Name: מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact Ex Vivo שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: למדו שיטה לשחרור מתמשך של תרכובות לאיים לבלב עכברים שלמים באמצעות מיקרוספירות PLGA. השיטה מאפשרת חקר השפעת תרכובות שונות על התרבות תאי בטא בוגרים ומספקת כלי רב-תכליתי למחקר סוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לבת'אני קרבונואו (אוניברסיטת ונדרבילט) על הקריאה הביקורתית של כתב היד הזה. אנו מודים גם לאנסטסיה קולדרן (המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט) על בידוד האיים, ולד"ר אלווין סי פאוורס (המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט) ולד"ר דיוויד ג'ייקובסון (אוניברסיטת ונדרבילט) על השימוש במתקן הצנטריפוגות ותרביות הרקמות שלהם. מחקר זה כלל שימוש בליבת הרכש והניתוח של האי של מרכז המחקר וההדרכה לסוכרת ונדרבילט הנתמך על ידי DK20593 מענקים של NIH. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (14POST20380262) ל-R.C.P., ומענקים מהקרן לחקר סוכרת נעורים (1-2011-592), והמחלקה לענייני חיילים משוחררים (1BX00090-01A1) ל-MAG.

<ol><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li>
<li>Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deterioration+determines+the+onset+and+rate+of+progression+of+secondary+dietary+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%3A+the+10-year+follow-up+of+the+Belfast+Diet+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study.</a> Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+an+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).</li>
<li>Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cell+lines+and+their+applications+in+diabetes+mellitus+research%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research.</a> ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Rui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres%3A+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li>
<li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization+and+in-vitro+evaluation+of+sustained+release+protein-loaded+nanoparticles+based+on+biodegradable+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers.</a> Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).</li>
<li>Riley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+growth+factor+modulates+adult+beta-cell+maturity+and+proliferation+to+promote+beta-cell+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice.</a> Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).</li>
<li>Mosser, R. E., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+small+scale+screening+of+candidate+beta+cell+proliferative+factors+using+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets.</a> Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).</li>
<li>Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+interactions+regulate+beta-cell+proliferation+in+islet-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures.</a> Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).</li>
<li>Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+regulation+of+islet+beta+cell+mass+in+mice%3A+the+role+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin.</a> Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+culture+and+preservation+strategies%3A+advances%2C+challenges%2C+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+Responsive+Polymers+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications.</a> Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).</li>
<li>Makadia, H. K., Siegel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+Lactic-co-Glycolic+Acid+%28PLGA%29+as+Biodegradable+Controlled+Drug+Delivery+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier.</a> Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).</li>
<li>Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+loaded+with+insulin-phospholipid+complex+for+oral+delivery%3A+preparation%2C+in+vitro+characterization+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation.</a> J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).</li>
<li>Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li>
<li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li>
<li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המחקר של התפשטות β-cell בתרבות נפגע בדרך כלל על ידי מספר קשיים. ראשית, קווי β-cell הנציח מאופיינים לתארים גבוהים של התפשטות ממה נמצא β-תאי אנדוגני איים חי. בנוסף, שורות התאים הנציחו אלה חסרות את הארכיטקטורה הנורמלית חיונית לתפקוד β-תא נורמלי. שתי עובדות אלו מקשות על מנת לקבוע אם תוצאות שהתקבלו באמצעות קווי β-cell הנציחו יקיימו נכון כאשר נבדקו in vivo או איים שלמים. הפרוטוקול המתואר שלנו, אשר משתמש איי עכבר שלמים טרי מבודדים, עוקף בעיות אלה כמו ארכיטקטורת איון מתוחזק התפשט...

