שיטה למדידת RNA N 6 שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות
5 בדצמבר 2016
שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.
המטרה הכוללת של טכניקת הכתמים הצפונית המותאמת היא למדוד שינויים ב-N6-methyladenosine, n6A ב-RNA ולזהות שינויים ב-RNA מגוונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתפקיד האפיגנטיקה של RNA כגון שינויים ב-N6-methyladenosine. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הפרדה יעילה של RNA, סטנדרטיזציה טובה יותר לעיצובים ניסיוניים ותיחום ברור של שינוי n6A ב-RNAs.
שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים ב-n6A ב-RNA וניתן ליישם אותה גם על שינויים אחרים ב-RNA עם נוגדנים שונים לזיהוי. כדי להתחיל בניסוי, יש לרסס תמיסת טיהור ריבונוקלאז על מגבות נייר ולנגב את הפיפטות ומשטחי ספסל המעבדה. הרטיבו את מגבות הנייר במים נטולי נוקלאז ונגבו שוב את הפיפטות ומשטחי ספסל המעבדה.
השג תמיסת בידוד RNA שנשמרה בארבע מעלות צלזיוס והוסף מיליליטר אחד של התמיסה לכ-75 מיליגרם של רקמת עכבר. השתמש במערבל תקורה כדי להומוגניזציה של הרקמה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 1-Bromo-3-chloropropane או BCP לכל מיליליטר אחד של דגימה הומוגנית.
לנער את הצינורות במרץ למשך 15 שניות ולהמשיך לבידוד RNA מוחלט. בעזרת ספקטרופוטומטר, קבע את ריכוז ה-RNA על ידי ציון הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר. בדוק את איכות דגימת ה-RNA על ידי ביצוע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 0.8%.
שטפו את כל ציוד האלקטרופורזה במי דיאתילפירוקרבונט או DEPC. שלב 2.5 גרם אגרוז, ואז 215 מיליליטר מי DEPC בבקבוק ארלנמאייר וממיס לחלוטין את התערובת במיקרוגל. לאחר שהתמיסה נמסה, הוסף 12.5 מיליליטר של מאגר 10X MOPS.
ו -22.5 מיליליטר של 37% פורמלדהיד לבקבוק. לאחר מכן שפכו את התמיסה למנגנון האלקטרופורזה בעזרת מסרק בעובי 1.5 מילימטר. בעזרת מסרק נקי דוחפים בועות לשולי הג'ל.
הניחו לג'ל להתמצק בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במאגר ריצה 1X MOPS שהוכן בעבר כדי לשטוף את בארות הג'ל ולהפעיל מראש את הג'ל. טען את דגימות ה- RNA לבארות הג'ל, ולאחר מכן הפעל את הג'ל.
למחרת, בדקו וצלמו את הג'ל תחת אור UV. להכנת ההעברה, חותכים את הג'ל ומסירים את החלק שאינו בשימוש. הכן 500 מיליליטר של נתרן ציטראט 10X מלח או מאגר SSC.
שטפו את הג'ל פעמיים עם מאגר SSC 10X. חותכים דף נייר סינון אחד גדול מספיק כדי לכסות את הג'ל. חותכים ארבע פיסות נייר סינון לגודל זהה לג'ל.
לאחר מכן, חותכים גיליון אחד של קרום ניילון טעון חיובית לגודל זהה לג'ל. סמן חריץ על הג'ל, ועל הממברנה, כסמן כדי להבטיח את הכיוון הנכון. משרים את הממברנה במאגר SSC 2X.
יוצקים 500 מיליליטר של מאגר SSC 10X למגש ההעברה. הנח את גיליון נייר הסינון הגדול על פני לוחית הזכוכית והרטיב את נייר הסינון עם מאגר העברה. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לגלגל בועות.
השרו שתי חתיכות נייר סינון חתוך מראש במאגר ההעברה והניחו אותן במרכז נייר המסנן. הסר בועות. לאחר מכן הניחו את הצד העליון של הג'ל כלפי מטה על נייר הסינון והניחו את הממברנה על גבי הג'ל, והקפידו ליישר את חריצי הג'ל והקרום.
