Name: שיטה למדידת RNA N 6 שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למד שיטת northern blotting משופצת לזיהוי שינויים של N6-methyladenosine ב-RNA מתאי עכבר. טכניקה זו מאפשרת הפרדה יעילה של RNA ותקינה ניסיונית משופרת לחקר אפיגנטיקה של RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.Y.W. קיבל תמיכה מהמכון הלאומי לחקר הבריאות (NHRI-EX101-9925SC), המועצה הלאומית למדע (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) ובית החולים צ'אנג גונג ממוריאל (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 ו-CMRPG3C1763).

הערה: רנ&quot;א הכל מ 6 רמה כוללת rRNA, mRNA, ו RNA קטנים אחרים. מאז RNA ריבוזומלי יש מ שופע 6 שינויים A, מדידת מ 6 הבגרויות תצטרך לשקול את העובדה הזו. בידוד RNA 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון טיהור ribonuclease (מרוסס על מגבות נייר), לנגב את טפטפות ומשטחי ספסל מעבדה. מגבות נייר רטובות עם מי nuclease ללא ולנגב טפטפות ומשטחי ספסל במעבדה שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד RNA סה&quot;כ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בוחש עילי, homogenize 50-100 מ&quot;ג של רקמה או 5-10 x 10 6 תאים 1 מ&quot;ל של תמיסת בידוד RNA שמרו על 4 מעלות צלזיוס. הערה: רקמה יותר (100-150 מ&quot;ג) עשויה להידרש דגימות רקמה שומניות מעכברים בגלל ריכוזי RNA הנמוכים בו. דוגמאות שמקורו מן הלב העכבר, כבד, שרירי השלד, ריאות, מוח, מקרופאגים הועסק 4 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בcubate homogenates מדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של 1-bromo-3-chloropropane (BCP) לכל 1 מ&quot;ל של homogenate המדגם. לנער את צינורות בתוקף למשך 15 שניות ולהמשיך לבודד רנ&quot;א הכל על פי הוראות היצרן 24. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Polyadenylated mRNA טיהור מ- RNA סה&quot;כ מבודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר mRNA polyadenylated באמצעות ערכות או פרוטוקולים זמינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער היטב מחדש להשעות כל אחד מהפתרונות הבאים: פתרון מחייב 2x, אוליגו חרוזי פוליסטירן (DT), והפתרון לשטוף. ודא אוליגו (DT) חרוזים חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 120 μL של פתרון elution לכל הכנה לתוך צינור וחום עד 70 ° C בתוך גוש חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עד 500 מיקרוגרם של רנ&quot;א הכל לתוך צינור microcentrifuge. עם nuclease ללא מים, להתאים את עוצמת הקול כדי 250 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL של פתרון מחייב 2x אל רנ&quot;א הכל כךlution מערבולת בקצרה לערבב את תוכנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו 15 μL של אוליגו (DT) חרוז מערבולת ביסודיות לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם מגוש החימום ולתת לו לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant, משאיר מאחוריו כ 50 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של פתרון לשטוף מחדש להשעות את הגלולה ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה לתוך מערכת צינור ספין מסנן / אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. הסר את עמודת צינור איסוף וזורק את הזרימה דרך. החזר את עמודת צינור האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 500 μL של פתרון לשטוף על מסנן הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את מסנן הספין לתוך צינור איסוף טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μL של פתרון elution מחומםעד 70 ° C על גבי במרכז מסנן הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2-5 דק &#39;ב 70 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נוסף 50 μL של פתרון elution מחומם ל -70 מעלות צלזיוס על גבי במרכז מסנן הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גליקוגן, 0.1 נפח של 3 M חיץ נתרן אצטט (5.2 pH), ו 2.5 כרכים של אתנול אבסולוטי. משקע הלילה ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 25 דקות ב 4 °. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ&quot;ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש באוויר במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של מי nuclease ללא לפזר את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכשרת RNA וכימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ספקטרופוטומטר, לקבוע את ריכוז RNA על ידי NotIng את הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר. יחס 260/280 צריך להיות 1.8-2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות המדגם RNA באמצעות 0.8% ג&#39;ל agarose אלקטרופורזה 25. הערה: רנ&quot;א הכל ללא פגע איקריוטיים צריך להראות 28S אינטנסיבי 18S rRNA להקות. יחס 28S לעומת עוצמת להקת 18S rRNA עבור הכנת RNA טובה הוא ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. ג&#39;ל אלקטרופורזה והסעה הערה: הפרוטוקולים כן חיץ ניתנים בטבלת 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ג&#39;ל פורמלדהיד (1%) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל הציוד אלקטרופורזה עם diethylpyrocarbonate (DEPC) מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.5 גרם של agarose ב 215 מ&quot;ל מים DEPC לחלוטין במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12.5 מ&quot;ל של 10x 3- (N- morpholino) חומצה propanesulfonic (מגבים) חיץ 22.5 מ&quot;ל של פורמלדהיד 37%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתבנית המנגנון אלקטרופורזה עם מסרק סמיך 1.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל בועות או לדחוף tשולי עד הקצוות הג&#39;ל במסרק נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הג&#39;ל לחזק בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1-10 מיקרוגרם של RNA סך 11.3 μL של חיץ מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 מיקרוגרם של הסמן RNA (1 מיקרוגרם / μL) עם 11.3 μL של חיץ מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים nuclease ללא דגימות 2.2.1 ו 2.2.2 כדי בהיקף כולל של 16 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לצנן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 16 μL של המדגם מ 2.2.3 עם 4 μL של צבע מעקב, המכיל 0.1 מיקרוגרם / μL ethidium ברומיד על הקרח. זהירות: ברומיד Ethidium הוא אולי טרטוגניות ורעילים אם נשאף. קרא גליון בטיחות ברומיד ethidium. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מ&quot;ל של 10x מגבים חיץ ל -1,800 מ&quot;ל של DDH 2 O לבצע למאגר פועל מגבים 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש למאגר פועל מגבי 1x לשטוף את הבארות של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> t טרום ריצההוא הג&#39;ל על 20 V למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את דגימות רנ&quot;א לתוך הבארות של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור. הפעלה ב 35 V עבור כ -17 שעות (לילה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ולצלם את הג&#39;ל תחת אור UV. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַעֲבִיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את ג&#39;ל להסרת החלק בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל של 10x חיץ SSC (250 מ&quot;ל של חיץ 20x SSC ו 250 מ&quot;ל מים DEPC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל פעמיים עם חיץ 10x SSC במשך 20 דקות עם רועד ב 50 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי 1 נייר סינון גיליון גדול מספיק כדי לשמש נייר פתילה, אשר סופג חיץ העברה ממגש ההעברה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 4 חתיכות של נייר סינון לאותו גודל כמו ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 1 גיליון קרום ניילון חיובי טעונים לאותו גודל כמו ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן חריץ על הג&#39;ל ואת הקרום כסמן כדי להבטיח את הכיוון הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הממברנה חיץ 2x SSC במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 500 מ&quot;ל of 10x SSC חיץ למגש ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את גיליון נייר סינון גדול על פני הצלחת זכוכית להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרדד כל בועות עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרי 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך חיץ העברה ומניח אותם על המרכז של נייר הסינון משלב 2.4.5. הסר את כל בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדף בצד ג&#39;ל למטה על נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרום על גבי הג&#39;ל. ישר את החריצים של הג&#39;ל ואת הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך על גבי הממברנה ואת להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל בועות בין השכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בניילון סביב הג&#39;ל על מנת להבטיח כי רק מגבה לספוג חיץ עובר דרך ג&#39;ל הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטאק את מגבות נייר על גבי נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צלחת זכוכית גדולה על גבי המגבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים משקל על החלק העליון של הערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">שמור לילה לאפשר RNA להעביר מן הג&#39;ל על הממברנה. </li></ol></li></ol> 3. איתור של N 6 -methyladenosine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממברנה Crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קרום לחת חיץ 2x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 גיליונות נייר מסנן שקוע עם 10x חיץ SSC לתוך crosslinker UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום על גבי נייר הסינון, כשהצד RNA-adsorbed פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מצב autocrosslink&quot; (120,000 μJ) ולחץ על כפתור &quot;התחל&quot; כדי להתחיל את ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הממברנה ואת ג&#39;ל עם לוכד תמונה ג&#39;ל UV כדי לאשר את העברת RNA מן הג&#39;ל על הממברנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה ב 5% חלב דל שומן מלוחים טריס שנאגרו עם 20 Tween (TBST) חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה לילה מ 6 (&lt;em&gt; N 6 פתרון נוגדנים -methyladenosine) (1: 1,000 ב 5% דל שומן חיץ חלב TBST) ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה ב HRP-מצומדות חמור פתרון נוגדנים נגד ארנב (1: חיץ 2,000 5% דל שומן חלב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את המצע chemiluminescent משופרת (0.125 מ&quot;ל לס&quot;מ 2 של קרום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את chemiluminescence עם ההגדרות האופטימליות של תרמי הדיגיטלי, על פי הוראות יצרן 26. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ 6 כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את עוצמת chemiluminescent היחסית מ 6 באמצעות תוכנת ImageJ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט התוכנה ImageJ, בחר באפשרות &quot;קובץ&quot; כדי לפתוח את הקובץ הרלוונטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;מלבן&quot; מ ImageJ ולצייר על ידי מסגרת סביבאת האותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RNA ריבוזומלי הוא לא המוקד של ניסויים, להימנע להקות ריבוזומלי 18S ו -28 RNA מ 6 לחישוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;פיקוד&quot; ו &quot;1&quot; כדי לאשר את השביל שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;פיקוד&quot; ו &quot;3&quot; כדי להראות את העלילה שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי &quot;ישר&quot; לצייר קווים כדי להפריד את האזור המפולח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי &quot;שרביט&quot; כדי לרשום את המידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את רמות א מ 6 עם להקת RNA ריבוזומלי 18S מן המכתים ברומיד ethidium. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Thammana, P., Held, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+16S+RNA+during+ribosome+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro.</a> Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).</li>
<li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+epitranscriptome%3A+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyl-adenosine+%28m6A%29+in+RNA%3A+an+old+modification+with+a+novel+epigenetic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+in+adipose+tissue+decreases+Angptl4+translation+and+alters+triglyceride+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism.</a> Sci Signal. 8 (407), 127(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-adenosine+methylation+in+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N6-adenosine methylation in MiRNAs.</a> PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+N6-methyladenosine+in+bacterial+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Fustin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-methylation-dependent+RNA+processing+controls+the+speed+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock.</a> Cell. 155 (4), 793-806 (2013).</li>
<li>Geula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+m6A+mRNA+methylation+facilitates+resolution+of+naive+pluripotency+toward+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. , SREP18874 (2016).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).</li>
<li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+study+of+the+m6A+genes+with+major+depressive+disorder+in+Chinese+Han+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population.</a> J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+RNA+N6-methyladenosine+and+the+role+of+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+circadian+rhythms+and+inhibits+the+CLOCK-BMAL1-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription.</a> Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).</li>
<li>Heyn, H., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adenine+Code+for+DNA%3A+A+Second+Life+for+N6-Methyladenine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine.</a> Cell. 161 (4), 710-713 (2015).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+m%286%29A+Reader+YTHDC1+Regulates+mRNA+Splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.</a> Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+N6-methyladenosine+residues+in+bovine+prolactin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).</li>
<li>Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N6-methyladenosine+in+expression+of+Rous+sarcoma+virus+RNA%3A+analyses+utilizing+immunoglobulin+specific+for+N6-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucleic+Acid+Res+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine.</a> Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).</li>
<li>Golovina, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+site-specific+detection+of+m6A+nucleoside+presence+in+RNA+based+on+high-resolution+melting+%28HRM%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Methylated+Cytidine+and+Adenosine+in+Cellular+and+Tissue+RNA+by+Nano-Flow+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+the+Stable+Isotope-Dilution+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method.</a> Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. 6, 18874(2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome.</a> Nat Chem Biol. , (2016).</li>
<li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