β-תאי לבלב הם התאים היחידים המייצר אינסולין בגוף הם קריטיים לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז בדם. בעוד אנשים בריאים הם בעלי מסת β-cell מספיק ולתפקד להסדיר דם גלוקוז כראוי, אנשים עם סוכרת מתאפיינים המוני β-cell מספיק ו / או פונקציה 1,2. הוצע כי גרימת התפשטות β-cell יכול בסופו של דבר להגדיל β-cell המוני ולשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בחולי סוכרת 3. עם זאת, הערכה ואימות של תרכובות שגשוג פוטנציאל β-תא איי שלמים הכרחי לפני ניתן לפתח טיפולים יעילים. השתלת איי אדם cadaveric לתוך אנשים עם סוכרת משחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בדם במשך זמן מה, אבל זמינויות ההצלחה של הליך ניסיוני זה הפריעו מחסור איי אדם זמינים להשתלה ועל ידי מוות בטא תא ומאחור האייםאה השתלת 4. אפילו עם גילוי הגורמים לגרום הכפל של תאים מייצרי אינסולין, אתגר גדול עדיין קיים במתן הגורמים הללו לאתרים רלוונטיים in vivo. אסטרטגיה אחת למסירה מקומית מתמשכת של תרכובות שגשוג β-cell היא פולי (לקטית-שיתוף גליקולית) חומצה (PLGA). יש PLGA היסטוריה של שימוש ב FDA אישר מוצרים משלוח סמים בשל בטיחות גבוהה, פריקות ביולוגית, קינטיקה שחרור המורחבת 5. באופן ספציפי, PLGA הוא קופולימר של lactide ו glycolide הזה מבזה באמצעות הידרוליזה עם מים או in vivo או בתרבות לחומצה לקטית וחומצה גליקולית, אשר מתרחשים מטבוליטים באופן טבעי בגוף. מתחם התרופה הכמוס יכול להשתחרר הסביבה על ידי שתי דיפוזיה ו / או מנגנוני שחרור מבוקר שפלים. Encapsulation של COI מספק הגנה מפני השפלה אנזימטי, שיפור הזמינות הביולוגית של מגיב לעומת unencapsulaטד COI 5. אנו ממליצים microspheres PLGA ניתן להשתמש כדי לנהל תרכובות המועמד איים שלמים בתרבות, ובסופו של דבר in vivo. בדיקת יעילותם של PLGA לנהל mitogens β-cell כדי איי vivo לשעבר היא קריטית לפני פרוטוקולי השתלת נחקרות. נכון לעכשיו, אין טכניקה למדוד התפשטות β-cell בבעלי חיים. ניסויים להעריך את האפקטיביות של תרכובות שגשוג פוטנציאל in vivo ולכן יש לתת לכלב של תרכובות אלה לחיות חיים, עם דיסקציה עוקבות ועיבוד של pancreata עבור immunolabeling. פרוטוקולים כאלה הם יקרים ומייגעים, ודורשים המתחם להיות מערכתיים, ללא כל ערובה לכך שהם יגיעו האי. לעומת זאת, כמה הנציח קווי β-cell זמינים לחקר תאים מייצרי אינסולין בתרבות, אבל שורות תאים אלה חסרים את הארכיטקטורה איון environment נמצא אורגניזמים חיים 6. קווי β-cell הונצח גם מאופיינים כבעלי מידה רבה יותר של שכפול מ β-תאי אנדוגני in vivo, ובכך סיבכה ניתוח של תרכובות המשרים התפשטות. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשתמשת איים שלמים מבודדים עכברים בוגרים. בניגוד קווי β-cell, איים שלמים שומרים על ארכיטקטורת איון נורמלית. כמו כן, בניגוד הניסויים שנערכו in vivo, מתן תרכובות שגשוג ישירות איים שלמים תרבותיים מפחית באופן משמעותי את כמות ריאגנטים כי יש צורך למדוד במדויק התפשטות β-cell. המחקר הנוכחי מנצל PLGA כדי לנהל COI, בדוגמה זו, גורם הגדילה רקמת חיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF). השיטה המתוארת כאן מקנה יתרון משמעותי על פני הממשל של מתחם גלם האי בתרבית שכן היא מאפשרת שחרור מתמשך של מתחם לתוך התקשורת דואר. יש לציין, assay זה יכול להיות שונה כדי לנהל מגוון רחב של חלבונים ונוגדנים מעניינים איים שלמים. השפעות על סוגי תאים אנדוקריניות אחרות, כולל תאי α, ניתן לנתח גם.

