מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

המטרה הכוללת של גישה זו היא למדל התנחלות בכבד על ידי שיבוטים של גידולים גרורתיים הנוצרים מסרטני מעי גס ורקטום, ולהשתמש במודל זה כדי לשפר את האבחון והטיפול בגרורות בכבד. תצפיות קליניות מצביעות על ההטרוגניות של מחלה גרורתית. המודל שלנו מספק יכולת ללכוד הטרוגניות זו כדי לזהות גנים הקשורים למחלה אוליגומטסטטית (מעט גרורות) ופולימטסטטית (גרורות רבות).

ועדיף להשתמש בידע זה לשיפור הגילוי המוקדם והטיפול בגרורות. היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו הוא השימוש בשורות תאים מונוקלונליות עם סימון כפול המופקות מחולים עם סרטן מעי גס ורקטום, המאפשרות לצפות בהתפתחות של גרורות בכבד הן in vivo והן ex vivo. ההשלכות של טכניקה זו חולשחות עד לטיפול במחלה גרורתית.

שיטה זו מעניקה לנו את היכולת לבחון כל תרופה פוטנציאלית באמצעות הערכה כמותית של מספר הגשמאות הגליליות (metastatic lesions) וקינטיקת הגדילה של כל גשמה. לאחר יצירת תאי HCT116 המסומנים ב-luciferase tdTomato והכנת המצעים, الريאגנטים והמכשירים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זרעו את התאים שעברו טרנספקציה בצפיפויות הבאות לכל באר, בשלוש חזרות, בלוחות של 96 בארות. לאחר דגירה של התאים למשך חמש שעות, כמתו את עוצמות הפלואורסצנציה של tdTomato באמצעות מערכת IVIS על ידי הפעלת תוכנת הדימות במחשב השולחני.

לחצו על כפתור Initialize כדי לאתחל את זמן הדמיה, את ה-medium binning, את הערך 2 עבור F/Stop, את הערך 535 עבור מסנן העירור (excitation filter), ואת הערך 580 עבור מסנן הפליטה (emission filter). הניחו את פלטת 96 הבארים על תחנת ההדמיה, ולחצו על Acquire כדי להתחיל בהדמיה. לאחר רכישת התמונה, לחצו בלוח הכלים (Tool Palette) על ROI tools ובחרו 12x8 מאייקון החריץ (slit icon).

צרו 12x8 חריצים שיכסו את שטח האות בתמונה של פלטת ה-96 בארות ולחצו על לשונית Measurements. ניתן להבחין בחלון עם טבלת מדידות ה-ROI ביחידות של פוטונים לשנייה, לסטרדיאן, לסנטימטר רבוע. כאשר התאים מגיעים ל-70 עד 80 אחוז התלכדות (confluency), כשעה לפני ההזרקה לטחול, הוסיפו לתאים 0.05 אחוז tripsin ו-0.53 millimolar EDTA כדי לפרק אותם.

לאחר דגירה של התאים למשך שלוש עד חמש דקות, השתמשו בנפח שווה של C-DMEM כדי לנטרל את ה-tripsin. בצעו פיפוט יסודי של התרביות כדי למנוע התגבשות, ולאחר מכן השתמשו בסופר תאים אוטומטי לספירת התאים. הקפיאו תאים תלויים ב-1x DBPS בריכוז של 1.2 עד 2 x 10⁶ תאים ל-100 µL, תוך ביצוע פיפוט יסודי למניעת התגבשות.

לאחר מכן, השאירו את התאים על קרח עד להזרקה, תוך כדי השהיה ותלייה חוזרת של התאים בשפופרת מדי פעם. לאחר מתן משככי כאבים והרדמה של עכברת נקייה (nude) אתיםית נקבה בת שש עד שמונה שבועות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זהו את הטחול כאזור סגול הנראה חיצונית דרך העור בצד שמאל של הבטן, ובצעו חתך של שמונה מילימטרים בעור בצד שמאל, ממש מעל האיבר. לאחר מכן, הרימו את דופן הבטן ובצעו חתך קטן.

אפשרו לאוויר להיכנס לחלל הבטן כך שהאיברים הפנימיים יתרחקו מאתר החתך. לאחר מכן, הרחיבו את החתך בדופן הבטן לכ-5 מילימטרים. השלבים המוצגים להזרקה הם קריטיים לצורך הפרוצדורה.

