Microglia בתור biosensor סרוגייט לקביעת Nanoparticle neurotoxicity
25 באוקטובר 2016
מיקרוגליה (תאים חיסוניים של המוח), משמשים כחיישן ביולוגי חלופי כדי לקבוע כיצד ננו-חלקיקים משפיעים על רעילות עצבית. אנו מתארים סדרה של ניסויים שנועדו לבחון את תגובת המיקרוגליה לננו-חלקיקים וחשיפה של נוירונים היפותלמוסיים לסופרנטנט ממיקרוגליה מופעלת כדי לקבוע רעילות עצבית.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר חיישן ביולוגי חלופי במבחנה לבדיקת תגובת מיקרוגליה לננו-חלקיקים. לאחר מכן נקבע רעילות עצבית בעקבות חשיפה למדיה מותנית ממיקרוגליה המגורה עם ננו-חלקיקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון כיצד ננו-חלקיקים מסוננים באופן פעיל לרעילות עצבית.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמודל שלנו מספק את היכולת להפעיל ישירות מיקרוגליה ולקבוע אם גורמים סודיים הם נוירוטוקסינים ללא שימוש במחקרי מכרסמים יקרים לטווח ארוך. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מוות תאים המושרה על ידי מיקרוגליה בעקבות חשיפה למיקרו-חלקיקים. ניתן ליישם אותו גם על מודלים אחרים של מחלות נוירודגנרטיביות בהקשר של בדיקת מזהמים סביבתיים נוירוטוקסיים פוטנציאליים.
בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם שלב סינון המדיה המצב. מכיוון שיעילות הסינון עשויה להשתנות בהתאם לגודל, לצורה ולריכוז הננו-חלקיקים. בהכנה לחמם את ה-DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% PSN ל-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן קחו תאי מיקרוגליה קפואים של BV2 שהתקבלו ממעברים 18 25, והפשירו אותם במהירות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו בעדינות את התאים המופשרים לבקבוק מאוורר בגודל 75 סנטימטר רבוע המכיל 10 מיליליטר מדיום ודגרו על הבקבוק. לאחר 24 שעות מחליפים את המדיום וממשיכים לגדל את התאים עד שהם מגיעים למפגש של 70-80%בשלב זה שואבים את המדיום ומוסיפים 500 מיקרוליטר של תמיסת EDTA חמה 1 ex trypsin.
לאחר שאפשרתם לבקבוק לדגור עוד כמה דקות, השתמשו במגרד כדי לאסוף את התאים ל-5 מיליליטר של DMEM חם. לאחר מכן מסננים את התאים מהבקבוק באמצעות מסננת 70 מיקרון. חזור על סינון זה שלוש פעמים באמצעות אותה מסננת ואסוף את התאים בצינור של 50 מיליליטר.
לאחר הסינון, ספרו את התאים ולאחר מכן זרעו צלחת תחתונה שקופה בעלת דופן שחורה עם 8000 תאים לבאר ב-200 מיקרוליטר של DMEM בתוסף. לאחר 24 שעות של דגירה, החלף את המדיום בבארות ב-DMEM ללא סרום כדי להרעיב את המיקרוגליה. לאחר 24 שעות נוספות של דגירה, המשך להפעיל את המיקרוגליה.
לשם כך, תחילה יש לדלל ננו-חלקיקי כסף ב-DMEM ללא סרום לריכוז העבודה הרצוי. לאחר מכן החלף 100 מיקרוליטר מדיום בתרכובת הטיפול. הקפד לכלול בקרה שלילית על תמיסת רכב מדולל ללא הננו-חלקיקים.
כעת המשיכו בדגירה למשך 24 שעות והמשיכו בניתוח. כדי להתחיל, אספו 200 מיקרוליטר של מדיום סופרנטנט מכל צלחת היטב והעמיסו אותו על מסנן שיסיר את הננו-חלקיקים המונחים על צינור מיקרו צנטריפוגה. חשוב לזכור שכאשר מסננים את הננו-חלקיקים, גודלם, צורתם וריכוזם מהווים גורם ליעילות ההיתוך.
לכן רצוי לבדוק את הסינון מראש. כעת סובב את הצינורות ב-14000 גרם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן השליכו את הזרימה המכילה את הננו-חלקיקים והניחו את המסננים הפוכים בצינורות איסוף חדשים.
סובב את המסננים הפוכים ב-1000 גרם למשך שתי דקות כדי לאסוף מדיום מרוכז המכיל ציטוקינים. לאחר מכן, הגדל את נפח האוסף ל -400 מיקרוליטר עם DMEM משלים טרי ואחסן את הצינורות על קרח. כדי להבטיח הסרת ננו-חלקיקי גופרית שיוריים ממדיה מסוננת, הכינו תקני ננו-חלקיקים לא מסוננים בטווח ריכוזים מריק עד 0.2 מיקרוגרם למיליליטר ב-DMEM נטול סרום.
