Name: מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: חקור מודל חיה מתקדם לחקר גרורות כבד מסרטן המעי הגס באמצעות שורות תאים מונוקלונליות כפולות תווית. שיטה זו מאפשרת הדמיה כמותית של התפשטות גרורותית וזיהוי גנים הקשורים למחלה אוליגומטסטטית ופולימטסטטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר ג&#39;פרי ל גרין (אוניברסיטת שיקגו) עבור פלסמיד Luc2-tdTomato ואת שורת תאים HCT116, מר Ani Solanki (מרכז משאבים בעלי חיים) לניהול עכברים, וד&quot;ר לארה לאוני על הסיוע עם DLIT. Quantifications בעוצמות פלורסנט ושקוף למחצה בוצעו משאבים מחקר הדמיה בעלי חיים קטנים משולב באוניברסיטת שיקגו על ספקטרום IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). עבודה זו נתמכה על ידי וירג&#39;יניה ו DK לודוויג קרן לחקר הסרטן, קרן המחקר לסרטן ריאות (LCRF), קרן סרטן הערמונית (PCF), ואת גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן (P30CA014599). המממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

<ol><li>Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+score+for+predicting+recurrence+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+analysis+of+1001+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases.</a> Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).</li>
<li>Pawlik, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surgical+margin+status+on+survival+and+site+of+recurrence+after+hepatic+resection+for+colorectal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases.</a> Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+Cancer%2C+Systemic+Inflammation%2C+and+Outcome%3A+Staging+the+Tumor+and+Staging+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host.</a> Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).</li>
<li>Veen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Follow-Up+and+Survivorship+After+Completing+Systematic+Surveillance+in+Stage+I-III+Colorectal+Cancer%3A+Who+Is+Still+at+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastrointest.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk.</a> J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).</li>
<li>Siegel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).</li>
<li>O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer+survival+rates+with+the+new+American+Joint+Committee+on+Cancer+sixth+edition+staging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging.</a> J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).</li>
<li>House, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+trends+in+outcomes+for+1%2C600+patients+during+two+decades+at+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution.</a> J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).</li>
<li>Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+bioluminescence+imaging+of+colorectal+liver+metastases+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse.</a> J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).</li>
<li>Rajendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+bioluminescent+hepatic+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine bioluminescent hepatic tumour model.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Oshima, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+tumor+clones+with+differential+liver+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging of tumor clones with differential liver colonization.</a> Sci. Rep. 5 (10946), (2015).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+identify+osteopontin%2C+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714(2013).</li>
<li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המודל החי שהוצג בדוח הנוכחי מבוסס על שתי גישות עיקריות. ראשית, על מנת להבטיח את היכולת להתבונן שיבוטים גרורתי עם נטיות שונות ליישב מתרבים בכבד, פאנל של שורות תאים חד שבטיים הטרוגנית מאוד הוקמה, ולא קו תאים סרטניים unfractionated הוקמה 12,13. הגישה monoclonal להתפתחות גרורות מוצדקת על ידי הנתונים הגנומי האחרונות 14 ושימש בהצלחה בעבר מודל 10,15,16 תהליך גרורתי. שנית, פעמי תיוג של הקו הסלולרי ההורי על ידי סמנים בלוציפראז ו tdTomato התאגד על מנת לספק נ...