לשינויים ב-RNA יש תפקידים חשובים בתפקוד התא ובפיזיולוגיה. ההבנה הנוכחית של הוויסות, התפקוד וההומאוסטזיס של שינויים אלה עדיין נחקרת ומורחבת8. לכן, יש צורך בשיטה מדויקת וסטנדרטית להערכת השינויים ב-RNA. שיטת הכתמים הצפונית המתוקנת מספקת כימות מדויק של שינויים ב-RNA ותיחום ברור של השינויים ב-RNA מגוונים. למרות שהשיטה דורשת לפחות 3 ימים, ניתן לתקנן אותה ולהשתמש בה בעיצובים ניסיוניים שונים. יתר על כן, עם נוגדנים שונים, הוא יכול לזהות שינויים שונים ב-RNA27.
חשוב להפריד בין RNA שונים בעת ניתוח שינויים ב-RNA. RNA ריבוזומלי מהווה חלק גדול מהכמות הכוללת של RNA28,29. התוצאות מניתוח שינויים ב-RNA רק ב-RNA הכולל ייצגו בעיקר את השינויים ב-rRNA. מתילציה ושינויים אחרים כאלה של rRNA יכולים להסוות את השינויים ב-RNA אחרים. באמצעות הליך הפרדת ג'ל, ניתן לנתח בצורה מדויקת יותר את השינויים של mRNA ו- RNA קטנים אחרים.
מיפוי רחב טרנסקריפטום עם m6A אימונו-משקעים וריצוף מספק תובנה מפורטת לגבי השינוי של כל סוג של RNA22. הוא מספק מידע על ה-RNA הספציפיים ורזולוציה של כ-80-120 bp. למרות ש-m6A-Seq יכול להשוות את השינויים בין תנאי ניסוי שונים, בחירת הסטנדרטים והבקרות המתאימים לניסויים כאלה היא קשה18. קשה לשחזר משקעים חיסוניים, ולעתים קרובות נותנים וריאציות משמעותיות בין חזרות. יתר על כן, m6A-Seq דורש פיצול של דגימות RNA לפני משקעים חיסוניים וריצוף30. תהליך הפיצול עלול לגרום להשפעות מיותרות על שינויי ה-RNA המקוריים. אם הניסוי אינו זקוק למידע של הגן הספציפי אך דורש תנאים שונים להשוואה, השיטה הנוכחית מספקת הדמיה ובקרה טובים יותר עבור מערכי ניסוי מגוונים. 
שינוי RNA הוא צעד חשוב בוויסות בקרת שעתוק31. עם זאת, ההומאוסטזיס ומנגנוני הוויסות של שינויים שונים ב-RNA בתחומים פיזיולוגיים מגוונים עדיין אינם ברורים. באמצעות שיטת הכתם הצפוני השונה הנוכחית, ניתן לכמת ולהשוות שינויים שונים ב-RNA. יתר על כן, ניתן לחקור את השינויים והתקנות של שינויים ב-RNA בפירוט רב יותר. בעתיד, ניתן יהיה גם לשלב את הנתונים הניסויים הן מפרוטוקולי הכתם הצפוני הקלאסי והן מפרוטוקולי הכתם הצפוני המותאמים, ולספק תובנות טובות יותר על הביולוגיה של RNA.
הגורם החשוב ביותר הקובע את הצלחת פרוטוקול הכתם הצפוני המותאם הוא שלמות דגימת ה-RNA. RNAs עם כמות מסוימת של פירוק עשויים להניב תוצאות טובות של כתמים צפוניים קלאסיים, אך יכולה להיות לכך השפעה משמעותית על תוצאות הכתם הצפוני המותאם. השינויים ב-RNA ברקמות או בקווי תאים שונים יכולים גם הם להשתנות באופן משמעותי. חשוב לבדוק את עומסי דגימות ה-RNA המתאימים לרקמות שונות לפני ביצוע הניסויים הסופיים.
מכיוון שהליכי הכתמים נקראו באופן מסורתי על שם ד"ר סאות'רן וכיוונים גיאוגרפיים שונים, אנו מציעים את השם "כתמים צפון-מזרחיים" לטכניקה הנוכחית.