לאחר מכן יש להקצות 50 מיליליטר מהדגימות המסוננות ומכל תקן לתוך צלחת תחתונה שקופה בעלת דופן שחורה ולמדוד את הספיגה בין 390 ל-410 ננומטר. כדי למדוד את ריכוז TNF-alpha בדגימות, השתמש במחצית מהנפח הנותר שלהן בערכה זמינה מסחרית. לצורך בדיקה זו יש להקים תאים היפותלמוסיים ממלאי קפוא.
שימוש באותן שיטות שתוארו להקמת תרביות מיקרוגליה. בסופו של דבר השתמש בהם כדי לזרוע צלחות תחתונות שקופות עם קירות שחורים עם 5000 תאים לבאר ב -200 מיקרוליטר של DMEM בתוסף. לאחר 24 שעות של תרבית, הסר 100 מיקרוליטר של מדיום והחלף אותו ב-100 מיקרוליטר של מדיום מסונן ומרוכז שנאסף מתרביות תאי המיקרוגליה המופעלים ואז דגר על הצלחת למשך 24 שעות בתנאים סטנדרטיים.
למחרת מוסיפים 22 מיקרוליטר מגיב רזזורין לכל באר וממשיכים את הדגירה למשך 20 דקות. לאחר מכן, בעזרת ספקטרופוטומטר מולטי-מוד, קח מדד פלואורסצנטי כדי להעריך את כדאיות התאים במונחים של יחידות פלואורסצנטיות יחסיות. עם הפרוטוקול המתואר, פונקציית מיקרוגליה יכולה לשמש כחיישן ביולוגי חלופי לתגובת המוח לננו-חלקיקים.
הפרשת TNF-alfa על ידי מיקרוגליה גדלה באופן משמעותי בעקבות חשיפה לננו-חלקיקים רסיסים. כאשר נוירונים היפותלמוסיים נחשפו למדיום מותנה ממיקרוגליה המופעלת על ידי ננו-חלקיקי כסף, יכולת הקיום של הנוירונים הופחתה משמעותית. באופן עקרוני, חשיפה לננו-חלקיקי הכסף הפעילה את המיקרוגליה למצב פרו-דלקתי M1.
לאחר מכן הציטוקינים הפרו-דלקתיים המשוחררים תורמים למוות התאים שמסביב. לאחר צפייה בסרטון זה אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוגליה כחיישן ביולוגי חלופי לבדיקת תגובה לננו-חלקיקים ואם תגובה זו היא נוירוטוקסית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה או ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון פרופיל ציטוקינים מופרשים אחרים לאחר הפעלת מיקרוגליה על מנת לפנוטיפ מצבי הפעלה של מיקרוגליה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את השימוש במיקרוגליה כבסנסור ביולוגי חלופי להערכת ההשפעות הנוירוטוקסיות של ננו-חלקיקים. באמצעות בחינת תגובת המיקרוגליה לחלקיקים אלו, חוקרים שואפים להבין את הפוטנציאל הנוירוטוקסי של מזהמים סביבתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי העצבים
- נוירו-טוקסיקולוגיה
- ביולוגיה של מיקרוגליה
רקע
- מיקרוגליה הם תאי החסינות של המוח.
- הם עשויים להיות מופעלים על ידי ננו-חלקיקים, מה שמוביל לשחרור של גורמים שעשויים להיות נוירוטוקסיים.
- שיטה זו מפחיתה את הצורך במחקרי מכרסמים ארוכי טווח.
- ניתן להחיל אותה גם על מודלים אחרים של מחלות נוירודגנרטיביות.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל in vitro לבדיקת תגובות של מיקרוגליה לננו-חלקיקים.
- הערכת נוירוטוקסיות ממדיום מותנה (conditioned media) של מיקרוגליה מופעלת.
- מתן תובנות לגבי הפוטנציאל הנוירוטוקסי של מזהמים סביבתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפעלה של מיקרוגליה באמצעות ננו-חלקיקים.
- איסוף מצע תרבית מותנה (conditioned media) ממיקרוגליה מופעלת.
- הערכת נוירוטוקסיות בנוירונים היפותלמיים.
- השוואה למחקרי מכרסמים מסורתיים.
תוצאות עיקריות
- הפעלת מיקרוגליה הושגה בהצלחה באמצעות ננו-חלקיקים.
- מדיה מותנית הראתה השפעות נוירו-טוקסיות פוטנציאליות על נוירונים.
- שיטה זו סיפקה חלופה חסכונית למחקרי בעלי חיים.
- התובנות שהושגו יכולות להנחות מחקרים עתידיים על מחלות נוירודגנרטיביות.
מסקנות
- המודל in vitro יעיל לחקר תגובות של מיקרוגליה.
- הוא מאפשר הערכה של גורמים נוירוטוקסיים ללא צורך בניסויי בעלי חיים נרחבים.