חולים עם גרורות בכבד מסרטן מעי גס ראשוני (CRC) מאופיינים פרוגנוזה גרועה. שיעור ההישרדות לאחר 5 שנים עבור העיקרי nonmetastatic CRC (בשלבים I - III) מוערך 75 - 88% 3,4, בעוד חולים עם גרורות בכבד (בשלב IV) יש שיעור ההישרדות לאחר 5 שנים של רק 8 - 12% 5 , 6. עם זאת, חולים עם גרורות מייצגים קבוצה הטרוגנית, עם הצגת מספרים שונים של גרורות ושעות ישנות שונות. תצפיות קליניים הראו כי מספר גרורות (אשר עשוי להיות פרופורציונלי ליכולת או תדירות מיישבים של קולוניזציה) ואת הגודל של כל גרורה בודדת (ביחס ישר לשיעור הגידול המקומי) 1,7 גורמים פרוגנוסטיים בלתי תלויים. במילים אחרות, ההצלחה של שיבוטים גרורתי מיישבים את הכבד תלויה בשני מאפיינים עיקריים: היכולת שלהם לגדול יכולתם להפיץ ולשרוד במיקרו-סביבה של הכבד. העיצובמודלים קליניים מוצלחים של עם היכולת של לכידה וכימותי המאפיינים של שיבוטים גרורתי יכול לשפר את הבנתנו דרסטי של ביולוגיה כבדה גרורה ולספק כולים יעילים על העיצוב של גישות טיפוליות פוטנציאליות. מודלים של גרורות בכבד ניסיוני דווחו בעבר 8,9, אבל אף אחד מהם לא סיפק את היכולת ללכוד כמותית לתאר תכונות של שיבוטים גרורתי הפרט הן in vivo ו vivo לשעבר. כאן, אנו מציגים מודל חדש, מתקדם של גרורות בכבד הכוללת את הדור של שיבוטי גידול עם יעילות קולוניזציה הכבדה שונה ומאפיין צמיחה. העסקנו שילוב של תיוג כפול של תאים סרטניים עם בלוציפראז ו פלורסנט חלבון tdTomato עם הדור של שורות תאים חד שבטיים שיש הבדלים מהותיים בתוקף גרורתי. במודל ניסיוני זה, הנתונים מצביעים כי ההתפתחותגרורות בכבד יכול להיות מתואר במונחים של תדירות קולוניזציה זמן ההכפלה (TD), אשר עולה בקנה אחד עם תצפיות קליניות. אופי כמותי של מודל זה עושה את זה לאימוץ בקלות עבור גילוי סמים למטרות אבחון.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo מערכת הדמיה</td><td>קליפר מדעי החיים</td><td>124262</td><td>In Vivo מערכת הדמיה</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 תוכנת</td><td>הדמיה קליפר 128165 מדעי החיים</td><td></td><td>מכונת הרדמה</td></tr><tr><td>מחקרית VAD-MGX</td><td>מכונת הרדמה אינהלציה</td><td>VETAMAC</td><td>VAD-MGX</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>ריאגנטים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>ריאגנטים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין, נוזל (10,000 יחידות פניצילין; 10,000 &mu; g סטרפטומיצין)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>ריאגנטים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>ריאגנטים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>הזרקת בופרנקס (0.3 מ"ג/מ"ל)</td><td>רקיט בנקיזר הלת'קר בע"מ</td><td>12496-0757-5</td><td>בופרנורפין הידרוכלוריד</td></tr><tr><td>Gemini Cautery System</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>צריבה ידנית לכריתת טחול</td></tr><tr><td>מיקרו קליפ; ישר; לחץ של 70 גרם; רוחב קליפ 1.5 מ"מ; מכשיר כירורגי Roboz באורך לסת 10 מ"מ</td><td></td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: מכשירי המוסטזיס לאחר הזרקת טחול</td></tr><tr><td>D-luciferin, מלח אשלגן</td><td>Goldbio Technology</td><td>LUCK-1G</td><td>מלח אשלגן לוציפרין</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>בינוני Gibco</td><td>31985062</td><td>סרום מופחת בינוני</td></tr><tr><td>TC20 מונה תאים אוטומטי</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>מונה תאים אוטומטי</td></tr><tr><td>תוכנת JMP10&nbsp;</td><td>תוכנת ניתוח נתונים</td>של <td>מכון</td><td></td></tr><tr><td>SAS BD FACSAria II סדרן תאים</td><td>BD Biocsiences</td><td>סדרן תאים</td><td></td></tr></tbody></table>

