Name: הסרה של תסיסנית רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: למדו שיטה להסרת רקמת שריר מזחלי פירות מעופפים לשיפור הדמיית חלבונים עצביים ואפידרמיים באמצעות אימונופלואורסצנציה. טכניקה זו משפרת את יחס האות לרעש ומאפשרת שימוש במיקרוסקופיית על-רזולוציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים גארי לאייבסקי לדיונים מועילים על מיקרוסקופיה. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקים R01GM061107 ו R01GM067758 כדי ERG

הערה: ההליך להסרת שריר (איור 1) הוא שינוי של שיטות שתוארו קודם לכן להכנת פילת זחל. השלבים שקודמים אחרי הסרת שריר מתוארים בקצרה ואת הקורא נקרא בעבודה קודמת 10, 11 לתיאורים מפורטים יותר. 1. לנתח זחל מלוח קר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין דילול עובד של מלוחים HL3.1 הקרים 15 או Ca הקר 2 + ללא HL3.1 מלוח 11 (טבלה 1). מניחים את הזחל בצלחת אלסטומר סיליקון עם מי מלח קר מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של המנה. הערה: ראה דיון לגבי הבחירה מלוחה. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 מלוח (pH 7.2) </td></tr><tr><td> 5 HEPES מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 70 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr&gt; <td> 5 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ CaCl 2 (להשמיט עבור Ca 2+ מלוחים -חינם) </td></tr><tr><td> 4 מ&quot;מ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 5 trehalose מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 115 סוכרוז mM </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> הערה: מחק רכב חרקי hemolymph </td></tr></tbody></table> רכב טבלת 1. קרה מלוחה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הזחל עם למעלה בצד הגחון. המשטח הגחון של הזחל יכול להיות מזוהה על ידי חגורות dentical הבטן בצד הגבי על ידי צינורות לקנה הנשימה הזחל העיקרי פועל מן הקדמי אל האחורי. מתחו את הזחל בכיוון הקדמי, האחורי ולהצמיד את הראש והזנב עלאלסטומר סיליקון לנתח צלחת באמצעות סיכות חרקים. השתמש במספריים לנתח בסדר לחתוך לאורך קו האמצע הגחון, החל בקצה אחד מתקדם לעבר הקצה השני. הערה: כיוון זה משמר את האשכול הגבה למד הנפוצה של דה נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזחל הוא חתך פתוח, להצמיד מארבע כנפות כדי בצלחת לנתח כאילו לפתוח ספר. שימוש במלקחיים כדי לתפוס ולהסיר איברים פנימיים כולל מערכת העצבים המרכזית, המעיים, ואת קנה הנשימה. התאם סיכות חרקים כך הפילה מתוחה אבל לא נמתח מקסימאלי. הערה: שרירים מעוגנים אל קיר הגוף בגבולות מגזריים. למרות שרירים המכסים את רוב קיר הגוף, הם נעדרים אזור צר ליד קו האמצע הגבה. </li></ol> הסרת שרירים 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את קו האמצע הגבי של הזחל, שבו רקמת שריר תיאור. יישור שיניים מלקחיים אחת כזאת שזה יכול להיות מוכנס מתחת רקמת שריר בכיוון השטוח ביותר האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחיל בקו אמצע הגב, ליד הגבול הקדמי של המגזר, החלק בזהירות את שן המלקחיים בין השרירים האפידרמיס, מקפיד לצמצם מגע בין המלקחיים האפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המלקחיים כלפי מעלה כדי לשבור את החיבור של השריר אל קיר הגוף בשלב עוגן אחד. חזור על תהליך זה עבור חמי קטע הנותרים (ים) של עניין. הערה: פרוטוקול זה מייעל שימור האחורי של כל שדה דנדריט נוירון דה. כדי לשמר את החלק הקדמי של השדה דנדריט, עדיף להכניס את שן מלקחיים בקצה האחורי של כל פלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים מחדש סיכות חרקים כך פילת הזחל נמתחה מקסימלי לכל הכיוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הפילה בזמן שהוא עדיין מוצמד אל הצלחת לנתח באמצעות פורמלדהיד 4% קרים, מוכן טרי PBS במשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להתרחק רקמות שריר בזהירות מנקודות העוגן הנותרים, מקפיד למזער contact עם האפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטול הצמדה ולהסיר את פילה מצלחת לנתח לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. בצע את כל הכביסה הבאה, חסימה, והצעדים המכתימים immunofluorescence, כפי שתואר לעיל 11. </li></ol> 3. רכב את פילת הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להסיר את הראש והזנב באמצעות מספריים לנתח גלם על מנת להפוך את המדגם שטוח ככל האפשר. הר פילה על coverslip ב antifade mountant עם המשטח הפנימי של פילה מול coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית מיקרוסקופ על coverslip ולחץ בעדינות כדי לפזר את ההרכבה בינונית. תהפכו את השקופית מיקרוסקופ שוב לאטום את coverslip בשקופית באמצעות לק. ניתן לאחסן שקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות. </li></ol>