לשינויים דינמיים והפיכים ב-RNA יש תפקידים חשובים בהומאוסטזיס RNA. לפני ארבעה עשורים, שינויים ב-N 6-methyladenosine (m6A) נמצאו בשפע בטרנסקריפטומים אוקריוטיים1. יש להם פונקציות מגוונות ב-RNA שליח (mRNA), RNA ריבוזומלי (rRNA), RNA גרעיני קטן, RNA העברה ומיקרו-RNA2. השינויים ב-m6A של mRNA משפיעים על שחבור3, תרגום4, השפלה5 ולוקליזציה2. יתר על כן, הם משפיעים על ביוגנזה של ריבוזום ותפקוד מיקרו-RNA6. השימור האבולוציוני של m6A שינויים של RNA מצוין בחיידקים חד-תאיים לבני אדם רב-תאיים7. תיחום התפקידים של שינויים ב-m6A נמצא כעת במחקר נרחב. המאמצים צפויים לספק תובנות חדשות לגבי בקרת תמלול. מחקרים אחרונים מגלים כי שינויים כימיים אחרים של mRNA8 ממלאים גם הם תפקידים קריטיים בחילוף החומרים של RNA. 
מקצבים צירקדיים9, פלוריפוטנטיות של תאי גזע10, מטבוליזם של טריגליצרידים4, פיברוזיס11, השמנת יתר12 ודיכאון מג'ורי13 הם כמה דוגמאות לתהליכים שבהם ידוע ששינויים ב-m6A שולטים בתוצאות. לתעתיקים רבים של גנים של שעון ביולוגי יש m6A אתרים14. אפנון של m6A מתילאז או דמתילאז מעורר שינויים בתקופה הצירקדית15. Mettl3, m6A transferase, הוא מווסת לפלוריפוטנטיות של תאי גזע. מחסור ב-Mettl3 מוביל לקטלניות עוברית מוקדמת ולהתחלת שושלת חריגה בשלב10 שלאחר ההשתלה. מחסור במסת שומן והשמנת יתר (FTO), m6A demethylase, באדיפוציטים משפיע על גיוס חומצות שומן ומשקל גוף באמצעות ויסות פוסט-שעתוק של Angptl44. מחקרים אלה מגלים כי m6A לא רק שולט בעיבוד mRNA, אלא גם ממלא תפקידים קריטיים בהתפתחות האמבריולוגית ובפתו-פיזיולוגיה. לפונקציה של שינויים ב-m6A יש השלכות על שיקולים טיפוליים בעתיד.
קיימות מספר שיטות למדידת שינויים ב-m6A של RNA16-18. באופן מסורתי, כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) משמשות לחקר ההתפלגות של m6A במספר RNAs19,20. ספקטרומטריית מסה היא כלי רגיש לזיהוי שינויים ב-m6A ב-RNA. עם זאת, יש לכרות את ה-RNA על ידי RNase למקטעים קצרים לפני הניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה21. משקעים חיסוניים וריצוף של מתיל-RNA (m6A-Seq)22 משקעים חיסוניים עם RNA מקוטע עם נוגדנים ספציפיים ל-m6A ומבצע ריצוף RNA מקביל. שיטה זו יוצרת נופים ברוחב טרנסקריפטום m6A. מיפוי ברזולוציה גבוהה של m6A קישור צולב ומשקעים חיסוניים ברזולוציה של נוקלאוטידים בודדים (miCLIP) ממפה עוד יותר שינויים ב-m6A ברזולוציה של נוקלאוטיד יחיד23. שתי השיטות מספקות פרטים על שינוי m6A על פני כל הטרנסקריפטום, עם מידע על גנים ספציפיים. עם זאת, כימות וסטנדרטיזציה בשתי השיטות קשים אם ניסויים דורשים השוואה של מספר תנאים. יתר על כן, פיצולים של RNA עבור m6A-Seq משנים את מבנה ה-RNA המקורי, מה שעשוי להשפיע על רמות m6A מקוריות. כדי לזהות שינויים גלובליים של m6A ב-RNA והשינויים שלהם בתנאי ניסוי שונים, אנו מדווחים על שיטה המשתמשת בפרוטוקול כתמים צפוני שונה. שיטה זו פותרת RNA לפי משקל מולקולרי, באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל18. הליך זה מספק סטנדרטיזציה וכימות טובים יותר עבור ניסויים הכוללים מספר תנאים או דגימות. הוא גם מספק מידע ספציפי על שינוי m6A עבור RNAs שונים, בין אם rRNA, mRNA או microRNA.