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

חולים עם מספר מצומצם של גרורות בכבד ושיעורים איטיים של התקדמות יכולים להיות מטופלים בהצלחה עם טיפול מקומי גישות 1,2. עם זאת, מעט מאוד ידוע על ההטרוגניות של גרורות בכבד, ומודלים של בעלי החיים מסוגלים להעריך את ההתפתחות של מושבות גרורתי בודדות נדרשים. כאן, אנו מציגים מודל מתקדם של גרורות בכבד המספקות את היכולת לדמיין את ההתפתחות כמותית של שיבוטי גידול פרט בכבד להעריך קינטיקה הצמיחה ויעילות קולוניזציה שלהם. יצרנו פאנל של נגזרים monoclonal של תאי סרטן המעי הגס האנושי HCT116 שכותרתו ביציבות עם בלוציפראז ו tdTomato והחזקת נכסים צמיחה שונים. עם הזרקת טחול ואחריו כריתת טחול, רוב השיבוטים אלה מסוגלים ליצור גרורות בכבד, אבל עם תדרים שונים של קולוניזציה ושיעורי צמיחה שונה. באמצעות syste הדמיה in vivoמ &#39;(IVIS), אפשר לחזות ולכמת פיתוח גרור עם זורח in vivo ו דימות פלואורסצנטי vivo לשעבר. בנוסף, טומוגרפיה ההדמיה המפוזרת פלורסנט (DLIT) מספקת הפצת 3D של גרורות בכבד in vivo. דימות פלואורסצנטי Ex vivo של כבדים שנקטפו מספקת מדידות כמותיות של מושבות גרורתי בכבד בודדת, המאפשרת להערכת תדירות קולוניזציה כבדה קינטיקה הצמיחה גרורות. מאז המודל דומה גרורות בכבד שנצפו קלינית, היא יכולה לשמש אופנות לאיתור גנים הקשורים גרורות בכבד לבדיקת טיפולים פולשני או אדג&#39;ובנטי פוטנציאל מחלה גרורתית בכבד.

מטרת ניסוי זה הייתה לבסס מודל חיה עקבי לשחזור בקלות עם פוטנציאל הכימות הסידורי של ניטל הגידול גרורתי in vivo ו לאמידת התדירות הקולוניאליסטית קינטיקה צמיחה לפתח גרורות בכבד. איורי 2-6, עם אגדות, ניתנים מתוך הפרסום הקודם שלנו תחת רישיון Creative Commons CC-BY 10. הדור של Monoclones תאים סרטניים פעמיים שכותרתו <p ...

היכולת של שיבוטים גרורתיים ליישב אתרים מרוחקים תלויה ביכולת ההתפשטות שלהם ו/או ביכולתם לשרוד במיקרו-סביבה המארחת ללא התפשטות משמעותית. כאן, אנו מציגים מודל של בעלי חיים המאפשר הדמיה כמותית של שני סוגי ההתיישבות בכבד על ידי שיבוטים גרורתיים.