<ol><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li>
<li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111(2011).</li>
<li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC%2C+NANCHUNG%2C+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הנה פרוטוקול מתואר על הסרה ידנית של רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה משנה תאר טכניקות לנתיחת זחל בעבר 10,11. לאחר הזחל גזור בצלחת אלסטומר סיליקון, קו אמצע הגב ממוקם. ראש חץ מלקחיים יחיד, באורינטציה האפשרית השטוח שלה, מוכנס בזהירות בין רקמת השריר ואת האפידרמיס, ליד קו האמצע הגבה. המלקחיים בעדינות נמשכים כלפי מעלה כדי רקמת שריר נפרדת מן נקודת עוגן אחד בכל מגזר זחל של עניין. פילה הזחל הוא קבוע אז בפורמלין קר שלאחריו מלקחיים המשמשים שוב למשוך את השריר מנק...

נוירונים arborization הדנדריטים זחל תסיסנית (da) לספק מודל ערך ללימוד פיתוח עצבי בשל amenability שלהם מניפולציה גנטית ואת הקלות שבה הם יכולים להיות צלמו. עצב סנסורי אלה כבר סייע בזיהוי מסלולים רבים השולטים דנדריט morphogenesis 1-3. ארבע כיתות של דה נוירונים (אני בכיתה - IV) המעצבבים האפידרמיס הזחל. נוירונים אלה שיוותרו בין קרום במרתף ואת האפידרמיס, עם הדנדריטים שלהם ויוצרים מערכים דו מימדי בעיקר 4,5. של ארבע כיתות, נוירונים דה IV סוג יש סוכות מסועפת מאוד ביותר, כמו עצב סנסורי של בעלי חיים אחרים, פירוט של סוכות אלה מחייב גורמים פנימיים כמו גם רמזים מרקמות שכנות, במיוחד האפידרמיס, להתפתחותם 6-9 . מחקרים כדי לקבוע כיצד כגון עצבי עובדה נוספת עצביתORS לשלוט תועלת המורפוגנזה דנדריט מהיכולת לזהות ביטוי חלבון באתרו על ידי immunofluorescence. לציפורן החיצוני של הזחל הוא בלתי חדיר נוגדנים, אבל מניעה זו היא להתגבר בקלות על ידי הכנת פילת זחל באמצעות שיטות לנתיחה ומבוססות 10,11. עם זאת, רקמת השריר בגוף הקיר שנמצאה רק פנים אל הקרום במרתף מציגה מספר אתגרים כלפי להדמיה של נוירונים דה ותאי אפידרמיס. ראשית, רקמת השריר, אשר הקווים ביותר של קיר הגוף, מטשטשים אותות ניאון מאוד שמקורם ברקמה עצבית או אפידרמיס. זה מפחית באופן משמעותי את יחס האות לרעש במדגם. שנית, חלבונים רלוונטיים רבים עשויים לבוא לידי ביטוי ברקמת השריר כמו גם בתאי העצב או האפידרמיס. אותות קרינת נגזרות שריר זה עשוי זיהוי מעורפל נוסף של אות קרינה מן הנוירון או האפידרמיס. לבסוף, ההתקדמות בטכנולוגיות מיקרוסקופיה לאהדמית יתר w של דגימות ברזולוצית המשנה דיפרקציה וכן עשויה להיות מועילה במיוחד הבחנת הלוקליזציה של חלבונים אשר מתבטאים בנוירונים והסביבה תא אפידרמיס 12,13. עם זאת, הדמיה באמצעות הטבות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה מ איתות חזקה יחס רעש בסמיכות של המדגם כדי coverslip. בנוסף הפחתת יחס האות לרעש, מרחקי שריר קיר גוף הזחל דה נוירונים מן coverslip, וכך להגביל את רזולוציית תמונה המשופרת שניתן להשיג עם שיטות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה. מלבד אתגרים לניתוח immunofluorescence, רקמת שריר מציגה מחסום הקלטת אלקטרו מן עצב סנסורי בקיר גוף הזחל. הסרתו ולכן הטבות מניפולציה הנוירופיזיולוגיים של עצב סנסורי 14. הנה שיטה להסרה ידנית של רקמת שריר זחל תסיסנית מתוארת. אנו מראים כי p הפרוטוקול שלנוהדמיה immunofluorescence ermits של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר את יחס אות לרעש להדמיה של נוירונים דה IV בכיתה, ומאפשר את השימוש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה להפלות יחסים מרחבית טובה יותר של חלבונים ומבנים הסלולר דה נוירונים האפידרמיס.