- גישה זו יכולה לקדם את ההבנה של נוירוטוקסיות בהקשרים סביבתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מבסס ביו-חיישן תחליפי in vitro המשתמש במיקרוגליה להערכת נוירו-טוקסיות המושראת על ידי ננו-חלקיקים, ובכך נותן מענה לפער קריטי בהערכת בטיחות בשלבים מוקדמים עבור תרכובות בעלות פעילות עצבית. על ידי קישור הפעלת המיקרוגליה להישרדות נוירונלית במורד המסלול, השיטה מספקת תובנה מכניסטית לגבי נתיבים של דלקת עצבית (neuroinflammatory pathways) שיכולה לסייע בתיקוף מטרות ובאסטרטגיות להפחתת סיכונים. גישה זו תומכת בביטחון ניבוי בזיהוי רעלים עצביים סביבתיים לפני ביצוע מחקרי in vivo יקרים, ובכך תואמת את צרכי התעדוף של תיקי פיתוח בשלב הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הפעלת מיקרוגליה כקשר מכניסטי בין חשיפה לננו-חלקיקים לבין מסלולים של דלקת נוירונית.
- ערך תפעולי: מספק מערכת in vitro ניתנת לשחזור להערכת נוירו-тоקסיות המתווכת על ידי ציטוקינים, ללא הסתמכות על מיקרוגליה ראשונית של מכרסמים.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף של מטרה על ידי כימות שחרור TNF-α כמדד תפקודי למצב פרו-דלקתי של מיקרוגליה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: ייצור של מצע מותנה המכיל פקטורים מופרשים המשמשים כמדד רעילות עצבית סטנדרטי במבדקים נוירונליים המשכיים.
- ערך תפעולי: כולל שלב סינון להסרת ננו-חלקיקים תוך שימור ציטוקינים ביו-אקטיביים, מה שמבטיח ספציפיות של המבדק לפקטורים שמקורם במיקרוגליה.
- יכולת הרחבה: שימוש בתאי BV2 ממימונליים ובמדד חיות מבוסס resazurin התואם לפורמטים של סריקה בספיקו גבוה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מדמה פגיעה נוירונלית המתווכת על ידי נוירו-דלקת, מנגנון מפתח בפתוגנזה של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מקשר בין חשיפה לננו-חלקיקים לבין קיטוב M1 של מיקרוגליה ומוות עוקב של נוירונים בהיפותלמוס, ובכך מבהיר נתיבים סיבתיים.
- המשכיות ניבוית: העברה של מצע גידול מותנה מאפשרת הערכה של נוירו-רעילות עקיפה (bystander neurotoxicity), רלוונטית להערכת השפעות משניות במודלים של רקמות מורכבות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת קריאה תפקודית מוקדמת של הפוטנציאל לנוירו-דלקת בעקבות חשיפה לתרכובת או לננו-חלקיק, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי זיהוי מועמדים מובילים.
- ביולוגיית גילוי: בוחנת את ההשערה כי הפעלה של מיקרוגליה מניעה נוירוטוקסיות באמצעות שחרור של גורמים מסיחים, ובכך תומכת בהבהרה של מסלול הפעולה.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים על חיוניות נוירונלית מתוך מדיה מותנית, מה שמאפשר הערכה השוואית של תרכובות לבדיקה.
- אנליטיקה: משלבת TNF-α ELISA ופלואורסצנציית resazurin כדי לקשר בין הפעלת מיקרוגליה לתוצאות נוירונליות.
- מחקר תרגומי: משתמשת בנוירונים היפותלמיים כמערכת רלוונטית למחלה כדי למדל פגיעות נוירואנדוקרינית לדלקת.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה מודולרית שבה ניתן להפריד בין הפעלת המיקרוגליה לבין הקריאה הנוירונלית ולהחילן על מחלקות שונות של רעלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד התרומה של מיקרוגליה לרעילות עצבית במערכת מוגדרת ללא תרבית משותפת.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של חשיפה לננו-חלקיקים ושל שלבי העברת המצע, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מוקדמת יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי פוטנציאל לדלקת עצבית לפני ההשקעה באופטימיזציה של מולקולת העופת (lead optimization).
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי תרכובים המעוררים הפעלה של מיקרוגליה ולחץ עצבי משני.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות ראשוניות של נוירונים ובתחזוקת מיקרוגליה כדי להבטיח נאמנות פנוטיפית.
- תלוי בגישה לציוד סינון עם יעילות שימור ננו-חלקיקים מתוקפת, בהתבסס על גודל וריכוז.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון הרעבת הסרום וההפעלה כדי למזער שונות בתגובתיות המיקרוגליה.
- חייבת להילקח בחשבון הפרעה ספציפית של ננו-חלקיקים במבחנים המשכיים, דבר המחייב תיקוף סינון עבור כל חומר בדיקה.
- מוגבל למודלים in vitro; אינו משקף את הדינמיקה של מחסום הדם-מוח או פרמקוקינטיקה מערכתית.
