכישת התמונה, בלוח הכלים, לחץ על כלי ROI ובחר 12x8 מסמל החריץ.

צור חריצים בגודל 12x8 כדי לכסות את שטח האות בתמונה של לוחית 96 הבארות ולחץ על הכרטיסייה מדידות. התבונן בחלון עם טבלת מדידות החזר ההשקעה עם יחידות פוטונים לשנייה, לסטרדיאן, לסנטימטר מרובע. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70 עד 80 אחוזים, כשעה לפני הזרקת הטחול, הוסיפו 0.05 אחוז טריפסין ו-0.53 מילי-מולרי EDTA לתאים כדי לנתק אותם.

לאחר דגירה של התאים במשך שלוש עד חמש דקות, השתמש בנפח שווה של C-DMEM כדי לנטרל את הטריפסין. פיפטה היטב את התרביות כדי למנוע גושים, ולאחר מכן השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים. הקפיא תאים תלויים ב-1x DBPS בריכוז של 1.2 עד 2 x 10 ל-6 תאים ל-100 מיקרוליטר, תוך פיפטינג יסודי כדי למנוע גושים.

לאחר מכן, שמור את התאים על קרח עד להזרקה, ומדי פעם תלה אותם מחדש בצינור. לאחר מתן משככי כאבים והרדמה של עכברה עירומה אתימית בת שישה עד שמונה שבועות על פי פרוטוקול הטקסט, זהה את הטחול כאזור סגול הנראה חיצונית דרך העור בצד שמאל, ובצע חתך של שמונה מילימטר בצד שמאל על העור ממש מעל האיבר. לאחר מכן, הרם את דופן הבטן ובצע חתך קטן.

אפשר אוויר לחלל הבטן כך שהאיברים הפנימיים יתרחקו ממקום החתך. לאחר מכן הגדל את החתך בדופן הבטן לכחמישה מילימטרים. השלבים שהודגמו להזרקה הם קריטיים להליך.

דליפה של תאי גידול במהלך ההזרקה עלולה להוביל לגרורות מחוץ לכבד. ההזרקה צריכה להתבצע לאט, במשך 30 עד 60 שניות, עם לא יותר מ-1.5 מיליון תאים כדי למנוע פקקת ורידים פורטלית. חשוף את הטחול באמצעות צמר גפן כדי להפעיל בעדינות לחץ סביב החתך.

במידת הצורך ניתן לתפעל בעדינות את שומן הלבלב כדי לסייע בחשיפה, כדי לא לפגוע בטחול. בעזרת מזרק מיליליטר אחד עם מחט בגודל 27, לאורך תקופה של 30 עד 60 שניות, הזריקו 100 מיקרוליטר תאים לקצה הטחול החשוף. בתום ההזרקה יש להניח מיקרו-קליפס על הטחול לפני הוצאת המחט, כדי למנוע דליפה של תרחיף התא המוזרק, ולהשאיר אותו במקומו למשך חמש דקות.

חמש דקות לאחר ההזרקה, השתמש במכשיר צריבה ידני כדי לבצע כריתת טחול להמוסטזיס. התחל עם הילום הטחול בצד הקדמי על ידי קרישה מוקדמת של הצד הפרוקסימלי של כלי הדם עם רקמת שומן סמוכה. דימום טחול יכול להתרחש במקום ההזרקה.

המיקרו-קליפ מוחל על הטחול כדי למנוע דליפת תאי גידול ולשלוט בדימום הטחול. שיטות המוסטזיס יכולות לכלול צריבה, החזקת לחץ למשך שלוש עד חמש דקות וקשירת תפרים במידת הצורך. סגור את דופן הבטן באמצעות תפר קלוע 5.0 נספג ותפר אופקי יחיד.

לאחר מכן, השתמש בתפר חד-נימה 4.0 שאינו נספג כדי לסגור את העור, גם עם תפר אופקי יחיד. עקוב אחר בעל החיים לאחר הניתוח, על פי פרוטוקול הטקסט. כדי לבצע הדמיה ביולוגית, לאחר הרדמת עכברים על פי פרוטוקול הטקסט, יש להזריק לבעלי החיים 150 מיקרוליטר של לוציפרין גחלילית שהוכן בעבר.

הניחו את העכברים ב-IVIS במצב שכיבה עם מרווחים בין החיות כדי למזער את האות לעכברים סמוכים. שלוש דקות לאחר הזרקת לוציפרין, לאחר אתחול ה-IVIS, בחר זוהר, זמן חשיפה של שנייה אחת ו-binning בינוני. לחץ על כפתור Acquire כדי להתחיל בהדמיה, ולהבטיח שההדמיה מתבצעת באופן עקבי שלוש דקות לאחר הזרקת לוציפרין.

לאחר רכישת התמונה, והופעת חלון תמונה ולוח כלים, לחץ על כלי ROI ובחר מספר מאחד עד חמש מסמל העיגול המתאים למספר העכברים המצולמים. כדי להגדיר החזר ROI, הקף את אזור האות של האות הזוהר בחלל הבטן של העכבר, ולאחר מכן לחץ על מדידות של ה-ROI כיחידת זוהר שרירותית. כלול מעגל החזר ROI נוסף לרקע.