<table><tbody><tr><td>אורגון ירוק 488 חומצה קרבוקסילית, Succinimidyl Ester, 6 איזומרים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>לתיוג COI עם פלואורופור</td></tr><tr><td>DMSO דימתיל סולפוקסיד</td><td>פישר BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>להמסת פלואורופור בשלב 1</td></tr><tr><td>עמודי התפלה חד פעמיים PD-10</td> GE <td>Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>עמוד התפלה בשימוש בשלב 1</td></tr><tr><td>רסומר RG 505, פולי (D,L-לקטיד-קו-גליקוליד), אסתר מסתיים, משקל מולקולרי 54,000 - 69,000</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>739960</td><td>משמש ביצירת מיקרוספירות בשלב 2</td></tr><tr><td>פולי (ויניל אלכוהול) משקל מולקולרי 89,000 - 98,000</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>341584</td><td>משמש ביצירת מיקרוספירות בשלב 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>לטיפוח איים</td></tr><tr><td>דקסטרוז נטול מים</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>תוסף לתקשורת איים</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4333</td><td>אנטיביוטיקה לתקשורת איים</td></tr><tr><td>סרום סוס רגיל</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>תוסף לתקשורת איים</td></tr><tr><td>96 בארות צלחת תרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>3603</td><td>לתרבות איים</td></tr><tr><td>אתילן גליקו-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E4378</td><td>תוסף לתקשורת אי טרום בדיקה</td></tr><tr><td>ציטוספין 4 ציטוצנטריפוגה</td><td>תרמו מדעית</td><td>A78300003</td><td>לספינינג תאים על שקופיות מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>לספינינג תאים על שקופיות</td></tr> <tr><td>מיקרוסקופEthylenediaminetetraacetic חומצה</td><td>פישר BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>משמש בפירוק איים</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP151</td><td>לתאים חודרים</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>ריאגנטים חוסמים לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-Ki67</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>עבור Ki67 אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>חזיר ניסיונות פוליקלונלי אנטי אינסולין</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>לאימונופלואורסצנציה אינסולין</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure חמור נגד ארנב</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>עבור Ki67 אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>עבור אינסולין אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>D1306</td><td>להדמיית גרעינים באימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>מדיית הרכבה לייבוש מהיר</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg; C 4.5 ליטר אשד ספסל הקפאה מערכת יבשה</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>לליופיליזציה של מיקרוספירות</td></tr></tbody></table>

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר intact<em&gt; ex vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

פיתוח חומרים ביולוגיים גדל באופן משמעותי את פוטנציאל שיגור תרופות למגוון של סוגי תאים ורקמות, כולל β-תאי הלבלב. בנוסף, חלקיקים ביולוגיים, הידרוג, ופיגומים גם מספקים הזדמנות ייחודית לניהול מתמשך, משלוח סמים לשליטה על בטא תאים בתרבית ו במודלי רקמה מושתלות. טכנולוגיות אלו מאפשרות בחקר גורמי התפשטות β-cell המועמד באמצעות איי שלמים ומערכת רלוונטית translationally. יתר על כן, בקביעה האפקטיבית ואת הכדאיות של גורמי מועמד בהמרצת ההתרבות β-cell במערכת תרבות היא קריטית לפני לנוע קדימה מודלי in vivo. בזאת, אנו מתארים שיטת שיתוף תרבות איי עכבר שלמים עם מתחם מתכלה של עניין (COI) פולי -loaded (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) (PLGA) microspheres לצורך הערכת ההשפעות של שנגרם o שחרור באתרוגורמים mitogenic f על התפשטות β-cell. טכניקה זו מתארת ​​בפירוט כיצד ליצור microspheres PLGA המכיל מטען רצוי באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרי. בעוד הטכניקה המתוארת משתמשת גורם הגדילה רקמת החיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF) כדוגמה, מגוון רחב של COI יכול לשמש בקלות. בנוסף, שיטה זו מנצלת 96-גם צלחות כדי למזער את כמות ריאגנטים צורך להעריך התפשטות β-cell. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות כדי להשתמש בביו-חומרים אלטרנטיביים אופייני תא אנדוקריניות אחרות כגון הישרדות תא ומצב בידול.