דליפה של תאי גידול במהלך ההזרקה עלולה להוביל לגרורות חוץ-כבדיות. יש לבצע את ההזרקה באיטיות, לאורך 30 עד 60 שניות, עם לא יותר מ-1.5 מיליון תאים כדי למנוע תסביך של תסביך ורידי פורטלי. חשוף את הטחול באמצעות מקלוני צמר גפן על ידי הפעלת לחץ עדין סביב החתך.

במידת הצורך, ניתן להזיז בעדינות את השומן הלבלבי כדי לסייע בחשיפה, ובכך למנוע פגיעה בטחול. באמצעות מזרק של 1 ml עם מחט בכיול (gauge) 27, ובמהלך של 30 עד 60 שניות, מזריקים 100 µL של תאים לקצה הטחול החשוף. בסיום ההזרקה, יש להניח מיקרו-קליפ (micro-clip) על הטחול לפני הוצאת המחט, כדי למנוע דליפה של תרחיף התאים המוזרק, ולהשאירו במקומו למשך חמש דקות.

חמש דקות לאחר ההזרקה, השתמש במכשיר קאוטרי ידני לביצוע ספלינקטומיה (כריתת טחול) לצורך המוסטזיס. התחל בקשרי הטחול (splenic hilum) בצד הקדמי על ידי קואגולציה מוקדמת של הצד הפרוקסימלי של כלי הדם יחד עם רקמת השומן הסמוכה. דימום מהטחול עלול להתרחש באתר ההזרקה.

את התפס המיקרוסקופי (micro-clip) מניחים על הטחול כדי למנוע דליפה של תאי גידול ולשלוט בדימום מהטחול. שיטות להמסטזיס עשויות לכלול צריבה, הפעלת לחץ למשך שלוש עד חמש דקות, וקשירה בתפר במידת הצורך. סגרו את דופן הבטן באמצעות תפר שזור ספיג 5.0 ותפר אופקי בודד.

לאחר מכן, השתמשו בתפר מונו-פילמנט לא-ספיג במידה 4.0 לסגירת העור, גם כן באמצעות תפר אופקי בודד. עקבו אחר בעל החיים לאחר הניתוח, בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לביצוע דימיון ביו-לומנסנטי, לאחר הרדמת העכברים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הזריקו לבעלי החיים תוך-פריטונית 150 µL של לוציפרין גחלילי שהוכן מראש.

הניחו את העכברים בתוך מכשיר ה-IVIS בתנוחה גבנית (supine), עם מפרידים בין בעלי החיים כדי למזער את האות המועבר לעכברים סמוכים. שלוש דקות לאחר הזרקת לוציפרין, לאחר הפעלת ה-IVIS, בחרו באפשרות luminescent, זמן חשיפה של שנייה אחת ו-medium binning. לחצו על כפתור ה-Acquire כדי להתחיל את הדמיה, תוך וידוא כי ההדמיה מבוצעת בעקביות שלוש דקות לאחר הזרקת הלוציפרין.

לאחר רכישת התמונה, כאשר חלון התמונה ולוח כלי העבודה מופיעים, לחצו על ROI tools ובחרו מספר בין אחת לחמש מתוך סמל העיגול, בהתאם למספר העכברים שצולמו. כדי להגדיר ROIs, הקיפו בעיגול את אזור האות של האות הלומנסנטי בחלל הבטן של העכבר, ולאחר מכן לחצו על מדידות של ה-ROI כיחידה שרירותית של רדיאנס. הוסיפו עיגול ROI נוסף עבור הרקע.

ארבעה שבועות לאחר ההזרקה, כדי לבצע טומוגרפיה של דימות לומניסצנטי דיפוזי, או DLIT, לאחר אתחול ה-IVIS, בחרו ב-Imaging Wizard, ולאחר מכן ב-Bioluminescence, ולחצו על Next. בחרו ב-DLIT ולחצו על Next. בחרו ב-Firefly Probes ולחצו על Next.