<table><tbody><tr><td>פתרון RNaseZap</td><td>אמביון</td><td>AM9782</td><td>פרוטוקול 1.1</td></tr><tr><td>פתרון ריאגנט TRI</td><td>אמביון</td><td>AM9738</td><td>פרוטוקול 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-chloropropane (BCP)</td> <td>פרוטוקול סיגמא</td><td>B9673</td><td>1.2.1.3</td></tr><tr><td>פרוטוקול אתנול</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>1.2.1.3</td></tr><tr><td>פרוטוקול איזופרופנול</td><td>סיגמא</td><td>I9516</td><td>1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>פרוטוקול 1.2.2.1</td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>אמביון</td><td>AM9510</td><td>פרוטוקול 1.2.2.2</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>פרוטוקול 1.2.2.2.2 פרוטוקול</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>אמביון</td><td>AM9930</td><td>1.2.2.6</td></tr><tr><td>פרוטוקול DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td>פרוטוקול <td>A426</td><td>2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>פרוטוקול 2.1.3</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 37%</td><td>סיגמא</td><td>F8775</td><td>פרוטוקול 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, מלח דיסודיום</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>פרוטוקול 2.1.3 10x MOPS מאגר</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא</td><td>F7503</td><td>פרוטוקול 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA סמן מילניום</td><td>אמביון</td><td>AM7150</td><td>פרוטוקול 2.2.2</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>אמרסקו</td><td>X328</td><td>פרוטוקול 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>פרוטוקול 2.2.5 צבע מעקב</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא</td><td>114391</td><td>פרוטוקול 2.2.5 צבע מעקב</td></tr><tr><td>קסילן ציאנול FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>פרוטוקול 2.2.5 צבע מעקב</td></tr><tr><td>נתרן כלורי דיהידרט</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>פרוטוקול 2.4.2 20x מאגר SSC</td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט</td><td>סיגמא</td><td>S1804</td><td>פרוטוקול 2.4.2 20x מאגר SSC</td></tr><tr><td>נייר ספיגה Hybond פרוטוקול</td> GE <td>Healthcare</td><td>RPN6101M</td><td>פרוטוקול 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ ממברנה</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td>פרוטוקול 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>פרוטוקול 3.1.2</td></tr><tr><td>לוכד ג'ל 1500</td><td>טכנולוגיית ANT</td><td>לוכד ג'ל 1500</td><td>פרוטוקול 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-methyladenosine)</td> <td>מערכות סינפטיות</td><td>202003</td><td>פרוטוקול 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, פרוטוקול AB</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td> מקושר HRP <td>3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>פרוטוקול 3.2.8</td></tr></tbody></table>