איור 1 הוא ייצוג חזותי של microspheres שנוצר באמצעות פרוטוקול לעיל. הפרוטוקול המתואר כאן תשואות microspheres הטעון rhCTGF בגדלים שונים. השבר הגדול של microspheres יהיה בין 1 ל -10 מיקרומטר קוטר, אם כי microspheres מסוים עשוי להיות גדול יותר (איור 2). אם ירצה, גודל microsphere יכול להיות מכוון אופטימיזציה על בסיס פרמטרי ייצור כגון מהירות המגון וזמן, ריכוז פעיל שטח בשימוש, ואמצעי אחסון יחסי של כל שלב...

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה ליצירה וניהול של מיקרוספירות פולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) טעונות עניין לאיי עכבר שלמים בתרבית עם ניתוח אימונופלואורסצנטי לאחר מכן של התפשטות β תאים. שיטה זו מתאימה לקביעת היעילות של מיטוגנים β תאים מועמדים.

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוספירות של Poly(lactic-co-glycolic Acid) או PLGA, כדי להעביר תרכובות רצויות לאיי לבלב שלמים בתרבית, במטרה לבחון את ההשפעות של תרכובות בודדות על שגשוג של תאי בטא בבקרסלבלב של מבוגרים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון מגוון תרכובות המועברות באופן מקומי ובשחרור מושהה לאיי לבלב שלמים. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שניתן להתאימה בקלות לחומרי ביו-מסירה חלופיים, לתרכובות רצויות שונות ולבדיקות סוף (endpoint assays) שונות.לשיטה זו יש גם פוטנציאל להחדרה של תרכובות רצויות בשילוב עם ההשתלה המקובלת של איים לבלב in vivo. טיילור קבנאו, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, תדגים כיצד להכין את המיקרוספירות מ-PLGA. התחילו בהוספת מיליגרם אחד של התרכובת הרצויה המסומנת פלואורסצנטית ל-100 microliters של מים דה-יוניים כדי ליצור את הפאזה המימית הראשונה.לאחר מכן, המיסו 65 milligrams של PLGA ב-750 microliters של dichloromethane בתוך מבחנת סינצילציה (scintillation vial), ובצעו סוניקציה (ultrasonicate) לתערובת למשך 10 עד 30 שניות בהספק של 160 watts כדי להמיס את ה-PLGA לחלוטין. פעולה זו יוצרת את הפאזה השמנית. הוסיפו את כל הפאזה המימית הראשונה לפאזה השמנית באופן טיפואי.לאחר מכן, השתמש בהומוגניзатор ידני כדי להמריץ את התמיסה ב-20,000 rpm למשך 30 שניות, ליצירת פאזת מים-שמן ראשונה. לאחר מכן, הוסף את כל פאזת המים-שמן הראשונה בטיפות ל-15 milliliters של תמיסת 1% PVA והמרץ כפי שהודגם זה עתה. בשלב הבא, העבר את כל נפח האמולסיה לבקבוק בעל תחתית עגולה בנפח של 200 milliliters והשתמש במאדה סיבובי כדי להסיר את הממס לצורך יצירת הפאזה המימית בואקום של 635 millimeters of mercury למשך שעה אחת.העבירו מנה של מיליליטר אחד מהפאזה המימית לכל אחד מ-14 מבחנות מיקרוצנטריפוגה, ושקיעו את המיקרוספירות באמצעות צנטריפוגציה. עם סיום הסבוב, השתמשו במיקרופיפטה כדי להסיר 900 מיקרוליטר מהתמיסה המימית מכל מבחנה, תוך הקפדה לא להפריע למשקעים. שטפו את המיקרוספירות במיליליטר אחד של מים דה-יוניים, ולאחר מכן הסירו בזהירות 900 מיקרוליטר מהנוזל העליון.לאחר מכן, הוסיפו 900 microliters של מים דה-יוניים ל-100 microliters שנותרו מהעל-נוזלים. לאחר מכן, בצעו ערבוב קצר במערבל Vortex וסוניקציה כדי לתלה מחדש את המשקעים. לאחר בידוד האיים מבעלי החיים הניסיוניים הרלוונטיים, זרעו 40 איים שתואמו ויזואלית בגודלם לתוך באער אחת של פלטת תרבית רקמה בעלת 96 באערים, ב-200 microliters של מצע גידול לאיים.בבוקר למחרת, השביה מחדש מנה אחת של מיקרוספירות במדיום טרום-בדיקה, כך שהריכוז הסופי של התרכובת המבוקשת במבחנה יהיה 10 nanograms per microliter, ובצע סוניקציה למיקרוספירות באמבט מי קרח למשך 10 דקות בהספק של 160 watts עם פולסים באורך של 10 שניות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר בזהירות 100 microliters של מדיום תרבית איים מכל באר מבלי להזיז את האיים, והדגר את התרביות עם 100 microliters של מדיום בדיקה המכיל את המיקרוספירות. לאחר שלושה ימים, השלך בזהירות את מדיום הבדיקה מכל הבארות מבלי להפריע לאיים, ושטוף בעדינות את האיים ב-200 microliters של PBS פעמיים.