דרך אמין להערכת זרע נביטה, תרדמת, ותמותה בתנאי שדה
6 בנובמבר 2016
כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת שאירים זרע, נביטה תרדמת בתנאי שדה באמצעות קבור, רצועות זרע שכותרתו כלוריד tetrazolium בדיקות כדאיות (ט"ז).
המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן ולכמת ישירות את נביטת הזרעים, התמותה והתרדמה בתנאי שדה לאורך זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אקולוגיה של זרעים, כגון כיצד מינים שונים או אקוטיפים של מינים תורמים שתילים בודדים לאוכלוסיית הדור הבא. או, זרעים בודדים לבנק זרעי האדמה המתמיד.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לפרוס בקלות בשטח כל מספר של עיצובי ניסוי, מינים, טיפולים או תאריכי הסרה ולאחזר אותם כהעתק שלם לאחר שבועות עד חודשים של קבורה. כדי להתחיל, חותכים רצועת בד בגודל 20X105 ס"מ לכל רצועת זרעים. בעזרת סרט מדידה, סמן תאים על הרצועה.
קפלו את הבד לשניים, והשתמשו באקדח דבק בטמפרטורה גבוהה כדי למרוח דבק בקצה קצר אחד. הניחו לדבק להתקרר מעט ולאחר מכן לחצו את שני הצדדים יחד ליצירת אטימה. הניחו קווי דבק לאורך כל סימן תא מהקצה המקופל ועד לקצה הקצר הפתוח.
לחץ על שני דפנות הבד יחד לאורך קווי הדבק כדי ליצור אטמים ללא חורים בין התאים. הקצה באופן אקראי סוגי זרעים צולבים לתאים עבור כל רצועה. לאחר מכן, ספרו והניחו מספר אחיד של זרעים בכל תא.
בעזרת חץ גינה מפלסטיק, סמן את התא בסוג זרע. השתמש באקדח הדבק כדי לאטום את התא בצורה מאובטחת. המשך לאורך הרצועה, מלא, תייג ואוטם את כיסי הזרעים בזה אחר זה עד שכל הרצועה מתמלאת ואטומה.
בדוק אם יש פערים בין התאים ודבק נקודתי לפי הצורך לפני שתמשיך. כדי לבצע את ניסויי הקבורה, תחילה חפרו חלקות לעומק שצוין כדי לשכן רצועות על סמך התכנון הניסיוני. מניחים את רצועות הזרעים באדמה ומכסים אותן באדמה.
לאחר מכן, חותכים בד חומרה של רשת מתכת לפאנל גדול ב-10 ס"מ מכל צד מחלקות הזרעים הקבורות. אוטמים את שולי בד הרשת באדמה. כיסוי זה אמור לא לכלול טורפים חופרים זרעים.
לבסוף, הניחו תוויות חלקת פלסטיק צבעוניות במיקום האתר, מסומנות בתאריך הסרה וצבע מקודד כדי להשלים את הרשומות הכתובות. בתאריך ההסרה שהוקצה, חפרו את זרעי הנושא. עטפו את הרצועות בעיתון רטוב כדי לשמור עליהן לחות, והניחו אותן בצידנית להובלה.
לאחר המעבדה, שטפו את הרצועות במים כדי להסיר לכלוך ופסולת זרים, עד שזרעים נראים בתאים. בעזרת מספריים, חתוך תא אחד בכל פעם. ספרו את כל הזרעים הנבטים הקיימים והסר אותם.
ספרו והסירו זרעים מתים בבירור. לבסוף, אספו את כל הזרעים הלא מונבטים שנותרו והניחו אותם על פיסת נייר רטובה מסומנת בצלחת פטרי. הכניסו את הכלים לתא גידול למשך שבוע כדי לאפשר נביטה.
בדוק את הזרעים וזהה וספור את כל מה שנבט. רשום אותם כברי קיימא אך לא נבטו, מכיוון שזרעים אלה לא נבטו בתנאי שדה. חותכים את הזרעים הנותרים לשניים כדי לבדוק את הכדאיות באמצעות טטרזוליום כלוריד.