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 פינצטה</td><td>אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו, 8 ס"מ, ישרים, 5 מ"מ, קצות 0.1 מ"מ</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>לניתוח צלחות</td></tr><tr><td>סיכות חרקים אוסטרליץ, 0.1 מ"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fostec 8375 מקור אור</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade הרכבה בינונית</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>למיקרוסקופיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>למיקרוסקופיה תאורה מובנית</td></tr><tr><td>מיקרו כיסוי זכוכית, 22 x 22 מ"מ, מס' 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט פלוס, 25 x 75 x 1.0 מ"מ</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נוגדנים נגד קורקל</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>C615.16</td><td>supernatant, מדלל 1:50</td></tr><tr><td>עכבר נגד דיסקים נוגדנים גדולים</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>4F3</td><td>supernatant, מדלל 1:50</td></tr><tr><td>ארנב נוגדן נגד dsRed</td><td>Clontech</td><td></td><td>632496 לדלל 1:1,000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד ארנב עזים, Alexa Fluor 568 מצומד</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific A-11011</td><td>לדלל 1:1,000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכברים עזים, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>מדלל 1:500</td></tr></tbody></table>

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

נוירונים arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (דה) הם מודל פופולרי על חקירת מנגנוני המורפוגנזה העצבית. נוירונים דה להתפתח תקשורת עם תאי אפידרמיס הם מעצבבים ובכך יתרונות הניתוח שלהם להדמיה באתרו של שני החלבונים הביעו neuronally ו epidermally ידי immunofluorescence. שיטות מסורתיות של הכנת פילת זחל לניסויי immunofluorescence להשאיר על כנו את רקמת השריר שמכסה את רוב קיר הגוף, הצגת מספר אתגרי הדמית חלבונים עצביים ו אפידרמיס. כאן אנו מתארים שיטה להסרת רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר יחס אות לרעש, ומקל על שימוש במיקרוסקופ ברזולוצית סופר ללמוד דה פיתוח נוירון.

אנו להדגים את התועלת של הליך ההסרה שריר לשיפור יחס אות לרעש בניסויים immunofluorescence לשתף לדמיין חלבונים צומת septate Coracle (קורה) ו דיסקים-גדול (DLG) יחד עם נוירונים דה IV בכיתה שכותרתו עם סמן קרום CD4- tdTomato. קורה כבר השתמשו בעבר כדי לזהות שטחים שבהם דה דנדריטים נוירון מוקפים על ידי תאי אפידרמיס והוא אחד הגורמים אפידרמיס רבים זיהו כי נחקרו בשיתוף עם morphogenesis ותפקוד ...

