מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוספירות של Poly(lactic-co-glycolic Acid) או PLGA, כדי להעביר תרכובות רצויות לאיי לבלב שלמים בתרבית, במטרה לבחון את ההשפעות של תרכובות בודדות על שגשוג של תאי בטא בבקרסלבלב של מבוגרים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון מגוון תרכובות המועברות באופן מקומי ובשחרור מושהה לאיי לבלב שלמים. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שניתן להתאימה בקלות לחומרי ביו-מסירה חלופיים, לתרכובות רצויות שונות ולבדיקות סוף (endpoint assays) שונות.

לשיטה זו יש גם פוטנציאל להחדרה של תרכובות רצויות בשילוב עם ההשתלה המקובלת של איים לבלב in vivo. טיילור קבנאו, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, תדגים כיצד להכין את המיקרוספירות מ-PLGA. התחילו בהוספת מיליגרם אחד של התרכובת הרצויה המסומנת פלואורסצנטית ל-100 microliters של מים דה-יוניים כדי ליצור את הפאזה המימית הראשונה.

לאחר מכן, המיסו 65 milligrams של PLGA ב-750 microliters של dichloromethane בתוך מבחנת סינצילציה (scintillation vial), ובצעו סוניקציה (ultrasonicate) לתערובת למשך 10 עד 30 שניות בהספק של 160 watts כדי להמיס את ה-PLGA לחלוטין. פעולה זו יוצרת את הפאזה השמנית. הוסיפו את כל הפאזה המימית הראשונה לפאזה השמנית באופן טיפואי.

לאחר מכן, השתמש בהומוגניзатор ידני כדי להמריץ את התמיסה ב-20,000 rpm למשך 30 שניות, ליצירת פאזת מים-שמן ראשונה. לאחר מכן, הוסף את כל פאזת המים-שמן הראשונה בטיפות ל-15 milliliters של תמיסת 1% PVA והמרץ כפי שהודגם זה עתה. בשלב הבא, העבר את כל נפח האמולסיה לבקבוק בעל תחתית עגולה בנפח של 200 milliliters והשתמש במאדה סיבובי כדי להסיר את הממס לצורך יצירת הפאזה המימית בואקום של 635 millimeters of mercury למשך שעה אחת.

העבירו מנה של מיליליטר אחד מהפאזה המימית לכל אחד מ-14 מבחנות מיקרוצנטריפוגה, ושקיעו את המיקרוספירות באמצעות צנטריפוגציה. עם סיום הסבוב, השתמשו במיקרופיפטה כדי להסיר 900 מיקרוליטר מהתמיסה המימית מכל מבחנה, תוך הקפדה לא להפריע למשקעים. שטפו את המיקרוספירות במיליליטר אחד של מים דה-יוניים, ולאחר מכן הסירו בזהירות 900 מיקרוליטר מהנוזל העליון.

לאחר מכן, הוסיפו 900 microliters של מים דה-יוניים ל-100 microliters שנותרו מהעל-נוזלים. לאחר מכן, בצעו ערבוב קצר במערבל Vortex וסוניקציה כדי לתלה מחדש את המשקעים. לאחר בידוד האיים מבעלי החיים הניסיוניים הרלוונטיים, זרעו 40 איים שתואמו ויזואלית בגודלם לתוך באער אחת של פלטת תרבית רקמה בעלת 96 באערים, ב-200 microliters של מצע גידול לאיים.

בבוקר למחרת, השביה מחדש מנה אחת של מיקרוספירות במדיום טרום-בדיקה, כך שהריכוז הסופי של התרכובת המבוקשת במבחנה יהיה 10 nanograms per microliter, ובצע סוניקציה למיקרוספירות באמבט מי קרח למשך 10 דקות בהספק של 160 watts עם פולסים באורך של 10 שניות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר בזהירות 100 microliters של מדיום תרבית איים מכל באר מבלי להזיז את האיים, והדגר את התרביות עם 100 microliters של מדיום בדיקה המכיל את המיקרוספירות. לאחר שלושה ימים, השלך בזהירות את מדיום הבדיקה מכל הבארות מבלי להפריע לאיים, ושטוף בעדינות את האיים ב-200 microliters של PBS פעמיים.

איזלינס נצמדים באופן חלש בלבד לפלטת 96 בארות. לכן, קריטי להסיר בעדינות את המצע ואת ה-PBS מכל בארה, כדי שהאיזלינס לא יסורו בטעות וייזרקו. לאחר השטיפה השנייה, טבול בעדינות את האיזלינס ב-100 µL של תמיסת trypsin EDTA למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, תוך ביצוע פיפטינג עדין לאחר שתי דקות.