איזלינס נצמדים באופן חלש בלבד לפלטת 96 בארות. לכן, קריטי להסיר בעדינות את המצע ואת ה-PBS מכל בארה, כדי שהאיזלינס לא יסורו בטעות וייזרקו. לאחר השטיפה השנייה, טבול בעדינות את האיזלינס ב-100 µL של תמיסת trypsin EDTA למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, תוך ביצוע פיפטינג עדין לאחר שתי דקות.העבירו את כל הנפח מכל באר לשפופרות מיקרוצנטריפוגה נפרדות והוסיפו 400 µL של מצע גידול לאיילטורים לכל שפופרה כדי להפסיק את הדיסוציאציה. לאחר איסוף האיילטורים שעברו טיפול במיקרוספירות על ידי צנטריפוגה, השתמשו במיקרופיפט כדי להסיר בעדינות את העל-משקעים והשביו את המשקעים ב-200 µL של מצע גידול רענן לאיילטורים. לאחר מכן, סובבו את האיילטורים המפוצלים על גבי שקופיות מיקרוסקופ טעונות באמצעות ציטוסנטריפוגה.לאחר ייבוש באוויר, סמנו מסביב לאייlets מסגרת באמצעות טוש סימון הידרופובי וקבעו את התאים ב-75 µL של פאראפורמאלדהיד בריכוז 4% בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחריהם שני שטיפות עם 75 µL של PBS. לאחר השטיפה השנייה, בצעו פרמיאביליזציה לתאים עם 75 µL של 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות, ולאחריהם שטיפה סופית עם 75 µL של PBS בלבד. כדי לבצע סימון אימונולוגי לאייlets, התחילו בהנחת השקופיות כאשר צד התאים פונה כלפי מעלה בתא לחות, והסירו את ה-PBS.לאחר מכן, חסמו את הכשירה הבלתי ספציפית באמצעות 75 µL של סרום חמור נורמלי בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, החליפו את הסרום ב-75 µL של הנוגדן הראשוני הרלוונטי למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, שאבו בזהירות את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטפו את הדגימות באמצעות שטיפות של 375 µL PBS.לאחר מכן, דגרו את האיים עם 75 µL של הנוגדן המשני המתאים המסומן באימונופלואורסצנציה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, תחת הגנה מאור. בסיום הדגירה, החליפו את תמיסת הנוגדן המשני ב-75 µL של Dappy למשך שלוש דקות, ולאחר מכן שטפו במים דה-יוניים למשך חמש דקות. בסיום השטיפה, טפטפו טיפה של 100 µL של תמיסת קיבוע מהירה-ייבוש המכילה רכיב anti-fade על זכוכית כיסוי, והניחו על תמיסת הקיבוע שקופית מיקרוסקופ אחת הפוכה, כאשר צד הדגימה פונה כלפי מטה.החלק הגדול ביותר של המיקרוספירות יהיה בקוטר של 1-10 מיקרון, אם כי חלק מהמיקרוספירות עשויות להיות גדולות יותר. בעקבות פיזור איים מטופלים במיקרוספירות PLGA שלמות וסימון אימונוהיסטוכימי עוקב, נפוץ להבחין באזורים בדגימה נטולי סימון בין התאים, הנגרמים על ידי מיקרוספירות שלמות שלא הוסרו לחלוטין במהלך שלבי השטיפה. לאחר הדימוי, ניתן לכמת את אחוז התאים החיוביים ל-Ki67 ואינסולין באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, או על ידי ספירה ידנית של המספר הכולל של התאים המסומנים.טיפול באילי אינסולין שלמים במיקרוספירות PLGA המכילות גורם גדילה של רקמה חיבורית אנושי רקומביננטי למשך שלושה ימים, כפי שהודגם זה עתה, מוביל להגברה של פרוליפרציה של תאי בטא, מה שמוכיח כי החלבון אינו מאבד מפונקציונליות שלו במהלך יצירת המיקרוספירות. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן להגיע לתוצאות תוך פחות משבוע אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ההשפעה על פרוליפרציית תאי בטא בניסוי שלכם תשתנה בהתאם לתרכובת הנחקרת ולקניטיקה המדויקת של השחרור מהמיקרוספירות שנוצרו.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון השתלה משולבת של מיקרוספירות טעונות תרכובת יחד עם איים לבלביים שלמים, כדי לבחון שאלות אחרות, כגון האם התרכובת הנבדקת יכולה להשריות פרוליפרציה של תאי בטא in vivo. ל-PLGA היסטוריה של שימוש במכשירים ובמערכות להולכת תרופות שאושרו על ידי ה-FDA, ולכן הוא מהווה בחירה טובה עבור חוקרים וקלינאיים השואפים להוביל מטען טיפולי לרקמות מוגדרות לאורך תקופה ממושכת. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ייצור מיקרוספירות PLGA טעונות תרכובת והחדרתן לאיים שלמים בתרבית.זכרו כי עבודה עם פאראפורמאלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