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להסיר רקמת שריר מזחלי דרוזופילה כהכנה לאנליזה של אימונופלואורסצנציה של עץ דנדריטים זחלי (da neurons) ושל רקמה אפידרמלית. היום, נדגים שיטה המשפרת את הוויזואליזציה של גורמים נוירונליים וחוץ-נוירונליים המעורבים במורפוגנזה של דנדריטים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת דימוי אימונופלואורסצנציה של חלבונים אשר אחרת היו מוסתרים על ידי רקמת השריר, משפרת את יחס הסיגנל לרעש, ומאפשרת שימוש במיקרוסקופיית רזולוציה-על (super resolution microscopy).ראשית, הוסיפו כמות מספקת של סליין קר לכלי העשוי אלסטומר סיליקון כך שפני השטח של התחתית יכוסה. העבירו את הזחל הנבדק אל הכלי והניחו אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו, תוך הבטחה למיקום תאורה נכון.מקמו את הלרבה כך שהצד הגחוני (ventral) פונה מעלה, אותו ניתן לזהות לפי חגורות הדנטיקל (denticle belts) של הבטן. מתחו את הלרבה בכיוון קדמי-אחורי, ובעזרת סיכות לחרקים, הצמידו את הראש והזנב לתחתית הצלחת. בעזרת מספרי ניתוח עדינים, גזרו לאורך קו האמצע הגחוני של הלרבה מקצה אחד לשני.פתחו את הזחל ונעצו את רקמת הקוטיקולה בארבע הפינות כך שתשכב בצורה שטוחה. בעזרת פינצטה, הסירו את האיברים הפנימיים, כולל ה-CNS, המעי והטרכיאה. כווננו את סיכות החרקים כך שהפרוסה תהיה מתוחה אך לא מתוחה עד לקצה.אתר את קו האמצע הגבי של הזחל, שבו רקמת השריר אינה קיימת, ול

removal-drosophila-muscle-tissue-from-larval-fillets-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מדגים כיצד...

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

סרטון זה מתאר כיצד להכין פילה זחל המשמש להדמיה של נוירונים דנדריטיים חושיים (DA) ותאי האפידרמיס הקשורים אליהם. הפרוטוקול המוצג מראה בפירוט כיצד להסיר רקמת שריר מדופן הגוף תוך שמירה על המורפולוגיה של התאים, מה שמשפר את ההדבקה החיסונית וההדמיה של תאי העצב ותאי האפידרמיס המוסתרים אחרת.

הכנת פילה זחל: שיטה לדמיין נוירונים חושיים שלמים ותאי אפידרמיס הקשורים

שרירי התעופה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי התעופה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לניתוח שרירי טיסה עקיפים מתפתחים המתאימים לריצוף RNA מגלמים.

דרוזופילה דיסקציה מאוחרת של שריר התעופה העקיפה של הגלמים (IFM): שיטה לאיסוף רקמות בתפוקה גבוהה

בסרטון זה, סיבי עצב של זחלי דרוזופילה שקועים בצבע FM, אשר נקשר לשומנים בקרום התא. מיקרואלקטרודת יניקה ופולסים חשמליים מעוררים את תהליך האנדוציטוזה, ומשלבים את צבע FM בשלפוחיות אנדוציטיות שזה עתה נוצרו. שיטה זו, אשר מדמיינת שלבים presynaptic של neurotransmission, שימושי לחקר תפקוד סינפטי ושחרור נוירוטרנסמיטר.

העמסה ופריקה של צבע FM בתיווך מיקרואלקטרודה בתאי עצב של זחלי דרוזופילה

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר רגולציה משלימה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכניאולוגיה. אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי ליצור דגימות מועשר מאוד אידיאלי עבור פרוטאומוניקס וברצף עמוק. דגימות אלה יכולות להציע תובנות מכניסטיות חשובות להיבטים מגוונים של פיתוח שרירים.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

למדו שיטה להסרת רקמת שריר מזחלי פירות מעופפים לשיפור הדמיית חלבונים עצביים ואפידרמיים באמצעות אימונופלואורסצנציה. טכניקה זו משפרת את יחס האות לרעש ומאפשרת שימוש במיקרוסקופיית על-רזולוציה.

הסרה של

גלה סרטונים נוספים