ארבעה שבועות לאחר ההזרקה, כדי לבצע טומוגרפיה של הדמיה זוהרת מפוזרת, או DLIT, לאחר אתחול ה-IVIS, בחר אשף הדמיה, ביולומינסנציה ולחץ על הבא. בחר DLIT ולחץ על הבא. בחר Firefly Probes ולחץ על Next.

בחר עכבר עבור נושא תמונה, אוטומטי עבור פרמטר חשיפה, C-13 סנטימטר עבור שדה ראייה ו- 0.5 סנטימטר כסוג נושא, ולחץ על הבא. לאחר מכן לחץ על לרכוש כפתור כדי להתחיל בהדמיה. לאחר רכישת תמונה, בחר בכרטיסייה DLIT 3D Reconstruction בכרטיסייה Analyze, ולחץ על Reconstruct כדי ליצור את תמונת השחזור התלת-ממדית.

לחץ על כלים והנפשה תלת-ממדית. לאחר מכן, בחלון 'הנפשה תלת-ממדית', בחרו 'סיבוב CCW בציר Y'. נקישה הקלט ושמור כדי לשמור את הקובץ בקובץ בפורמט mov.

כדי לבצע הדמיה פלואורסצנטית ex vivo, לאחר קציר וניתוח כבדים מעכברים על פי פרוטוקול הטקסט, מדוד את עוצמות הפלואורסצנט עבור כל מושבת גידול באמצעות IVIS. על ידי בחירת פלואורסצנטיות, ארבע שניות זמן חשיפה, Binning בינוני, 2 עבור F/Stop, 535 עבור מסנן העירור ו-580 עבור מסנן הפליטה. לחץ על לרכוש כפתור כדי להתחיל בהדמיה.

לאחר רכישת התמונה, אתר את תמונה חלון בלוח הכלים. לחץ על כלי ROI ובחר 1 מסמל העיגול. כדי להגדיר החזר ROI, הקף את אזור האות של מושבות גידול בודדות בתמונה.

רכוש מעגל החזר ROI נוסף של הרקע ולאחר מכן לחץ על מדידות של החזר ה-ROI כיחידת זוהר שרירותית. רכוש מעגל החזר ROI נוסף של הרקע. לבסוף, בצע חישובים על פי פרוטוקול הטקסט.

כפי שמוצג כאן על ידי ביולומינסנציה, שלושה שבועות לאחר הזרקת הטחול, שיבוטי HCT116 L2T P1 ו-P2 היו בעלי עומס גידול גדול יותר, בהשוואה לשיבוטים O1 ו-O2. נתונים אלה הצביעו על כך ששיבוטים O1 ו-O2 יכולים לחקות מחלה אוליגו-גרורתית בעוד ש-P1 ו-P2 מייצגים קולוניזציה גרורתית אגרסיבית נרחבת של הכבד. כימות הקרינה ex vivo של הכבד, נכון לארבעה שבועות לאחר הזרקת הטחול, אישר כי ל-P1 ו-P2 היו עוצמות פלואורסצנטיות גבוהות יותר בהשוואה לכבדי O1 ו-O2. תיוג פלואורסצנטי של שיבוטי גידול זיהה את המספר והגודל של מושבות גרורות בודדות בכבד.

בסך הכל, תמונות פלואורסצנטיות ex vivo היו עקביות עם ממצאים מקרוסקופיים, אך מושבות קטנות המוסתרות מתחת לפני השטח זוהו טוב יותר על ידי הדמיה פלואורסצנטית. כפי שמתואר כאן, המספרים והגדלים של מושבות גרורות נספרו ונמדדו בכל כבד, והדמיה פלואורסצנטית ex vivo נעשתה על כל מושבה גרורתית עבור כל מונוקלון. כפי שמוצג בגרפים אלה, המספר הכולל של גרורות ב-P1 היה גבוה יותר בהשוואה ל-P2, O1 ו-O2, בעוד שהגודל הממוצע של מושבות בודדות היה גדול יותר ב-P2 מאשר ב-P1, O1 ו-O2. המודל שלנו מספק גישה לזיהוי גנים חדשים לשכנוע הקשורים להטרוגניות מולקולרית של גרורות.

גנים אלה יכולים לשמש כמטרות לגישות חדשות לטיפול בגרורות. המודל שלנו יכול לשמש גם לאימות של גנים שונים המקודדים לחלבונים ושאינם מקודדים הנובעים ממאגרי מידע קליניים גדולים כיום, אך עדיין אינם מוגדרים מבחינה תפקודית בהקשר של מחלה גרורתית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, בגלל העדינות של הניתוח בבעלי חיים.

עם זאת, עם תרגול, ניתן להשיג תוצאות טובות תוך פרק זמן קצר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר הנחיות הניתוחים בבעלי חיים, לשלוט בקפידה בדימום ולמנוע דליפה של תרחיף תאי הגידול.