שיטה למדידת rna<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-Methyladenosine (m6A) שינויים של RNA מגוונים ונמצאים בכל מקום בקרב איקריוטים. הם מתרחשים ב-mRNA, rRNA, tRNA ומיקרו-RNA. מחקרים אחרונים גילו כי שינויים הפיכים אלה ב-RNA משפיעים על שחבור RNA, תרגום, פירוק ולוקליזציה. תהליכים פיזיולוגיים מרובים, כמו מקצבים צירקדיים, פלוריפוטנטיות של תאי גזע, פיברוזיס, מטבוליזם של טריגליצרידים והשמנת יתר נשלטים גם הם על ידי שינויים ב-m6A. משקעים חיסוניים/ריצוף, ספקטרומטריית מסה וכתם צפוני שונה הם חלק מהשיטות הנפוצות למדידת שינויים ב-m6A. כאן, אנו מציגים טכניקת כתמים צפון-מזרחית למדידת שינויים ב-m6A. הפרוטוקול הנוכחי מספק הפרדה בגודל טוב של RNA, התאמה וסטנדרטיזציה טובים יותר לעיצובים ניסיוניים שונים, ותיחום ברור של שינויים ב-m6A במקורות שונים של RNA. בעוד שידוע שלשינויים ב-m6A יש השפעה מכרעת על הפיזיולוגיה האנושית הקשורה למקצבים צירקדיים והשמנת יתר, תפקידיהם במצבים פיזיולוגיים (פתו) אחרים אינם ברורים. לכן, לחקירות על שינויים ב-m6A יש אפשרות עצומה לספק תובנות מפתח לפיזיולוגיה מולקולרית.

לאחר 14 ימים בשלב יממה רגיל-כהה אור, עכברי wild-type הונחו בחשכה מתמדת. RNAs מהכבד נדגמו ב 4 במרווחים hr ולמד עם סופג הצפוני שונה. מתילציה של rRNAs, mRNAs, ו RNA הקטן התגלתה בבירור (איור 2). ההשוואה בין זמני יממה שונים (CT) ניתן לחשב במדויק עם תקן 18S rRNA. הייתה תנודת יממה חזקה של רמות מ 6 ב rRNA, mRNA, ו RNA הקטן. כדי למנוע את ההפרעה שהוצעה על ידי rRNA, RNAs polyadenylated יכול להיות מטוהר, כמו בשלב 1.2.2. לאחר הטיהור, rRNA ניתן למנוע במידה רבה, כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של RNAs האחר (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; איור 1: רכבת יחידת העברת כתם. יחידת העברת נימים עבור סופג את הרנ&quot;א על ​​הקרום מוצגת. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> איור 2: קצב היממה של בחינות הבגרות מ 6 ב C57BL / 6J. נתון זה מראה את מ 6 כתם של RNA הכולל כבדים עכברי-בר הקריב ביום הראשון של השלב הכהה כהה לאחר 14 ימים של שלב אור כהה רגיל ב 4 במרווחי h. כימות נעשה באמצעות מ 6 הפרש צפיפות התמונה בין 18S ו -28 rRNA. מ &#39;6 שפע היה מנורמל הלהקה 18S rRNA מן הג&#39;ל פורמלדהיד בתחתית.et = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> איור 3: כתמי הקלע זרק 6 עם או בלי rRNA. כתמי נציג מ 6 א &#39;של רנ&quot;א הכל ו- RNA polyadenylated מן הכבדים של עכברי-בר מוצגים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> חיץ 10x מגבים (pH 7.0, להגן מפני אור) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מגבים </td><td> 41.85 </td><td> g </td><td> 0.2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> אצטט נתרן </td><td> 4.1 </td><td> g </td><td>0.05 מ &#39; </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, Disodium מלח </td><td> 3.7 </td><td> g </td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> סה&quot;כ </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מערבבים בטמפרטורת החדר </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x חיץ SSC (pH 7.0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> נתרן כלורי </td><td> 175.3 </td><td> g </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> ציטראט Trisodium </td><td> 88.3 </td><td> g </td><td> 0.3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> סה&quot;כ </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> מערבבים בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> דיי מעקב </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חיץ 10x מגבים </td><td> 500 </td><td> μL </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0.75 </td><td> g </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> bromophenol כחול </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> 0.2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> קסילן Cyanol </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> 0.2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> סה&quot;כ </td><td> 5 </td><td> מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חנות ב -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> לדלל יחס של 1: 1,000 של DEPC DDH 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מערבבים למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> חיץ מדגם (להגן מפני אור) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חיץ 10x מגבים </td><td> 200 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% פורמלדהיד </td><td> 270 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Formamide </td><td> 660 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חנות ב -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> טבלה 1: חוצצים ופתרונות.