מניחים חצי אחד בצלחת פטרי כשהעובר והאנדוספרם גלויים. הוסף מספיק טטרזוליום כלוריד כדי לכסות את חצאי הזרעים. מניחים את המנה באינקובטור המוגדר על 30 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.
לבסוף, העריכו את חצאי הזרעים. זרעים המציגים כתמים אדומים של העובר ניתנים לנביטה, בעוד שזרעים לא מוכתמים מתים. גרף זה מציג את הנביטה של סוגי צלב בר של יבול חמניות בתאריך ההסרה הראשון לאחר הקבורה בסוף הסתיו.
סוגי הצלבים מסודרים על ידי הגדלת אחוזי האלל של היבול, וההורה האימהי מסומן עבור כל הכלאה. באופן כללי, אחוזי אלל יבול נמוכים יותר הפחיתו נביטה לא מסתגלת בסוף הסתיו. בתחילת האביב, לכל הגנוטיפים הייתה נביטה גבוהה, אך נבדלו באופן משמעותי במספר הזרעים הלא מונבטים או המתים.
בפרט, סוגי הכלאה עם הורות אימהית יבול היו בעלי תמותה גבוהה יותר, בעוד שסוגי הכלאות פראיות אימהיות היו בעלי סיכוי גבוה יותר להישאר ללא נביטה. עד האביב, הנביטה פחתה עבור כמה סוגי הכלאה. סביר להניח שהסיבה לכך היא תמותת זרעים בתוך רצועות הקבורה עבור סוגי צולבים נבטים מוקדמים יותר.
בהתאם לכך, התמותה הייתה גבוהה יותר עבור סוגי הכלאה דמויי יבול יותר המיוצרים על ידי הורים אימהיים של יבול. לאחר שליטה, ניתן להרכיב טכניקה זו תוך מספר שעות, תלוי בעיצוב. בעוד שהערכת הרצועות אורכת בדרך כלל רק כמה דקות לכל תא, בתוספת זמן בתא הגידול והדגירה ב-TZ. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שרק זרעים שעברו דרך תא הגידול ונקבעו לאחר מכן על ידי בדיקת TZ כברי קיימא עשויים להיחשב רדומים באמת.
זרעים הנובטים בתא הגידול נחשבים לא מונבטים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות הפועלות במקביל, כמו מחקרי שתילים על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו האם הישרדות זרעים מתורגמת להופעת זרעים והשלמת מחזור החיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הערכת שטח של נביטת זרעים, תמותה ותרדמה.
אל תשכח שטטרזוליום כלוריד הוא חומר מגרה, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה להערכת הישרדות זרעים, נביטה ודורמנציה בתנאי שטח, באמצעות רצועות זרעים מסומנות ובדיקות חיוניות. הוא מאפשר לחוקרים לכמת את התנהגות הזרעים לאורך זמן, ובכך לתרום להבנת האקולוגיה של הזרעים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אקולוגיה של זרעים
- ביולוגיה של צמחים
- ניסויי שדה
רקע
- הבנת הנבטה של זרעים ותרדמת זרעים היא חיונית לדינמיקה של אוכלוסיות צמחים.
- למינים או אקוטיפים שונים עשויות להיות תרומות משתנות לבנקי זרעים.
- שיטה זו מאפשרת תכנונים ניסיוניים גמישים בסביבות טבעיות.
- תנאי השטח עשויים להשפיע באופן משמעותי על התנהגות הזריעים.
מטרת המחקר
- לתצפית ישירה וכמותית על נבטות זרעים ותמותתם.
- להערכת התרומה של זרעים בודדים לאוכלוסיות עתידיות.
- להערכת התמדתם של זרעים במאגר הזרעים בקרקע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של רצועות זרעים מסומנות לקבורה בשטח.
- שימוש בטטראזוליום כלוריד (TZ) לבדיקת חיוניות.
- ניטור של רצועות הזרעים לאורך שבועות עד חודשים.
- תכנון גמיש המאפשר התאמה למינים ולטיפולים שונים.