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

המטרה הכוללת של גישה זו היא למדל התנחלות בכבד על ידי שיבוטים של גידולים גרורתיים הנוצרים מסרטני מעי גס ורקטום, ולהשתמש במודל זה כדי לשפר את האבחון והטיפול בגרורות בכבד. תצפיות קליניות מצביעות על ההטרוגניות של מחלה גרורתית. המודל שלנו מספק יכולת ללכוד הטרוגניות זו כדי לזהות גנים הקשורים למחלה אוליגומטסטטית (מעט גרורות) ופולימטסטטית (גרורות רבות).ועדיף להשתמש בידע זה לשיפור הגילוי המוקדם והטיפול בגרורות. היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו הוא השימוש בשורות תאים מונוקלונליות עם סימון כפול המופקות מחולים עם סרטן מעי גס ורקטום, המאפשרות לצפות בהתפתחות של גרורות בכבד הן in vivo והן ex vivo. ההשלכות של טכניקה זו חולשחות עד לטיפול במחלה גרורתית.שיטה זו מעניקה לנו את היכולת לבחון כל תרופה פוטנציאלית באמצעות הערכה כמותית של מספר הגשמאות הגליליות (metastatic lesions) וקינטיקת הגדילה של כל גשמה. לאחר יצירת תאי HCT116 המסומנים ב-luciferase tdTomato והכנת המצעים, الريאגנטים והמכשירים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זרעו את התאים שעברו טרנספקציה בצפיפויות הבאות לכל באר, בשלוש חזרות, בלוחות של 96 בארות. לאחר דגירה של התאים למשך חמש שעות, כמתו את עוצמות הפלואורסצנציה של tdTomato באמצעות מערכת IVIS על ידי הפעלת תוכנת הדימות במחשב השולחני.לחצו על כפתור Initialize כדי לאתחל את זמן הדמיה, את ה-medium binning, את הערך 2 עבור F/Stop, את הערך 535 עבור מסנן העירור (excitation filter), ואת הערך 580 עבור מסנן הפליטה (emission filter). הניחו את פלטת 96 הבארים על תחנת ההדמיה, ולחצו על Acquire כדי להתחיל בהדמיה. לאחר רכישת התמונה, לחצו בלוח הכלים (Tool Palette) על ROI tools ובחרו 12x8 מאייקון החריץ (slit icon).צרו 12x8 חריצים שיכסו את שטח האות בתמונה של פלטת ה-96 בארות ולחצו על לשונית Measurements. ניתן להבחין בחלון עם טבלת מדידות ה-ROI ביחידות של פוטונים לשנייה, לסטרדיאן, לסנטימטר רבוע. כאשר התאים מגיעים ל-70 עד 80 אחוז התלכדות (confluency), כשעה לפני ההזרקה לטחול, הוסיפו לתאים 0.05 אחוז tripsin ו-0.53 millimolar EDTA כדי לפרק אותם.לאחר דגירה של התאים למשך שלוש עד חמש דקות, השתמשו בנפח שווה של C-DMEM כדי לנטרל את ה-tripsin. בצעו פיפוט יסודי של התרביות כדי למנוע התגבשות, ולאחר מכן השתמשו בסופר תאים אוטומטי לספירת התאים. הקפיאו תאים תלויים ב-1x DBPS בריכוז של 1.2 עד 2 x 10⁶ תאים ל-100 µL, תוך ביצוע פיפוט יסודי למניעת התגבשות.לאחר מכן, השאירו את התאים על קרח עד להזרקה, תוך כדי השהיה ותלייה חוזרת של התאים בשפופרת מדי פעם. לאחר מתן משככי כאבים והרדמה של עכברת נקייה (nude) אתיםית נקבה בת שש עד שמונה שבועות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זהו את הטחול כאזור סגול הנראה חיצונית דרך העור בצד שמאל של הבטן, ובצעו חתך של שמונה מילימטרים בעור בצד שמאל, ממש מעל האיבר. לאחר מכן, הרימו את דופן הבטן ובצעו חתך קטן.