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

המטרה הכוללת של טכניקת ה-northern blotting המשופרת היא למדוד מודיפיקציות של N6-methyladenosine, n6A ב-RNA ולזהות מודיפיקציות בסוגים שונים של RNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לתפקיד האפיגנטיקה של RNA, כגון מודיפיקציות N6-methyladenosine. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הפרדה יעילה של RNA, סטנדרטיזציה טובה יותר של מערכי ניסוי ואפיון ברור של מודיפיקציית n6A ב-RNAs.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מודיפיקציות n6A ב-RNA, וניתן להחיל אותה גם על מודיפיקציות RNA אחרות באמצעות נוגדנים גילוי שונים. כדי להתחיל את הניסוי, רססו תמיסת דה-קונטמינציה מריבונוקלאז על נייר סופג ונגבו את הפפיטות ואת משטחי ספסול המעבדה. הרטיבו את נייר הספיגה במים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) ונגבו שוב את הפפיטות ואת משטחי ספסול המעבדה.השג תמיסה לבידוד RNA השמורה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והוסף מיליליטר אחד של התמיסה לכ- 75 מיליגרם של רקמת עכבר. השתמש במערבל עילי (overhead stirrer) כדי להומוגניзировать את הרקמה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 1-Bromo-3-chloropropane או BCP לכל מיליליטר של הומוגנאט הדגימה.נערה את המבחנות בעוצמה במשך 15 שניות והמשיכו לבידוד RNA כולל. באמצעות ספקטרופוטומטר, קבעו את ריכוז ה-RNA על ידי מדידת הבליעה ב-260 ננומטר וב-280 ננומטר. בדקו את איכות דגימת ה-RNA באמצעות ביצוע אלקטרופורזה של ג'ל agarose בריכוז 0.8%.שטפו את כל ציוד האלקטרופורזה בדיאתילפירוקרבונט או במים שעובדו ב-DEPC. ערבבו 2.5 גרם של agarose, ולאחר מכן 215 מיליליטר של מים שעובדו ב-DEPC בתוך בקבוק ארלנמייר, והמיסו את התערובת לחלוטין במיקרוגל. לאחר שהתמיס הומס, הוסיפו 12.5 מיליליטר של 10X MOPS buffer.והוסיפו 22.5 milliliters של 37% formaldehyde לבקרה. לאחר מכן, שפכו את התמיסה למכשיר האלקטרופורזה עם מסרק בעובי 1.5 millimeter. בעזרת מסרק נקי, דחפו את הבועות לקצוות הג'ל.יש להמתין עד שהג'ל יתגבש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמשו בתמיסת ריצה 1X MOPS שהוכנה מראש כדי לשטוף את בארות הג'ל ולהפעיל ריצה מקדימה (pre-run) של הג'ל. טענו את דגימות ה-RNA לבבארות הג'ל, ולאחר מכן הריצו את הג'ל.ביום למחרת, יש לבחון ולצלם את הג'ל תחת תאור UV. כדי להכין את ההעברה, גזרו את הג'ל והסירו את החלק שאינו בשימוש. הכינו 500 milliliters של בופר 10X saline sodium citrate או SSC.שטפו את הג'ל פעמיים עם תמיסת 10X SSC. גזרו דף נייר סינן אחד שיהיה גדול מספיק כדי לכסות את הג'ל. גזרו ארבעה חתיכות של נייר סינן בגודל זהה לג'ל.בשלב הבא, גזרו דף אחד של ממבנה ניילון בעל מטען חיובי לממדים הזהים לאלו של הג'ל. סמנו חריץ על הג'ל ועל הממברנה, שישמש כסימן להבטחת אוריינטציה נכונה. השריו את הממברנה בבופר 2X SSC.שפכו 500 milliliters של תמיפת 10X SSC buffer לתוך מגש ההעברה. הניחו את גיליון נייר הסינון הגדול על גבי הפלטה מזכוכית והרטיבו את נייר הסינון בתמיפת העברה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להוציא בועות אוויר.השרו שתי פיסות של נייר סינון חתוך מראש בבופר העברה והניחו אותן במרכז נייר הסינון. הסירו בועות אוויר. לאחר מכן, הניחו את הג'ל כאשר הצד העליון פונה כלפי מטה על נייר הסינון, והניחו את הממברנה מעל הג'ל, תוך הקפדה על התאמה של החריצים בג'ל ובממברנה.לאחר מכן, הניחו שתי פיסות של נייר סינון חתומי מראש מעל לממברנה. הסירו בועות אוויר שנוצרו בין השכבות. עטפו את הג'ל בניילון נצמד כדי להבטיח שהניירות יספגו רק את הבופר העובר דרך הג'ל והממברנה.לאחר מכן, הניחו מגבונים ניירים מעל נייר המסנן. הניחו פלטה מזכוכית בגודל חורג מעל המגבונים, והניחו משקולת על גבי הערימה כדי לאפשר ל-RNA לעבור מהג'ל לממברנה במהלך הלילה. לאחר ההעברה, שמרו על הממברנה לחה בבופר 2X SSC.טבלו שני דפים של נייר סינן בבופר 10X SSC, ולאחר מכן הניחו את הדפים במכשיר ה-UV cross linker. ודאו שהצד שספג את ה-RNA פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן הניחו את הממברנה מעל נייר הסינן. בחרו במצב auto cross link ולחצו על כפתור ההפעלה (start) כדי להתחיל את ההקרנה.בדקו את הממברנה ואת הג'ל באמצעות סורק תמונות ג'ל UV כדי לאשר את מעבר ה-RNA מהג'ל לממברנה. חסמו את הממברנה ב-5% חלב רזה בבופר TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. דגרו את הממברנה למשך לילה בפתרון נוגדן m6A בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.ביום למחרת, שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם תמיסת TBST למשך 15 דקות. לאחר מכן, דגרו את הממברנה בתמיסת נוגדן Donkey anti-rabbit המשורר עם HRP למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם תמיסת TBST למשך 15 דקות.החילו את סובסטרט הכמילומנסנס המשופר.לכדו את הכמילומנסנס באמצעות מדמייר דיגיטלי. לבסוף, עברו לכימות m6A ומדדו את עוצמת הכמילומנסנס היחסית של m6A באמצעות image J. דגימות RNA מכבד עכבר נדגמו במרווחי זמן של ארבע שעות ונחקרו באמצעות טכניקת northern blotting משופרת.מתילציה של rRNAs, mRNAs ו-small RNAs זוהתה בבירור. ביצועו של m6A blots מייצג בוצע עבור RNA כולל וללא rRNA מכבדי עכברים מסוג wild type. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בארבעה ימים במידה והיא מבוצעת כראוי.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האפיגנטיקה של RNA לבחון השפעות על הפיזיולוגיה האנושית הקשורות למקצב circadian ולהשמנה.