בחר Mouse עבור Image Subject, Auto עבור Exposure Parameter, C-13 Centimeter עבור Field of View, ו-0.5 Centimeter עבור Subject Type, ולחץ על Next. לאחר מכן, לחץ על כפתור Acquire כדי להתחיל בדימות. לאחר קבלת התמונה, בחר בלשונית DLIT 3D Reconstruction תחת לשונית Analyze, ולחץ על Reconstruct כדי להפיק את תמונת השחזור התלת-ממדית.

לחצו על Tools ולאחר מכן על 3D Animation. לאחר מכן, בחלון ה-3D Animation, בחרו ב-Spin CCW on Y-Axis. לחצו על Record ו-Save כדי לשמור את הקובץ בפורמט mov.

לביצוע דימוי פלואורסצנטי ex vivo, לאחר קצירת וניתוח הכבדים מהעכברים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מדדו את עוצמות הפלואורסצנציה עבור כל מושבת גידול באמצעות ה-IVIS. בחרו ב-Fluorescence, זמן חשיפה של ארבע שניות, Medium Binning, ערך 2 עבור F/Stop, מסנן עירור 535 ומסנן פליטה 580. לחצו על כפתור Acquire כדי להתחיל בדימוי.

לאחר רכישת התמונה, אתר את חלון התמונה (Image window) בלוח הכלים (Tool Palette). לחץ על כלי ה-ROI (ROI Tools), ובחר ב-1 מתוך סמל העיגול. כדי להגדיר ROI, הקף בעיגול את אזור האות של מושבות גידול בודדות בתמונה.

רכשו עיגול ROI נוסף של הרקע, ולאחר מכן לחצו על Measurements of the ROI כיחידה שרירותית של קרינה. רכשו עיגול ROI נוסף של הרקע. לבסוף, בצעו חישובים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

כפי שמוצג כאן באמצעות ביולומינצנציה, שלושה שבועות לאחר הזרקה לטחול, לשבטי HCT116 L2T P1 ו-P2 היה נטל גידול גדול יותר, בהשוואה לשבטים O1 ו-O2. נתונים אלו הצביעו על כך ששבטים O1 ו-O2 יכולים לדמות מחלה אוליגומטסטטית, בעוד ש-P1 ו-P2 מייצגים התנחלות מטאסטטית אגרסיבית ונרחבת של הכבד. כימות של פלואורסצנציה ex vivo של הכבד, נכון לארבעה שבועות לאחר ההזרקה לטחול, אישר כי ל-P1 ו-P2 היו עצימויות פלואורסצנטיות גבוהות יותר בהשוואה לכבדים של O1 ו-O2. סימון פלואורסצנטי של שבטי הגידול אפשר לזהות את מספרם וגודלם של מושבות מטאסטטיות בודדות בכבד.

באופן כללי, תמונות פלואורסצנציה ex vivo היו עקביות עם הממצאים המקרוסקופיים, אך מושבות קטנות שהוסתרו מתחת לפני השטח זוהו טוב יותר באמצעות דימיון פלואורסצנציה. כפי שמתואר כאן, מספרן וגודלן של המושבות המטסטטיות נספרו ונמדדו בכל כבד, ובוצע דימיון פלואורסצנציה ex vivo עבור כל מושבה מטסטטית עבור כל מונוקלון. כפי שמוצג בגרפים אלה, המספר הכולל של גרורות ב-P1 היה גבוה יותר בהשוואה ל-P2, O1 ו-O2, בעוד שהגודל הממוצע של מושבות בודדות היה גדול יותר ב-P2 מאשר ב-P1, O1 ו-O2. המודל שלנו מספק גישה לזיהוי גנים חדשים המשפיעים על תהליכי שכנוע הקשורים להטרוגניות מולקולרית של גרורות.

גנים אלו יכולים לשמש כמטרות לגישות חדשות לטיפול בגרורות. ניתן להשתמש במודל שלנו גם לצורך תיקוף של גנים מקודדי-חלבון וגנים לא-מקודדים שונים העולים ממאגרי נתונים קליניים גדולים ועדכניים, אך טרם הוגדרו תפקודית בהקשר של מחלה גרורתית. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בביצועה, בשל הרגישות של הניתוח בבעל החיים.

עם זאת, באמצעות תרגול, ניתן להשיג תוצאות טובות בזמן קצר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול בהתאם להנחיות לניתוח בעלי חיים, לשלוט בדימום בקפידה ולמנוע דליפה של תרחיף תאי הגידול.