אפשרו לאוויר להיכנס לחלל הבטן כך שהאיברים הפנימיים יתרחקו מאתר החתך. לאחר מכן, הרחיבו את החתך בדופן הבטן לכ-5 מילימטרים. השלבים המוצגים להזרקה הם קריטיים לצורך הפרוצדורה.דליפה של תאי גידול במהלך ההזרקה עלולה להוביל לגרורות חוץ-כבדיות. יש לבצע את ההזרקה באיטיות, לאורך 30 עד 60 שניות, עם לא יותר מ-1.5 מיליון תאים כדי למנוע תסביך של תסביך ורידי פורטלי. חשוף את הטחול באמצעות מקלוני צמר גפן על ידי הפעלת לחץ עדין סביב החתך.במידת הצורך, ניתן להזיז בעדינות את השומן הלבלבי כדי לסייע בחשיפה, ובכך למנוע פגיעה בטחול. באמצעות מזרק של 1 ml עם מחט בכיול (gauge) 27, ובמהלך של 30 עד 60 שניות, מזריקים 100 µL של תאים לקצה הטחול החשוף. בסיום ההזרקה, יש להניח מיקרו-קליפ (micro-clip) על הטחול לפני הוצאת המחט, כדי למנוע דליפה של תרחיף התאים המוזרק, ולהשאירו במקומו למשך חמש דקות.חמש דקות לאחר ההזרקה, השתמש במכשיר קאוטרי ידני לביצוע ספלינקטומיה (כריתת טחול) לצורך המוסטזיס. התחל בקשרי הטחול (splenic hilum) בצד הקדמי על ידי קואגולציה מוקדמת של הצד הפרוקסימלי של כלי הדם יחד עם רקמת השומן הסמוכה. דימום מהטחול עלול להתרחש באתר ההזרקה.את התפס המיקרוסקופי (micro-clip) מניחים על הטחול כדי למנוע דליפה של תאי גידול ולשלוט בדימום מהטחול. שיטות להמסטזיס עשויות לכלול צריבה, הפעלת לחץ למשך שלוש עד חמש דקות, וקשירה בתפר במידת הצורך. סגרו את דופן הבטן באמצעות תפר שזור ספיג 5.0 ותפר אופקי בודד.לאחר מכן, השתמשו בתפר מונו-פילמנט לא-ספיג במידה 4.0 לסגירת העור, גם כן באמצעות תפר אופקי בודד. עקבו אחר בעל החיים לאחר הניתוח, בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לביצוע דימיון ביו-לומנסנטי, לאחר הרדמת העכברים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הזריקו לבעלי החיים תוך-פריטונית 150 µL של לוציפרין גחלילי שהוכן מראש.הניחו את העכברים בתוך מכשיר ה-IVIS בתנוחה גבנית (supine), עם מפרידים בין בעלי החיים כדי למזער את האות המועבר לעכברים סמוכים. שלוש דקות לאחר הזרקת לוציפרין, לאחר הפעלת ה-IVIS, בחרו באפשרות luminescent, זמן חשיפה של שנייה אחת ו-medium binning. לחצו על כפתור ה-Acquire כדי להתחיל את הדמיה, תוך וידוא כי ההדמיה מבוצעת בעקביות שלוש דקות לאחר הזרקת הלוציפרין.לאחר רכישת התמונה, כאשר חלון התמונה ולוח כלי העבודה מופיעים, לחצו על ROI tools ובחרו מספר בין אחת לחמש מתוך סמל העיגול, בהתאם למספר העכברים שצולמו. כדי להגדיר ROIs, הקיפו בעיגול את אזור האות של האות הלומנסנטי בחלל הבטן של העכבר, ולאחר מכן לחצו על מדידות של ה-ROI כיחידה שרירותית של רדיאנס. הוסיפו עיגול ROI נוסף עבור הרקע.ארבעה שבועות לאחר ההזרקה, כדי לבצע טומוגרפיה של דימות לומניסצנטי דיפוזי, או DLIT, לאחר אתחול ה-IVIS, בחרו ב-Imaging Wizard, ולאחר מכן ב-Bioluminescence, ולחצו על Next. בחרו ב-DLIT ולחצו על Next. בחרו ב-Firefly Probes ולחצו על Next.בחר Mouse עבור Image Subject, Auto עבור Exposure Parameter, C-13 Centimeter עבור Field of View, ו-0.5 Centimeter עבור Subject Type, ולחץ על Next. לאחר מכן, לחץ על כפתור Acquire כדי להתחיל בדימות. לאחר קבלת התמונה, בחר בלשונית DLIT 3D Reconstruction תחת לשונית Analyze, ולחץ על Reconstruct כדי להפיק את תמונת השחזור התלת-ממדית.