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

מבחני האימונו-פסיכוטיציה של ה-RNA המתילציה הם שיטה מבוססת נוגדנים המשמשת להעשרה עבור שברי RNA מתילציה. יחד עם רצף עמוק, זה מוביל לזיהוי של תעתיקים הנושאים את שינוי m5C.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

שיטה מדויקת הניתנת לשחזור לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים מתוארת כאן. שיטה זו משתמשת ב- HPLC-MS/MS.

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ומדידה כמותית של ארגינין חופשי וקשור לחלבון ומתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית H-NMR 1.

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

שינויים לאחר שעתוק של רנ"א מייצגים שכבה לא מבוקרת של ויסות תרגום שנקשרה לאחרונה לפלסטיות של מערכת העצבים המרכזית. כאן, הכנת דגימות וגישת ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית-טנדם נוזלית מתוארת לאפיון סימולטני של שינויי RNA רבים בתאי עצב בודדים.

אפיון שינויי RNA בתאי עצב בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת רמות m⁶A גלובליות באופן חצי-כמותי באמצעות נקודת כתם נקודות. ה-RNA הכולל מופק, מנותק, מנוקד על ממברנת ניילון, נבדק בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצג באמצעות כימילומינסנציה. עוצמת האות, שנמדדה על ידי ניתוח גווני אפור של ImageJ, משקפת שפע מתילציה יחסי, ומספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור למחקר.

בדיקת נקודת כתם לזיהוי רמות שינוי RNA גלובליות של N 6-מתילאדנוזין

פרוטוקול זה מספק גישה מפורטת להערכת רמות שינוי m6A של RNA ספציפי באמצעות MeRIP-qPCR.

מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m6A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה

למד שיטת northern blotting משופצת לזיהוי שינויים של N6-methyladenosine ב-RNA מתאי עכבר. טכניקה זו מאפשרת הפרדה יעילה של RNA ותקינה ניסיונית משופרת לחקר אפיגנטיקה של RNA.

שיטה למדידת RNA

גלה סרטונים נוספים