לאחר מכן, הניחו שתי חתיכות נייר פילטר חתוך מראש על גבי הממברנה. הסר את כל הבועות בין השכבות. מרחו ניילון נצמד סביב הג'ל כדי להבטיח שהמגבות יספגו רק את המאגר העובר דרך הג'ל והממברנה.
לאחר מכן ערמו מגבות נייר על גבי נייר המסנן. הניחו צלחת זכוכית גדולה על גבי המגבות והניחו משקולת על גבי הערימה ואפשרו ל-RNA לעבור מהג'ל לקרום למשך הלילה. לאחר ההעברה, שמור את הממברנה דamp במאגר SSC 2X.
טבלו שני גיליונות נייר סינון עם מאגר SSC 10X, ולאחר מכן הנח את הגיליונות לתוך מקשר צולב UV. ודא שהצד הנספג ב-RNA פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן הנח את הממברנה על גבי נייר המסנן. בחר במצב קישור צולב אוטומטי ולחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל את ההקרנה.
בדוק את הממברנה והג'ל עם לוכד תמונות ג'ל UV כדי לאשר את העברת ה-RNA מהג'ל לממברנה. חסום את הממברנה בחלב דל שומן של 5% במאגר TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה. דגרו את הממברנה למשך הלילה בתמיסת נוגדנים m6A בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם מאגר TBST למשך 15 דקות. לאחר מכן, דגרו את הממברנה בתמיסת נוגדנים נגד ארנב חמור מצומד HRP למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם מאגר TBST למשך 15 דקות.
החל את המצע הכימילומינסנציה המשופר. צלם את הכימילומינסנציה עם הדמיה דיגיטלית. לבסוף, עברו לכימות m6A ומדדו את העוצמה הכימית היחסית של m6A באמצעות תמונה J.Mouse RNA של כבד נדגמו במרווחי זמן של ארבע שעות ונחקרו בטכניקת הכתמים הצפונית שונה.
המתילציה של rRNAs, mRNAs ו-RNA קטנים זוהתה בבירור. כתמי m6A מייצגים בוצעו עבור RNA כולל וללא rRNA מהכבד של עכברים מסוג בר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום אפיגנטיקת הרנ"א לחקור השפעות על הפיזיולוגיה האנושית הקשורות לשעון הביולוגי והשמנת יתר.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה שונה של נורת'רן בלוטינג (northern blotting) למדידת מודיפיקציות של N6-methyladenosine (m6A) ב-RNA. הטכניקה מאפשרת זיהוי של מודיפיקציות בדגימות RNA מגוונות וניתנת ליישום תחת תכנונים ניסיוניים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אפיגנטיקה של RNA
- מודיפיקציות m6A
- טכניקות ניסוייות
רקע
- N6-methyladenosine הוא מודיפיקציה משמעותית של RNA.
- הבנת מודיפיקציות של RNA היא קריטית להשגת תובנות לגבי ויסות גנים.
- השיטות הנוכחיות לזיהוי m6A הן מוגבלות.
- טכניקה משופרת זו שואפת לשפר את הזיהוי והניתוח.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לזיהוי מודיפיקציות m6A ב-RNA.
- שיפור ההבנה של אפיגנטיקה של RNA.
- אספקת גישה סטנדרטית למגוון תכנונים ניסיוניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד RNA מרקמת עכבר.
- אלקטרופורזה להערכת איכות ה-RNA.
- העברה של RNA לממברנת ניילון.
- זיהוי באמצעות נוגדנים ל-m6A וכימילומינצנציה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של מודיפיקציות m6A ב-rRNAs, mRNAs ו-small RNAs.
- הגדרה ברורה של מודיפיקציות m6A במגוון דגימות RNA.
- ניתן לבצע את הטכניקה ביעילות בתוך ארבעה ימים.
מסקנות
- טכניקת ה-northern blotting המשופרת יעילה לחקר מודיפיקציות של RNA.
- שיטה זו פותחת אפיקים למחקר באפיגנטיקה של RNA.