תוצאות עיקריות
- נתונים כמותיים על שיעורי נבטות של זרעים בתנאי שטח.
- תובנות לגבי תבניות תמותה ורת眠ה של זרעים.
- הערכה של השפעת מינים שונים על דינמיקת בנק הזרעים.
- הדגמה של הרב-גוניות של השיטה בתכנון ניסויי.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק מסגרת איתנה לחקר אקולוגיה של זרעים.
- הוא משפר את ההבנהB לגבי האופן שבו זרעים תורמים לאוכלוסיות צמחים עתידיות.
- השיטה ניתנת להתאמה לשאלות מחקר שונות בביולוגיה של זרעים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על נביטת זרעים, רדימה ותמותה בתנאי שדה, ומספקת נתונים כמותיים הקריטיים לתיקוף מטרות בביוטכנולוגיה חקלאית. באמצעות הערכת התנהגות הזרעים לאורך זמן, היא תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית של תכונות הקשורות להקמת השדה ולהישרדות הצמחים. הגישה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור בין שונות גנטית לבין פנוטיפים רלוונטיים לתנאי השדה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של נבטות, רדימה ותמותה כפלט פנוטיפי.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות הערכה סטנדרטית של חיוניות זרעים באמצעות tetrazolium chloride.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי זרעים על ידי קישור בין מוצא הורי לאחוזי אללים לבין ביצועים בשטח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור זרימות עבודה המשך באמצעות רצועות זריעה מופרדות לתאים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה והשחזוריות שלה באמצעות מיקום ושליפה אחידים של הזרעים.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): מקלה על המוכנות לסריקה על ידי התאמה של גנוטיפים וטיפולים שונים בתוך רצועה אחת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין גילוי באמצעות הערכה פנוטיפית של דורמנציה ותמותה לבין תיקוף פרה-קליני.
- החלטות מותאמות סיכון: מכוונת את ההתקדמות על ידי זיהוי סוגי הכלאות עם תמותה גבוהה יותר או הנבטה מלקטטיבית (maladaptive) מופחתת.
- הלימה של סמנים ביולוגיים: משתמשת בצביעת tetrazolium chloride כמדד חיוניות המתאם עם פוטנציאל ההנבטה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), באמצעות אספקת נתונים פנוטיפיים מהשטח על תכונות הישרדות של זרעים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות נבטות זרעים ותמותה בתנאים טבעיים.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות רצועות זרעים הניתנות לשליפה, המאפשרות השוואה בין גנוטיפים וטיפולים.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות ספירת נבטות ומדידת חיוניות באמצעות tetrazolium chloride.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תצפיות שטח לרציפות פרה-קלינית על ידי זיהוי זרעים שלא נבטו אך הם חיים כזרעים רדומים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תכונות זרעים על פני מינים, אקוטיפים ורקעים גנטיים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי הבחנה בין זרעים רדומים לזרעים מתים באמצעות טטرازוליום כלוריד.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות תאי בד אטומים ועומק קבורה מבוקר.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go על ידי זיהוי גנוטיפים בעלי נטייה נמוכה יותר לנביטה לא מסתגלת ועמידות גבוהה יותר בשטח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים המבוסס על דפוסי תמותת זרעים ורדומים על פני רקעים גנטיים שונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בזרעים, בבדיקות חיוניות ובתכנון ניסויי שדה.
- נדרש מיכשור לדגירה עם tetrazolium chloride ולבדיקות בתאי גידול.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך סימון עקבי של זרעים, איטום תאים ותזמון שליפה.
- כולל שיקולי התאמה בין מערכות מודל בשל שונות בגודל הזרעים ובחדירות המעטפת.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון מניעת חדירת טורפים חופרים באמצעות רשת מתכת ושמירה על לחות במהלך ההובלה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Creating Custom Seed Burial Strips
2:11
Burial of Seed Strips in the Field
2:57
Evacuation and Evaluation of Seed Strips
4:31
Results: Seed Germination Frequency and Viability in Different Seasons Are Influenced by Genotype and Maternal Parentage
5:39
Conclusion