העבירו את כל הנפח מכל באר לשפופרות מיקרוצנטריפוגה נפרדות והוסיפו 400 µL של מצע גידול לאיילטורים לכל שפופרה כדי להפסיק את הדיסוציאציה. לאחר איסוף האיילטורים שעברו טיפול במיקרוספירות על ידי צנטריפוגה, השתמשו במיקרופיפט כדי להסיר בעדינות את העל-משקעים והשביו את המשקעים ב-200 µL של מצע גידול רענן לאיילטורים. לאחר מכן, סובבו את האיילטורים המפוצלים על גבי שקופיות מיקרוסקופ טעונות באמצעות ציטוסנטריפוגה.

לאחר ייבוש באוויר, סמנו מסביב לאייlets מסגרת באמצעות טוש סימון הידרופובי וקבעו את התאים ב-75 µL של פאראפורמאלדהיד בריכוז 4% בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחריהם שני שטיפות עם 75 µL של PBS. לאחר השטיפה השנייה, בצעו פרמיאביליזציה לתאים עם 75 µL של 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות, ולאחריהם שטיפה סופית עם 75 µL של PBS בלבד. כדי לבצע סימון אימונולוגי לאייlets, התחילו בהנחת השקופיות כאשר צד התאים פונה כלפי מעלה בתא לחות, והסירו את ה-PBS.

לאחר מכן, חסמו את הכשירה הבלתי ספציפית באמצעות 75 µL של סרום חמור נורמלי בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, החליפו את הסרום ב-75 µL של הנוגדן הראשוני הרלוונטי למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, שאבו בזהירות את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטפו את הדגימות באמצעות שטיפות של 375 µL PBS.

לאחר מכן, דגרו את האיים עם 75 µL של הנוגדן המשני המתאים המסומן באימונופלואורסצנציה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, תחת הגנה מאור. בסיום הדגירה, החליפו את תמיסת הנוגדן המשני ב-75 µL של Dappy למשך שלוש דקות, ולאחר מכן שטפו במים דה-יוניים למשך חמש דקות. בסיום השטיפה, טפטפו טיפה של 100 µL של תמיסת קיבוע מהירה-ייבוש המכילה רכיב anti-fade על זכוכית כיסוי, והניחו על תמיסת הקיבוע שקופית מיקרוסקופ אחת הפוכה, כאשר צד הדגימה פונה כלפי מטה.

החלק הגדול ביותר של המיקרוספירות יהיה בקוטר של 1-10 מיקרון, אם כי חלק מהמיקרוספירות עשויות להיות גדולות יותר. בעקבות פיזור איים מטופלים במיקרוספירות PLGA שלמות וסימון אימונוהיסטוכימי עוקב, נפוץ להבחין באזורים בדגימה נטולי סימון בין התאים, הנגרמים על ידי מיקרוספירות שלמות שלא הוסרו לחלוטין במהלך שלבי השטיפה. לאחר הדימוי, ניתן לכמת את אחוז התאים החיוביים ל-Ki67 ואינסולין באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, או על ידי ספירה ידנית של המספר הכולל של התאים המסומנים.

טיפול באילי אינסולין שלמים במיקרוספירות PLGA המכילות גורם גדילה של רקמה חיבורית אנושי רקומביננטי למשך שלושה ימים, כפי שהודגם זה עתה, מוביל להגברה של פרוליפרציה של תאי בטא, מה שמוכיח כי החלבון אינו מאבד מפונקציונליות שלו במהלך יצירת המיקרוספירות. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן להגיע לתוצאות תוך פחות משבוע אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ההשפעה על פרוליפרציית תאי בטא בניסוי שלכם תשתנה בהתאם לתרכובת הנחקרת ולקניטיקה המדויקת של השחרור מהמיקרוספירות שנוצרו.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון השתלה משולבת של מיקרוספירות טעונות תרכובת יחד עם איים לבלביים שלמים, כדי לבחון שאלות אחרות, כגון האם התרכובת הנבדקת יכולה להשריות פרוליפרציה של תאי בטא in vivo. ל-PLGA היסטוריה של שימוש במכשירים ובמערכות להולכת תרופות שאושרו על ידי ה-FDA, ולכן הוא מהווה בחירה טובה עבור חוקרים וקלינאיים השואפים להוביל מטען טיפולי לרקמות מוגדרות לאורך תקופה ממושכת. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ייצור מיקרוספירות PLGA טעונות תרכובת והחדרתן לאיים שלמים בתרבית.

זכרו כי עבודה עם פאראפורמאלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.