- יישומים פוטנציאליים כוללים מחקרים על מקצבים צירקדיים והשמנה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה מדויקת של מודיפיקציות N6-methyladenosine (m6A) ב-RNA תומכת בתיקוף מטרות באפיגנטיקה של RNA על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של בקרה אפי-טרנסקריפטומית. שיטה זו מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים מכניסטיים הקושרים בין m6A לתהליכים פיזיולוגיים כגון מקצבים צירקדיים ומטבוליזם. היא מספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להפחתת סיכונים בהיפותזות טיפוליות בביולוגיה של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של יציבות RNA, תרגום וספלייסינג התלויים ב-m6A, כדי להבהיר את התפקידים התפקודיים של רגולטורים אפיגנטיים ברשתות ביטוי גנים.
- ערך תפעולי: מספק הבחנה ברורה של m6A על פני סוגי RNA שונים, ובכך תומך בזיהוי מטרות רלוונטיות כסמנים ביולוגיים במודלים של מחלות.
- ערך ניבוי: מקל על ניתוח מנה-תגובה וניתוח של מהלך הזמן של רמות m6A, ובכך משפר את רמת הביטחון במעורבות המטרה ובמודולציה של המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות כימילומינסיביות כמותיות התואמות לדימות ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסויים שונים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של העברת RNA וזיהויו באמצעות ממבנה ניילון ובדיקה מבוססת נוגדנים, ובכך מפחית את השונות בפרופיל המודיפיקציות.
- מוכנות הבדיקה: מאפשר השוואה מקבילה בין בקרים של RNA שעבר מודיפיקציה לבין RNA שלא עבר מודיפיקציה, ובכך תומך בתיקוף הבדיקה עבור קמפיינים של סריקת אפיגנטיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין דינמיקת m6A ב-RNA של הכבד לבין פנוטיפים מטבוליים וצירקדיים, ובכך תומך בחקירת ביומרקרים תרגומיים במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר דגימה לאורכית (למשל, במרווחים של ארבע שעות) כדי ללכוד דפוסי מודיפיקציה זמניים הרלוונטיים למקצבים פיזיולוגיים.
- צמצום סיכונים: מפחית עמימות במדידות של מודיפיקציות RNA, ובכך משפר את השחזוריות בתהליכי תיקוף של מטרות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף שבין ביולוגיה גילויית לזיהוי מטרות (lead identification), בכך שהיא מספקת תיקוף של השכבה האפיגנטית המשלימה את הפרופיילינג התעתוקי והפרוטאומי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי כותבים (writers), מוחקים (erasers) וקוראים (readers) של m6A באמצעות מדידה ישירה של סטטוס המודיפיקציה ב-RNA.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים להערכת השפעות של תרכובות על סימנים אפי-טרנסקריפטומיים במערכות מבוססות תאים או מערכות נגזרות מרקמות.
- אנליטיקה: מאפשר כימות מבוסס-תמונה של עוצמת אות ה-m6A, מה שמקל על השוואה סטטיסטית בין קבוצות טיפול או רקעים גנטיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויים אפיגנטיים ב-RNA לבין תוצאות פיזיולוגיות, ותומך בהתקדמות פרה-קלינית המותאמת לסמנים ביולוגיים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לסוגי RNA שונים ולנוגדנים ספציפיים למודיפיקציות, מה שמאפשר שימוש חוזר במגוון מטרות אפיגנטיות ובתחומי מחלה שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות אפיגנטיות של RNA באמצעות זיהוי ישיר וספציפי למודיפיקציה.
- ערך תפעולי: זרימת עבודה סטנדרטית עם שלבי העברה, חסימה וזיהוי מוגדרים המבטיחים שחזוריות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי הבהרת הרלוונטיות התפקודית של m6A במסלולים הרלוונטיים למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות אפיגנטיות מותאם-סיכון על בסיס דינמיקת מודיפיקציה מדידה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ב-RNA, באלקטרופורזה ובטכניקות של אימונובלוטינג (immunoblotting).
- המכשור כולל UV crosslinker, מדמיימם דיגיטלי וספקטרופוטומטר לכימות RNA.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת שימוש עקבי בתמיסות שעובדו ב-DEPC ותנאי העברה מבוקרים.
- התאמה לשינויים (modifications) אחרים ב-RNA תלויה בזמינותם של נוגדנים ספציפיים המזהים את השינוי.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכון לפירוק (degradation) של ה-RNA והצורך באופטימיזציה של תנאי האינקובציה והשטיפה של הנוגדנים.