לחצו על Tools ולאחר מכן על 3D Animation. לאחר מכן, בחלון ה-3D Animation, בחרו ב-Spin CCW on Y-Axis. לחצו על Record ו-Save כדי לשמור את הקובץ בפורמט mov.לביצוע דימוי פלואורסצנטי ex vivo, לאחר קצירת וניתוח הכבדים מהעכברים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מדדו את עוצמות הפלואורסצנציה עבור כל מושבת גידול באמצעות ה-IVIS. בחרו ב-Fluorescence, זמן חשיפה של ארבע שניות, Medium Binning, ערך 2 עבור F/Stop, מסנן עירור 535 ומסנן פליטה 580. לחצו על כפתור Acquire כדי להתחיל בדימוי.לאחר רכישת התמונה, אתר את חלון התמונה (Image window) בלוח הכלים (Tool Palette). לחץ על כלי ה-ROI (ROI Tools), ובחר ב-1 מתוך סמל העיגול. כדי להגדיר ROI, הקף בעיגול את אזור האות של מושבות גידול בודדות בתמונה.רכשו עיגול ROI נוסף של הרקע, ולאחר מכן לחצו על Measurements of the ROI כיחידה שרירותית של קרינה. רכשו עיגול ROI נוסף של הרקע. לבסוף, בצעו חישובים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.כפי שמוצג כאן באמצעות ביולומינצנציה, שלושה שבועות לאחר הזרקה לטחול, לשבטי HCT116 L2T P1 ו-P2 היה נטל גידול גדול יותר, בהשוואה לשבטים O1 ו-O2. נתונים אלו הצביעו על כך ששבטים O1 ו-O2 יכולים לדמות מחלה אוליגומטסטטית, בעוד ש-P1 ו-P2 מייצגים התנחלות מטאסטטית אגרסיבית ונרחבת של הכבד. כימות של פלואורסצנציה ex vivo של הכבד, נכון לארבעה שבועות לאחר ההזרקה לטחול, אישר כי ל-P1 ו-P2 היו עצימויות פלואורסצנטיות גבוהות יותר בהשוואה לכבדים של O1 ו-O2. סימון פלואורסצנטי של שבטי הגידול אפשר לזהות את מספרם וגודלם של מושבות מטאסטטיות בודדות בכבד.באופן כללי, תמונות פלואורסצנציה ex vivo היו עקביות עם הממצאים המקרוסקופיים, אך מושבות קטנות שהוסתרו מתחת לפני השטח זוהו טוב יותר באמצעות דימיון פלואורסצנציה. כפי שמתואר כאן, מספרן וגודלן של המושבות המטסטטיות נספרו ונמדדו בכל כבד, ובוצע דימיון פלואורסצנציה ex vivo עבור כל מושבה מטסטטית עבור כל מונוקלון. כפי שמוצג בגרפים אלה, המספר הכולל של גרורות ב-P1 היה גבוה יותר בהשוואה ל-P2, O1 ו-O2, בעוד שהגודל הממוצע של מושבות בודדות היה גדול יותר ב-P2 מאשר ב-P1, O1 ו-O2. המודל שלנו מספק גישה לזיהוי גנים חדשים המשפיעים על תהליכי שכנוע הקשורים להטרוגניות מולקולרית של גרורות.גנים אלו יכולים לשמש כמטרות לגישות חדשות לטיפול בגרורות. ניתן להשתמש במודל שלנו גם לצורך תיקוף של גנים מקודדי-חלבון וגנים לא-מקודדים שונים העולים ממאגרי נתונים קליניים גדולים ועדכניים, אך טרם הוגדרו תפקודית בהקשר של מחלה גרורתית. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בביצועה, בשל הרגישות של הניתוח בבעל החיים.עם זאת, באמצעות תרגול, ניתן להשיג תוצאות טובות בזמן קצר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול בהתאם להנחיות לניתוח בעלי חיים, לשלוט בדימום בקפידה ולמנוע דליפה של תרחיף תאי הגידול.