פרוטוקול זה מדגים בידוד איים Murine וזרע על פיגום decellularized. איים נתמך פיגומים הושתלו לתוך כרית שומן האפידידימלי של streptozotocin (STZ), המושרה עכברים סוכרתית. איים שרדו באתר ההשתלות והפכו את מצב ההיפרגליקמיה.

פיגום נתמך השתלת איים בשומן השומן האפידידימלי של עכברים סוכרתית

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

שיטה השתלת עם פגיעה של איים ב עכבר הוא הציג. איים מבודדים מעורבבים עם הידרוג, התערובת ימוקם לתיק עם פגיעה של עכבר סוכרתית. לאחר מכן, הסוכר מנוטר, מבוצע ניתוח חיסונית-פתולוגיה.

שיטת השתלת איון כדי Omentum העכבר

השתלת הלבלב איון היא דרך להשיג normoglycemia על סוכרת מסוג 1. מאמר זה מתמקד בטכניקה השתלת מהנתיב intraportal כדי לשמור על רמות גלוקוז נורמלי בעכברים סוכרתיים.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאימות ויוו של טיפול מבוסס הידרוג תא, שממחישים את הדוגמה של השתלת איון. h-עם פגיעה איון מטריקס ממלאת השרשה (ביות) מאפשר השתלה של תערובת תא-הידרוג בין השכבות עם פגיעה, ליד כלי הדם, כדי למקסם את engraftment בסביבה מטבולי תקין.

השתלת איון עם פגיעה אינטרה באמצעות h-עם פגיעה מטריקס איון מילוי (יונת)

בפרוטוקול זה, שיטה של מורטין איון בידוד והשתלת לתוך רקמת השומן הלבן התת עורית מתוארת. האיים המבודדים של מורנה ממורג מושתלים לתוך המטופל מורין באמצעות קרום מרתף הידרוג'ל. רמת הגלוקוז בדם של המטופלים מנוטרים, ו ניתוח היסטולוגיה של שתלי איון מבוצע.

השתלת מודל שומן לבן תת-עורית (ISWAT) מדגם ההשתלה של איויין מורנה

כאן אנו מציגים הליכים כירורגיים מעודנים על ביצוע מוצלח של השתלת איים תוך-ספורטיביים, הליך כירורגי רלוונטי מבחינה קלינית אך מאתגר מבחינה טכנית, בעכברים.

מזעור דימום וריד פורטל לאחר עירוי במהלך השתלת איים תוך-הפטיים בעכברים

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

למדו שיטה לשחרור מתמשך של תרכובות לאיים לבלב עכברים שלמים באמצעות מיקרוספירות PLGA. השיטה מאפשרת חקר השפעת תרכובות שונות על התרבות תאי בטא בוגרים ומספקת כלי רב-תכליתי למחקר סוכרת.

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact

גלה סרטונים נוספים