advanced-animal-model-colorectal-metastasis-liver-imaging-techniques

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

שתי טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי לבסס את המודל הזה: הזרקה של השעיה תא סרטני בקיר cecal או השתלה של פיסת גידול תת עורי על cecum. מודל זה שימושי לחקר התפתחות טבעית של סרטן המעי הגס בדיקות סוכני טיפולית חדשה נגד סרטן המעי הגס.

עכבר דגם orthotopic של סרטן המעי הגס

מאמר זה מתאר את הליך הגיוס של orthotopic גידולים בכבד bioluminescent בעכברים, ניתוח בדיעבד של הגידול מוגבל בכבד באמצעות הארה חיים שלמים הדמיה הגוף.

Tumour Murine Bioluminescent כבדית דגם

מודלים של בעלי חיים לעתים קרובות מנוצלים כדי ללמוד גרורות סרטן העצם. בפרוטוקול זה יתאר שתי שיטות נפוצות של חיסון ללימודי גידול גרור בעצמות ומתארים בקצרה כמה מהניתוחים מנוצלים כדי לעקוב ולכמת דגמים אלה.

מודלים של גרורות עצם

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לביסוס מודל עכבר גרורות ספונטני של קסנוגרפטים או PDX שמקורם בסרטן המעי הגס. מודלים אלה של xenograft מחקים חלקית את המאפיינים של קרצינומה אנושית ומבינים את ההיבטים הקריטיים של ממאירויות אנושיות, כולל פלישה וגרורות.

מודלים ספונטניים של גרורות בעכבר: פלטפורמה לחקר הפוטנציאל הגרורתי של תאי סרטן המעי הגס בהזרקה אורתוטופית

מודל פרה קליני, עכברי של גרורות בכבד מבוצע באמצעות טכניקת הזרקת hemispleen.

דגם Murine פרה של גרורות כבדית

פותח הליך כירורגי להעברת תאי גידול חלב לכבד העכברים באמצעות הזרקת וריד פורטלי. מודל זה מאפשר לחקור שלבים מאוחרים של גרורות בכבד במארח בעל יכולת חיסונית מלאה, כולל אקסטרוואזציה של תאי גידול, זריעה, הישרדות וצמיחה גרורתית בכבד.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

פרוטוקול זה מתאר את הדור של החולה הנגזר הנושא מודלים מבע על ידי פנים-ומבחינה משפטית הקניית תאים קרצינומה של תא ברמה גבוהה urothelial או פנים-rectally הזרקת תאים סרטניים המעי הגס לתוך סוכרת שמנים/חמור משולב כשל חיסוני (הנהון/SCID) עכברים לגידול הגידול הראשוני גרורות מתחת להשפעה של תאים סטרומה בצומת הלימפה, אשר מחקה את ההתקדמות של מחלות גרורתית האדם.

מטופל-נגזר אורתוטופית מודלים של תאים האדם Urothelial קרצינומה של סרטן המעי הגס ואת הגידול גרורות ספונטנית

אנו מתארים בפירוט קלינית המעי הגס הרלבנטי סרטן הכבד גרורות (CRLM) הגידול מודל ההשפעה של איסכמיה של הכבד reperfusion (I/R) גידול גרורות. מודל זה יכול לעזור להבין טוב יותר את המנגנונים בבסיס קידום הניתוח המושרה של צמיחה גרורתית הכבד.

מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס (CRC) יוצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. מודל עכבר זה של גרורות כבד CRC מייצג כלי שימושי לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה ולפיתוח טיפולים חדשניים המכוונים לסטרומה כגון טיפולים גנטיים בתיווך וירוסים הקשורים לאדנו.

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים לסרטן המעי הגס לחקר סטרומה גרורות בכבד

חקור מודל חיה מתקדם לחקר גרורות כבד מסרטן המעי הגס באמצעות שורות תאים מונוקלונליות כפולות תווית. שיטה זו מאפשרת הדמיה כמותית של התפשטות גרורותית וזיהוי גנים הקשורים למחלה אוליגומטסטטית ופולימטסטטית.

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

גלה סרטונים נוספים